Biomics

Классическая ПЦР с двумя праймерами обеспечивает обычно наработку одного целевого ампликона. Однако несмотря на кажущуюся простоту этой реакции, при ее протекании неизбежно синтезируются дополнительные продукты разной длины и строения даже при использовании идеальных праймеров. Этим второстепенным продуктам не уделяют должного внимания, но в отдельных случаях они могут заметно влиять на эффективность ПЦР, а также способствовать более раннему выходу реакции на плато, обусловленному несколькими причинами. В качестве основной выступает снижение эффективности отжига праймеров на цепях целевого ампликона за счет увеличения количества последнего в ходе ПЦР и, соответственно, повышения вероятности реассоциации его цепей. Для описания протекающих в ходе ПЦР процессов предложено оперировать условной реакционной ячейкой объемом 1 зептолитр (1000 нм³), вмещающей четвертичные комплексы «ДНК/праймер/ДНК- полимераза/дНТФ». Рассчитано количество необходимых для протекания ПЦР молекул ингредиентов, приходящееся на подобную реакционную ячейку.

ПЦР, ампликон, ДНК-полимераза, праймер, плато, термоконвекция, зептолитр

1. Гарафутдинов Р.Р., Баймиев Ан.Х., Малеев Г.В., Алексеев Я.И., Зубов В.В., Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Матниязов Р.Т., Сахабутдинова А.Р., Никоноров Ю.М., Кулуев Б.Р., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора. Биомика. Т.11(1). С. 23 – 70. DOI: https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2019-04  
2. Гарафутдинов Р.Р., Чемерис Д.А., Мавзютов А.Р., Ахметзянова Л.У., Давлеткулов Т.М., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Петлевая LAMP амплификация нуклеиновых кислот. Два десятилетия развития и совершенствования // Biomics. 2021. Т.13(2). С. 176-226. DOI: https://doi.org/10.31301/2221- 6197.bmcs.2021-14
3. Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А., Чемерис А.В., Гарафутдинов Р.Р. Энхансеры ПЦР. I. Общие сведения // Biomics. Т.15(3). С.218-223. DOI: https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2023-20
4. Чемерис А.В., Аминев Ф.Г., Гарафутдинов Р.Р., Анисимов В.А., Сагитов А.М., Хуснутдинова Э.К., Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А., Михайленко К.И. ДНК-криминалистика. М.: Наука, 466 с.
5. Чемерис  Д.А.,        Гарафутдинов        Р.Р., Сахабутдинова А.Р., Малеев Г.В., Чемерис А.В. Конвекционная ПЦР в конвективных ячейках разных типов. Биомика. Т.10(4). С. 410-443. DOI:https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2018-52
6. Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных) // Биомика. Т. 8. № 3. С. 215-238.
7. Чемерис Д.А., Магданов Э.Г., Машков О.И., Гарафутдинов Р.Р., Чемерис А.В. ПЦР с отложенным (горячим или задержанным) стартом // Биомика. 2011. Т. № 1. С. 1-8.
8. Cho Y, Lee HS, Kim YJ, Kang SG, Kim SJ, Lee Characterization of a dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in polymerase chain reaction amplification // Mar Biotechnol. 2007. V.9(4). P.450-458. doi: https://doi.org/10.1007/s10126-007-9002-8
9. Clark Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases // Nucleic Acids Res. 1988. V.16(20). P.9677-9686. doi: https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9677
10. Dabrowski S, Kiaer Ahring Cloning, expression, and purification of the His6-tagged hyper- thermostable dUTPase from Pyrococcus woesei in Escherichia coli: application in PCR // Protein Expr Purif. 2003. V.31(1). P.72-78. doi:https://doi.org/10.1016/s1046- 5928(03)00108-6
11. Dimitrov DS, Apostolova MA. The limit of PCR amplification // J Theor Biol. 1996. 178(4). P.425-426. doi: https://doi.org/10.1006/jtbi.1996.0041
12. Doronin V., Nevinsky G.A., Malygina T.O., Podust V.N., Khomov V.V., Lavrik O.I. The efficiency of interaction of deoxyribonucleoside-5'-mono-, di- and triphosphates with the active center of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment // FEBS Lett. 1989. V. 259. P. 83-85. doi: https://doi.org/10.1016/0014-5793(89)81500-5
13. Douglas A, Atchison Degradation of DNA during the denaturation step of PCR // PCR Methods Appl. 1993. V.3(2). P.133-134. doi: https://doi.org/10.1101/gr.3.2.133
14. Garafutdinov R., Chemeris D.A., Sakhabutdinova A.R., Kiryanova O.Y., Mikhaylenko C.I., Chemeris A.V. Encoding of non-biological information for its long-term storage in DNA // Biosystems. 2022. V.215-216. 104664. doi: https://doi.org/10.1016/j.biosystems.2022.104664
15. Garafutdinov R., Galimova A.A., Sakhabutdinova A.R. The influence of quality of primers on the formation of primer dimers in PCR // Nucleos. Nucleot. Nucleic Acids. 2020. V. 39(9). P. 1251-1269. doi: https://doi.org/10.1080/15257770.2020.1803354
16. Garafutdinov RR, Chemeris DA, Sakhabutdinova AR, Moiseev KV, Urmancheev SF, Mikhaylenko CI, Privalov LY, Chemeris Convective polymerase chain reaction in standard microtubes // Anal Biochem. 2022a. V.641. 114565. doi: https://doi.org/10.1016/j.ab.2022.114565
17. Hogrefe HH, Hansen CJ, Scott BR, Nielson KB. Archaeal dUTPase enhances PCR amplifications with archaeal DNA polymerases by preventing dUTP incorporation // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. 99(2). P.596-601. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.012372799
18. Jansson L, Hedman J. Challenging the proposed causes of the PCR plateau phase // Biomol Detect 2019. V.17. 100082. doi: https://doi.org/10.1016/j.bdq.2019.100082
19. Kainz P. The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations // Biochim Biophys Acta. V.1494(1-2). P.23-27. doi: https://doi.org/10.1016/s0167- 4781(00)00200-1
20. Lyamichev V, Brow MA, Dahlberg Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases // Science. 1993. V.260(5109). P.778-783. doi: https://doi.org/10.1126/science.7683443
21. Lyamichev V, Brow MA, Varvel VE, Dahlberg Comparison of the 5' nuclease activities of taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V.96(11). P.6143-6148. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.96.11.6143
22. Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T. Real- time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA // J Biochem Biophys 2004. V.59(2). P.145-157. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbbm.2003.12.005
23. Morrison C, Gannon F. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR // Biochim Biophys 1994. V.1219(2). P.493-498. doi: https://doi.org/10.1016/0167- 4781(94)90076-0
24. Mullis KB, Faloona Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987. V.155. P.335-350. doi: https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)55023-6
25. Mullis KB. The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion // PCR Methods Appl. 1991. 1(1). P.1-4. doi: https://doi.org/10.1101/gr.1.1.1
26. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. V.230(4732).  P.1350-1354. doi: https://doi.org/10.1126/science.2999980
27. Sikorsky JA, Primerano DA, Fenger TW, Denvir DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency // Biochem Biophys Res Commun. 2007. V.355(2). P.431-437. doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.01.169
28. Sikorsky JA, Primerano DA, Fenger TW, Denvir Effect of DNA damage on PCR amplification efficiency with the relative threshold cycle method // Biochem Biophys Res Commun. 2004. V.323(3). P.823- 830. doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.08.168
29. Spaete RR, Frenkel N. The herpes simplex virus amplicon: a new eucaryotic defective-virus cloning- amplifying vector // Cell. 1982. 30(1). P.295-304. doi: https://doi.org/10.1016/0092-8674(82)90035-6