Том 15, №3

ПЦР ‒ самый популярный метод амплификации нуклеиновых кислот, характеризующийся высокой специфичностью и чувствительностью и нашедший применение, как в научных исследованиях, так и на практике. Однако при ПЦР-амплификации нуклеотидных последовательностей, называемых «трудными» матрицами, могут быть получены ложно-негативные результаты, когда мишень в реакционной смеси присутствует, но не обнаруживается. К такому же результату могут приводить соединения-примеси, совместно экстрагируемые с нуклеиновыми кислотами и ингибирующие ДНК-полимеразу. Для устранения указанной проблемы в реакционную смесь вносят вещества, называемые ПЦР-энхансерами, способные стабилизировать работу ДНК-полимеразы и/или, напротив, дестабилизировать водородные связи в GC-богатых участках, что позволяет, в том числе вести амплификацию длинных матриц. Описано использование в качестве ПЦР-энхансеров белков, аминокислот, углеводов, многоатомных спиртов, амидов, сульфонов, сульфоксидов, неионных детергентов, цвиттерионных соединений, различных наночастиц, а также аналогов дГТФ и дЦТФ, образующих две водородные связи вместо трех при спаривании с комплементарными им азотистыми основаниями.

После секвенирования нами полного хлоропластного генома Triticum militinae Zhuk. et Migusch. и сравнительного анализа с таковыми других полиплоидных пшениц было обнаружено, что данный вид гораздо ближе к ряду пшениц turgidum, чем к ряду timopheevii как считалось долгое время, принимая его за природный мутант T.timopheevii Zhuk. Проведенное расследование происхождения пшеницы Милитины с высокой вероятностью указало на ее рукотворное создание А.Р.Жебраком в 1930‑х – 1940‑х гг., проводившим различные скрещивания с участием пшеницы Тимофеева, в том числе с белоколосой, красноколосой и черноколосой формами пшеницы T.persicum, как в качестве материнской, так и отцовской форм - Tr.persicum v. stramineum  × Tr.timopheevi; Tr.timopheevi × Tr.persicum v. rubiginosum; Tr.persicum v. fuliginosum. При этом сейчас существуют белоколосая и черноколосая формы T.militinae, по всей видимости, являющиеся именно теми гибридами.

Баклажан (Solanum melongena L.) является важной овощной культурой из семейства Пасленовые и одной из самых популярных овощных культур во многих странах мира. Трансформация растений баклажана остается одной из главных проблем генной инженерии растений ввиду относительно низкой эффективности каллусогенеза у разных сортов данной культуры. В нашем исследовании проведен анализ каллусообразования двух белоплодных сортов баклажана на стандартной регенерационной среде с добавлением разных концентраций и сочетаний гормонов в 5 вариантах. В работе использовали фитогормоны 1-нафтилуксусной кислоты (НУК), кинетин, который является цитокинином – растительным гормоном, способствующим делению клеток в присутствии ауксина, и широко используется для образования каллуса или для индуцирования роста побегов, 6-бензиламинопурин (6-БАП), который используется для ускорения роста растений. Вариант I с 0,5 мг/л 6-БАП и 2,0 мг/л НУК, вариант II с 5,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л НУК, вариант III с 2,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л НУК, вариант IV с 2,0 мг/л 6-БАП и 2,0 мг/л кинетином, вариант V и 10,0 мг/л 6-БАП и 0,2 мг/л НУК. Наиболее подходящими оказались вариант 2, где некоторые каллусы образовывали наросты в виде корней, а у других появлялись зачатки микрорастений, и вариант 3, где образовывался очень рыхлый каллус белого или светло-коричневого цвета, на которых также появлялись зачатки микрорастений. Но в дальнейшем в обоих вариантах все каллусы погибали. В вариантах 1, 4 и 5 семядольные экспланты окрашивались в коричневый цвет сначала по краям, а потом и полностью, затем погибали. К сожалению, в рамках нашего исследования не были подобраны оптимальные сочетания гормонов, которые подходили бы для эффективного каллусогенеза разных сортов баклажанов и работа будет продолжена.

Появление в середине 1990-х гг. словосочетания «постгеномная эра» было преждевременным, поскольку секвенируемые в то время (а большей частью и сейчас) так называемые полные геномы высших организмов представляют собой, согласно действующему определению термина «геном», последовательности ДНК половинного набора хромосом, причем собранных из фрагментов парных хромосом, стыкуемых в хаотичном порядке, что позволяет считать их «квазигаплоидными» геномами или «квазигеномами», дающими лишь половинчатую генетическую информацию о конкретном организме, тогда как его фенотип определяет только полный набор хромосом, для всей совокупности ДНК в которых предлагается использовать новый термин «дином». В биологической науке (физико-химической биологии) можно выделить «донуклеиновую» и «нуклеиновую» эры, границей между которыми является намного опередившая свое время эпохальная статья Ф.Мишера, обнаружившего в 1869 г. названную им «нуклеином» богатую фосфором неизвестную субстанцию, ставшую много позже известной как ДНК. «Нуклеиновую эру» в свою очередь можно подразделить на ряд периодов: «тетрадный», «доспиральный», «спиральный» «догеномный», «квазигеномный», «пангеномный», «геномный» или точнее «диномный», который только-только начинается. Невзирая на снижение стоимости полногеномного секвенирования и ускорения этого процесса за последние пару десятилетий приблизительно в миллионы раз, а также, несмотря на заметное повышение его точности, коренного изменения мировоззрения у ученых в связи с насущной необходимостью секвенирования диплоидных геномов и сборки их нуклеотидных последовательностей в фазированном / гаплотипированном формате пока не произошло и подобных диномов в том числе для растений секвенировано крайне мало. И для этого необходим идейно новый подход к секвенированию ядерной ДНК из всего комплекта хромосом. Следует признать, что за диномами будущее ввиду того, что при квазигаплоидном секвенировании часто невозможно определить цис- и трансположения отдельных замен нуклеотидов и, соответственно, установить истинные кодируемые ими белковые последовательности, что может привести к неверному представлению об их каталитических или иных особенностях. Приходит также понимание того, что так называемые эталонные или референсные геномы высших организмов не дают всей полноты информации о вариациях нуклеотидных последовательностей, присущих разным представителям конкретного вида/сорта/линии в связи с чем набирает силу новый тренд в виде секвенирования пангеномов вида (биологического) или супер-пангеномов рода (биологического), позволяющих выявить характерные для всех коровые гены, а также присущие некоторым некие дополнительные гены, соотношение которых в диноме для отдельных образцов может быть чуть ли не равным. Причем секвенирование пангеномов крайне важно так как полученная информация может быть использована для улучшения сельскохозяйственных культур для повышения их урожайности, в том числе с целью создания на основе таких данных цисгенных растений, при определенных условиях (при отсутствии в них чужеродной ДНК в виде маркерных и селективных генов, а также прочих вспомогательных последовательностей) ГМО не являющимися. Знания пангеномов различных линий могут способствовать получению высокогетерозисных гибридов агрономически важных растений, гибридная сила в которых (пока теоретически) может быть закреплена с помощью искусственного апомиксиса с использованием CRISPR/Cas технологии геномного редактирования. При этом секвенирование пангеномов проливает свет на возникновение эффекта гибридной силы, что дает основание выдвинуть «пангеномную теорию гетерозиса», поскольку в этом случае за счет кроссинговера по неведомым законам происходит определенное (удачное) объединение разнокачественных геномов.

Люцерна изменчивая (Medicago varia Mart.) – высокопродуктивная, богатая белком, многолетняя кормовая культура, хорошо приспособленная к условиям Южного Урала и Предуралья. В Республике Башкортостан селекция люцерны изменчивой ведется в Башкирском научно-исследовательском институте сельского хозяйства УФИЦ РАН и опытной станции «Уфимская». Для оценки генетического полиморфизма исходного семенного материала, точной идентификации и паспортизации сортов люцерны может быть использован метод SSR-анализа, который заключается в ПЦР-анализе размеров локусов, содержащих микросателлитные повторы. Большинство SSR-маркеров люцерны разработано для модельного объекта Medicago truncatula Gaertn. (люцерна усеченная), опубликовано несколько исследований SSR-локусов Medicago sativa L (люцерна посевная). Для генетического анализа люцерны изменчивой предлагается использовать те же самые SSR-маркеры, однако насколько они будут эффективны на отечественных сортообразцах этого вида остается неизвестным. Целью данного исследования было испытание SSR-праймеров к 10 микросателлитным локусам на популяциях люцерны изменчивой, находящихся в селекционной работе в условиях Республики Башкортостан. Для работы использовали три популяции M. varia: Скороспелая 9, С 3-6, С 3-8, а также сорт Чишминская 131. Анализ молекулярно-генетического полиморфизма этих образцов люцерны изменчивой методом SSR-ПЦР позволил получить данные по аллельному составу микросателлитных локусов MsEST53, MSE265, MSE562, MSE486, MSE195, MSE590, MSE323, MsEST9, MSE470, MSE276. Наиболее эффективными для генетической паспортизации популяций и сортов этой культуры оказались SSR-маркеры MsEST53, MSE265, MSE562, MSE486, MSE195, MSE590, MsEST9, которые давали наибольшее число полиморфных фрагментов ДНК по результатам ПЦР и электрофореза в полиакриламидном геле, позволяли различить все четыре образца, а также характеризовались близкой температурой отжига праймеров и неперекрывающимися аллельными диапазонами, что делает теоретически возможным их использование в одной совместной мультиплексной ПЦР. Выявленные в ходе работы высоковариабельные SSR-маркеры могут быть использованы для создания тест-систем для точной идентификации и паспортизации сортов, а также для оценки генетического полиморфизма образцов люцерны изменчивой.

Nicotiana tabacum L. – растение семейства Пасленовые, являющееся промышленным культурным видом, которое потенциально может быть использовано в качестве биофабрик для производства лекарств, вакцин или ценных мелких метаболитов, кроме того, растения табака имеют уникальную способность к быстрому и эффективному каллусогенезу. Благодаря этому, возможно его использование в качестве модельной системы клеток растений. Рассмотрены два сорта курительного табака Вирджиния 202 и Юбилейный новый 142, у которых была исследована эффективность каллусогенеза при стандартных условиях на среде с добавлением 1 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) и 0,1 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота) с помощью регенерации через стадию каллусов. В результате, сорт Вирджиния 202 показал высокий потенциал каллусообразования, кроме того, хорошо адаптировался в лабораторных условиях после роста in vitro и давал зрелые семена. Это дает возможность расширить спектр используемых сортов с высокой эффективностью каллусообразования для исследований моделей с внесенными генетическими изменениями.