Структурное разнообразие триптофанового оперона и лидерного пептида TrpL у представителей ENTEROBACTERIA

Особенностью организации генетического материала в бактериальных клетках является формирование оперонов - групп плотно сцепленных генов, транскрипция которых приводит к биосинтезу одной общей мРНК с несколькими сайтами инициации и терминации трансляции [Jacob, Monod, 1961]. В оперон обычно собраны гены, кодирующие ферменты одного биохимического пути метаболизма. Классическими примерами бактериальных оперонов являются лактозный и триптофановый опероны. Так у Escherichia coli в триптофановый оперон входят гены, кодирующие последовательно TrpL (лидерный пептид) и 5 полипептидов, обеспечивающих превращение хоризмовой кислоты в триптофан: TrpE (антранилатсинтаза), TrpD (антранилатфосфорибозилтрансфераза), TrpC (индол-3-глицеролфосфатсинтаза), TrpB (?-субъединица триптофансинтазы), TrpA (?-субъединица триптофансинтазы) [Yanofsky et al., 1981].       Триптофановый оперон энтеробактерий на протяжении последних 40 лет является классическим примером негативной регуляции метаболитом транскрипции генов его биосинтеза [Yanofsky, 1981]. Помимо "стандартного" регулятора транскрипции (TrpR) генов оперона [Singleton et al., 1980], бактерии используют процесс аттенюации, т.е. прекращение транскрипции молекулой РНК-полимеразы данного участка генома в случае биосинтеза рибосомами лидерного пептида. Аттенюация может происходить только в случае совмещения во времени процессов транскрипции и трансляции. Синтез лидерного пептида, ген которого расположен в начале оперона, приводит к возникновению специфических "шпилек" в молекуле ДНК внутри оперона между генами trpL и trpE, вследствие чего РНК-полимераза отделяется от ДНК с преждевременным прекращением транскрипции [Yanofsky, 1981]. В свою очередь синтез лидерного пептида TrpL может происходить только при избытке в клетке триптофана, а точнее тРНКTrp, связанных с триптофаном. Таким образом, бактериальная клетка не осуществляет транскрипцию генов ферментов биосинтеза этой аминокислоты в условиях её избытка.       При анализе в системе RAST (http://rast.nmpdr.org/) [Aziz et al., 2008] структурных генов триптофанового оперона штамма Enterobacter cloacae complex K7, выделенного из ризосферы топинамбура [Kryuchkova et al., 2014], было обнаружено, что при полной идентичности порядка расположения структурных генов trpEDCBA с E. coli K-12 в геноме штамма K7 не аннотирован ген лидерного пептида trpL. В базе данных GenBank, использующей при аннотации бактериальных геномов программную платформу NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline [Tatusova et al., 2016], для представителей рода Enterobacter (более 1250 геномов) пептид TrpL ранее не был описан. А из всех бактериальных геномов, представленных в GenBank (более 140 000 геномов), TrpL аннотирован только в 215 вариантах, из них 164 (76%) для энтеробактерий, из которых 151 приходятся на 2 рода: Salmonella и Escherichia (83 и 68, соответственно). Таким образом, целью данной работы стало изучения разнообразия trp-оперонов энтеробактерий и выявление присутствия в них генов лидерного пептида.       В данной работе проанализированы нуклеотидные последовательности 20 геномов бактерий, относящихся к 12 родам 7 семейств порядка Enterobacteriales (табл. 1), на участке от гена, кодирующего фермент TrpH (5'-3' экзорибонуклеазы), предшествующего триптофановому оперону, до гена белка OmpW (белок W наружной мембраны), следующего после оперона.               Таблица 1. Информация о генном составе триптофановых оперонов штаммов, проанализированных в данной работе Table 1. Information on the gene composition of tryptophan operons of the strains that were analyzed in this work Штамм Strain Номер последовательности в GenBank GenBank sequence accession number Гены триптофанового оперона, аннотированные в GenBank Annotated tryptophan operon genes Длина нуклеотидной последовательности между фланкирующим геном и trpE, п.о. Length of the nucleotide sequences between the flanking genes and trpE (bp) Escherichia coli K-12 AP012306 trpLEDCBA 273 Enterobacter cloacae ATCC 13047 CP001918 trpEGDCBA 279 Enterobacter ludwigii EN-119 CP017279 trpEDCBA 281 Enterobacter hormaechei ATCC 49162 MKEQ01000001 trpEDCBA 265 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 13311 CP009102 trpEDCBA 260 Hafnia alvei ATCC 13337 JMPK01000051 trpEGDCBA 452 Hafnia paralvei ATCC 29927 LXET01000031 trpEGDCBA 452 Pectobacterium carotovorum NCPPB 312 JQHJ01000004 trpEGDCBA 356 Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 BX950851 trpEGDCBA 303 Pantoea agglomerans DSM3493 FYAZ01000004 trpEGDCBA 278 Pantoea ananatis LMG 2665 JFZU01000009 trpEGDCBA 282 Erwinia amylovora CFBP 1232 CAPB01000020 trpEGDCBA 275 Photorhabdus luminescens ATCC 29999 FMWJ01000001 trpEGDCBA 861 Proteus mirabilis ATCC 29906 ACLE01000027 trpEGDCBA 318 Yersinia pestis NCTC5923 UAVH01000007 trpLEGDCBA 451 Yersinia pseudotuberculosis ATCC 6904 CP008943 trpEGDCBA 577 Yersinia enterocolitica ATCC 9610 JPDV01000006 trpEGDCBA 704 Serratia marcescens ATCC 13880 JMPQ01000044 trpEGDCBA 383 Vibrio cholerae ATCC 14035 JHXR01000004 trpLEGDCBA 335               Нуклеотидные последовательности между генами trpH и trpE (первый структурный ген оперона) были исследованы на присутствие в них открытых рамок считывания, кодирующих лидерный пептид trpL, с использованием ресурса ExPASy Translate (https://web.expasy.org/translate/). За TrpL принимался пептид, состоящий из менее 40 аминокислотных остатков, содержащий два остатка триптофана в соседних позициях.       Структурные гены триптофанового оперона (trpEDCBA) были обнаружены между фланкирующими генами trpH и ompW во всех исследованных геномах. Лишь в геноме Salmonella typhimurium ATCC 13311 не был выявлен ген экзорибонуклеазы trpH, фланкирующий оперон с 5'-конца. У этого штамма гену trpE в аннотации генома предшествовал ген треонилкарбомоил-АМФ синтазы, который в остальных анализированных геномах располагался перед trpH. У большинства исследованных штаммов между trp-опероном и геном ompW аннотированы дополнительные гены гипотетических белков или белков с неясной ферментативной активностью.       Во всех рассмотренных в данной работе вариантах гены внутри оперона имели одинаковое направление транскрипции от trpE к trpA. Проанализированные триптофановые опероны можно разделить на 2 группы, в зависимости от присутствия или отсутствия в них гена trpG (табл. 1), кодирующего фермент TrpG (амидотрансферазный компонент антранилатсинтазы). В большинстве случаев (17 геномов) ген trpG присутствовал и располагался между генами trpE и trpD. Причём, во всех этих геномах (кроме Yersinia enterocolitica ATCC 9610) ген trpG имел перекрытия последовательностей с trpE (большинство штаммов) или с trpD (Enterobacter cloacae ATCC 13047), либо сразу с обоими соседними генами (Erwinia amylovora CFBP 1232). Лишь в 5 геномах (Escherichia coli K-12, Enterobacter ludwigii EN-119, Ent. cloacae complex K7, Enterobacter hormaechei ATCC 49162 и S. typhimurium ATCC 13311) ген trpG отсутствовал. В клетках этих штаммов перенос аминогруппы с глутамина на хоризмат катализирует N-концевой домен бифункционального фермента TrpD, как это описано для E. coli [Yanofsky et al., 1981].       Длина нуклеотидных последовательностей от предшествующего оперону гена до начала гена trpE варьировала от 260 (S. typhimurium ATCC 13311) до 861 п.о. (штамм Photorhabdus luminescens ATCC 29999). В геноме штамма Ent. cloacae complex K7 длина этой последовательности составила 280 п.о. Из проанализированных оперонов лишь для трёх штаммов (E. coli K-12, Yersinia pestis NCTC5923 и Vibrio cholerae ATCC 14035) на этих участках геномов были аннотированы гены trpL (номера в GenBank: BAL38329, WP_002227930 и WP_001880954, соответственно). Перевод нуклеотидных последовательностей межгенных участков в аминокислотные последовательности с использованием ресурса ExPASy также позволил выявить во всех остальных исследованных нами геномах штаммов порядка Enterobacteriales гены пептидов TrpL (рис.1).                Рис. 1. Аминокислотные последовательности лидерных пептидов TrpL, выявленные при анализе геномов штаммов представителей разных семейств Enterobacteriales. * - лидерные пептиды, аннотированные  ранее в GenBank (E. coli K-12 - BAL38329; Yersinia pestis NCTC5923 - WP_002227930;  Vibrio cholerae ATCC 14035 - WP_001880954). Серым фоном отмечены остатки триптофана. Fig. 1. Amino acid sequences of TrpL leader peptides from genomes of strains representing different families of Enterobacteriales. * - leader peptides earlier annotated in GenBank (E. coli K-12 - BAL38329; Yersinia pestis NCTC5923 - WP_002227930; Vibrio cholerae ATCC 14035 - WP_001880954). Tryptophan residues are marked in gray.               Сравнение аминокислотных последовательностей лидерных пептидов TrpL двадцати штаммов энтеробактерий выявил существенные различия в их составе. Длина пептидов варьировала от 14 (Enterobacteriaceae и Pectobacteriaceae) до 36 (V. cholerae ATCC 14035) аминокислотных остатков. Количество остатков триптофана в лидерных пептидах также различалось, составляя один (Pantoea agglomerans DSM3493), два (большинство штаммов), три (Proteus mirabilis ATCC 29906, Hafnia alvei ATCC 13337 и Hafnia paralvei ATCC 29927) и пять (V. cholerae ATCC 14035).       Остатки триптофана в TrpL находятся ближе к N-концу (Hafniaceae, Pectobacteriaceae и Ph. luminescens ATCC 29999), в середине пептида (Yersiniaceae, P. mirabilis ATCC 29906 и 2 штамма рода Pantoea) и ближе к C-концу молекулы (Enterobacteriaceae, Erwinia amylovora CFBP 1232 и V. cholerae ATCC 14035). Исходя из функциональной значимости остатков триптофана в пептиде TrpL, можно предположить, что аттенюация выполняется наиболее строго в клетках Pan. agglomerans DSM3493, так как пептид синтезируется при включении единичного остатка триптофана. Для штаммов, у которых остатки триптофана расположены ближе к началу пептида, аттенюация должна быть более эффективна, так как при избытке триптофана в клетке рибосома проходит этот участок быстрее без синтеза более длинного пептида.       При сравнении пептидов TrpL штаммов внутри родов и семейств было выявлено 3 группы пептидов с идентичными структурами. Так, абсолютно идентичны аминокислотные последовательности пептидов у двух исследованных представителей рода Pectobacterium, при 100% идентичности и нуклеотидных последовательностей trpL. Также идентичны аминокислотные и нуклеотидные последовательности TrpL у штаммов Y. pestis NCTC 5923 и Yersinia pseudotuberculosis ATCC 6904. У TrpL штамма Y. enterocolitica ATCC 9610 имеется две аминокислотные замены относительно последовательности пептида других видов рода Yersinia, а TrpL штамма Serratia marcescens ATCC 13880 (также представитель Yersiniaceae) имеет ещё три дополнительных аминокислотных замены и делецию при сохранении общего сходства пептидов внутри семейства.       У штаммов Ent. cloacae ATCC 13047, Ent. ludwigii EN-119 и Ent. cloacae complex K7 при идентичности аминокислотных последовательностей имеются точечные различия в нуклеотидных. Так, в 6-ой и 39-ой позициях гена trpL у штамма Ent. cloacae ATCC 13047 находятся остатки тимидина вместо аденозина у двух других штаммов. При этом, TrpL Ent. hormaechei ATCC 49162 отличается от TrpL других штаммов рода Enterobacter как по аминокислотной, так и по нуклеотидной последовательностям. Установлено, что у всех представителей семейства Enterobacteriaceae в TrpL имеется консервативный С-концевой участок (GWWRTS) и вариабельный N-концевой участок, в котором в позициях 5 и 7 консервативно расположены остатки фенилаланина и лейцина, соответственно.       Пептиды TrpL штаммов рода Hafnia (Hafniaceae) имеют высокое сходство между собой, различаясь отсутствием остатка треонина во 2-ом положении и заменой остатка глицина на остаток серина в 13-ом положении у H. paralvei ATCC 29927, в отличие от H. alvei ATCC 13337. Представители рода Pantoea (семейство Erwiniaceae) при сходстве своих TrpL имеют всего 16 идентичных из 26 аминокислотных остатков пептида. Другой представитель этого семейства Erw. amylovora CFBP 1232 имеет TrpL существенно отличающийся от Pantoea spp. Также у штаммов семейства Morganellaceae (Ph. luminescens ATCC 29999 и P. mirabilis ATCC 29906) TrpL между собой имеют больше различий, чем сходств. И совсем особое строение имеет TrpL штамм V. cholerae ATCC 14035, состоящий из значительно более длинной аминокислотной цепочки, содержащей сразу 5 остатков триптофана. Ранее был описан TrpL для представителя вида Vibrio parahaemolyticus [De Troch et al., 1997], также имеющий в своём составе 5 остатков триптофана, сходные с TrpL V. cholerae N- и C-концевые участки молекул, но состоящий из 41 аминокислотного остатка. Примечательно, что TrpL бактерий рода Vibrio содержат более 35 аминокислотных остатков и успешно аннотируются программой NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline при анализе полногеномных данных, в отличие от более коротких trpL других энтеробактерий.       Таким образом, несмотря на малое количество аннотированных лидерных пептидов TrpL в базах данных, гены этих пептидов легко могут быть найдены в геномах бактерий перед структурными генами биосинтеза триптофана. Программы аннотации геномов (в частности, платформы RAST и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline) некорректно выявляют короткие кодирующие участки, такие как лидерные пептиды, состоящие из менее 30 аминокислотных остатков. В связи с этим представляется необходимой оптимизация программ аннотации геномов и внесение последовательностей лидерных пептидов бактерий и их генов в соответствующие базы данных. Это, в частности, позволит оценивать уровень экспрессии генов, кодирующих лидерные пептиды, при проведении высокопроизводительного транскриптомного профилирования.

1. Aziz R.K., Bartels D., Best A.A., DeJongh M., Disz T., Edwards R.A., Formsma K., Gerdes S., Glass E.M., Kubal M., Meyer F., Olsen G.J., Olson R., Osterman A.L., Overbeek R.A., McNeil L.K., Paarmann D., Paczian T., Parrello B., Pusch G.D. Reich C., Stevens R., Vassieva O., Vonstein V., Wilke A., Zagnitko O. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 2008. V. 9. P. 75. doi:10.1186/1471-2164-9-75
2. De Troch P., Dosselaere F., Keijers V., de Wilde P., Vanderleyden, J. Isolation and characterization of the Azospirillum brasilense trpE(G) gene, encoding anthranilate synthase. Curr. Microbiol. 1997. V. 34(1). P. 27-32. doi:10.1007/s002849900139
3. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 1961. V. 3(3). P. 318-356. doi:10.1016/S0022-2836(61)80072-7
4. Kryuchkova Y.V., Burygin G.L., Gogoleva N.E., Gogolev Y.V., Chernyshova M.P., Makarov O.E., Fedorov E.E., Turkovskaya O.V. Isolation and characterization of glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014. V. 169(1). P. 99-105. doi:10.1016/j.micres.2013.03.002
5. Singleton C.K., Roeder W.D., Bogosian G., Somerville R.L., Weith, H.L. DNA sequence of the E. coli trpR gene and prediction of the amino acid sequence of Trp repressor. Nucleic Acids Res. 1980. V. 8(7). P. 1551-1560. doi:10.1093/nar/8.7.1551
6. Tatusova T., DiCuccio M., Badretdin A., Chetvernin V., Nawrocki E.P., Zaslavsky L., Lomsadze A., Pruitt K.D., Borodovsky M., Ostell J. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Res. 2016. V. 44(14). P. 6614-6624. doi:10.1093/nar/gkw569
7. Yanofsky C. Attenuation in the control of expression of bacterial operons. Nature. 1981. V. 289(5800). P. 751-758. doi:10.1038/289751a0.
8. Yanofsky C., Platt T., Crawford I.P., Nichols B.P., Christie G.E., Horowitz H., VanCleemput M., Wu A.M. The complete nucleotide sequence of the tryptophan operon of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 1981. V. 9(24). P. 6647-6668. doi:10.1093/nar/9.24.6647