Влияние производных ряда гексагидропиримидина, бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) и соли тетрагидропиримидиния на протекание полимеразной цепной реакции

22.06.2019
Авторы:
Хасанова А.А. , Киреева Д.Р. , Гибадуллина Н.Н. , Фазлетдинова З.Н. , Сахабутдинова А.Р. , Гарафутдинов Р.Р.
Название:
Влияние производных ряда гексагидропиримидина, бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) и соли тетрагидропиримидиния на протекание полимеразной цепной реакции
Страницы:
14-22
скачано
7 раз(а)


Полимеразная цепная реакция является незаменимым методом современной биологической науки и медицины. Метод заключается в ферментативной наработке фрагментов нуклеиновых кислот путем многократного увеличения количества исходной ДНК или РНК мишени. Необходимость анализа с помощью ПЦР сложных биологических материалов обусловливает разработку подходов, повышающих чувствительность и специфичность реакции. Одним из таких приемов является добавление в ПЦР-реакционные смеси специальных веществ - ингибиторов или энхансеров ПЦР, модулирующих протекание реакции. В данной работе исследовано протекание ПЦР в присутствии Na-солей производных гексагидропиримидина и бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) и соли тетрагидропиримидиния - структурных аналогов эктоинов, известных как энхансеры ПЦР. Оказалось, что протестированные производные гексагидропиримидина практически не влияют на протекание ПЦР, а производные бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) в основном полностью ингибируют ПЦР в концентрации 10 мМ. Ближайший аналог эктоина, соль тетрагидропиримидиния, оказывает умеренный ингибирующий эффект.
Введение     Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод наработки фрагментов нуклеиновых кислот (НК) путем многократного увеличения количества исходной НК-мишени до уровня, обеспечивающего ее уверенное обнаружение инструментальными методами [Mullis, Faloona, 1987; Saiki et al., 1985]. ПЦР является наиболее широко используемым методом для молекулярной диагностики различных заболеваний [Burtis et al., 2013], анализа объектов окружающей среды [Saito et al., 2014] и продуктов питания [Chaouachi et al., 2013],  в экспертно-криминалистической деятельности [Brettel et al., 2011]. Практическое применение ПЦР обусловливает поиск способов совершенствования метода и разработки его новых вариантов, так как НК, выделяемые из биологических образцов, нередко являются "сложными" для амплификации из-за наличия фоновой ДНК (например, ДНК из многокомпонентных систем - почвы, природных и сточных вод, медицинского мазка и др.), разрушенности молекул (древняя ДНК или ДНК, разрушенная под воздействием физических и химических факторов), малого количества ДНК и др.       Трудности при анализе НК часто связаны также с наличием в образцах соединений, выделяющихся совместно с НК и ингибирующих ПЦР. Например, при выделении ДНК из биоматериалов человека возможно соосаждение вместе с ДНК солей желчных кислот, мочевины, гема, гепарина, белков и углеводов, а при выделении ДНК из растительных объектов - полисахаридов, алкалоидов, терпенов, таннинов, фенольных соединений, образующих с ДНК сложные комплексы. Другими важными источниками ингибиторов ПЦР являются материалы и реагенты, которые контактируют с образцами во время обработки или очистки ДНК. Превышение определенных концентраций самих реактивов, использованных при выделении (ЦТАБ, ЭДТА, избыток KCl, NaCl и других солей, этанол, изопропанол, фенол, ацетат натрия и т.д.), могут привести к ингибированию амплификации. В ряде обзорных статей показано значительное снижение чувствительности и эффективности ПЦР или получение ложных результатов, вызванное наличием ингибирующих компонентов [Чемерис и др., 2012а; Чемерис и др., 2012b].      Исключение ингибирования ПЦР добиваются в основном повышением качества/чистоты ДНК, для чего используют различные методики выделения, разработанные под конкретные биологические объекты [например, Hofreiter, Shapiro, 2012]. Имеется большое количество коммерческих наборов для быстрой экстракции ДНК, однако они чаще применяются для выделения нуклеиновых кислот из относительно "чистых" источников. Для выделения ДНК из "сложных" образцов (биологические жидкости, продукты питания, почва, останки из захоронений, поверхностные и сточные воды и пр.) нередко прибегают к модификации методик экстракции. Одним из способов снижения влияния ингибиторов является использование максимально сближенных праймеров (праймеры, расположенные встык, т.е. 3'-концы которых располагаются на смежных нуклеотидах комплементарных цепей ДНК-матрицы), для которых ПЦР характеризуется высокими специфичностью и чувствительностью [Garafutdinov et al., 2017; Garafutdinov et al., 2015; Галимова и др., 2017].      Одним из подходов к повышению эффективности ПЦР стало использование специальных веществ - энхансеров ПЦР, улучшающих специфичность и эффективность реакции, а также выход целевого продукта амплификации. Впервые об энхансерах ПЦР упоминается в работе [Bookstein et al., 1990], где авторы для получения специфичного продукта добавляли в ПЦР смесь 10% ДМСО. Показано также, что наряду с ДМСО для преодоления ингибирующего действия некоторых растительных полисахаридов могут быть эффективно применены 0,25% или 0,5% Tween 20 и 5% полиэтиленгликоль 400 [Demeke, Adams, 1992]. Позднее для повышения эффективности ПЦР были предложены соли тетраалкиламмония [Chevet et al., 1995], амиды [Sarkar et al., 1990; Kovarova, Draber, 2000; Chakrabarti, Schutt, 2001a], сульфоксидов [Chakrabarti, Schutt, 2002], сульфонов [Chakrabarti, Schutt, 2001b], бетаина [Baskaran et al., 1996; Hengen, 1997; Henke et al., 1997; Frackman et al., 1998], трегалозы [Spiess et al., 2004], многоатомные спирты [Zhang et al., 2009; Nagai et al., 1998; Demeke, Adams, 1992], белки [Nagai et al., 1998; Kreader, 1996], неионные детергенты [Bachmann et al., 1990; Demeke, Adams, 1992; Liu, 1995], нуклеотидные аналоги [McConlogue et al., 1988; Turner, Jenkins, 1995], золотые и серебряные наночастицы [Chen, 2012; Kambli, 2016].      Интересными агентами повышения эффективности ПЦР являются эктоины - органические соединения цвиттер-ионной природы, содержащие азотистые гетероциклы. Было показано влияние ряда эктоинов на протекание ПЦР [Schnoor, 2004], при этом оказалось, что характер влияния (ингибирование или повышение эффективности амплификации) зависит от структуры соединения. В данной работе было изучено протекание полимеразной цепной реакции в присутствии аналогов эктоинов - производных гексагидропиримидина, бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) и соли тетрагидропиримидиния (VIII).               Экспериментальная часть     В работе были использованы следующие реактивы: 5-(этилтио)-1H-тетразол, амидофосфиты (dA-CE, dC-CE, dG-CE, dT-CE), носители для синтеза олигонуклеотидов (dA-CPG, dC-CPG, dG-CPG, dT-CPG) (все Glen Research); абсолютные ацетонитрил и тетрагидрофуран квалификации "для синтеза ДНК" (Panreac); акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, ТРИС, персульфат аммония, динатриевая соль N,N,N',N'-этилендиаминтетраукусной кислоты (ЭДТА), N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, додецилсульфат натрия (ДДС) (все AppliChem); Taq полимераза (Fermentas), дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) (СибЭнзим), SYBR Green I (Биотех-Индустрия). Для приготовления всех растворов использовали воду высшей категории качества (18МOм) (Millipore).      Производные гексагидропиримидина, бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) I - VII и соль тетрагидропиримидиния (VIII) получали по методикам, описанным в [Latypova et al., 2017; Gibadullina et al., 2017; Гибадуллина и др., 2017; Ишмияров Э.Р. и др. 2015; Gibadullina et al., 2018]. В данной работе для соединений I-VI использовали их натриевые соли, которые получали омылением сложных эфиров в смеси ДМСО и 10%-ного водного NaOH (1:1 об.) при 95°С в течение 5-12 ч. Для соединения VII также получали соль взаимодействием с эквимолярным количеством уксусной кислоты, а соединение VIII использовали без дополнительных химических превращений. До добавления указанных веществ в ПЦР смеси готовили их 100 мМ растворы в 30%-ном водном ДМСО, из которого готовили соответствующие разведения, при этом содержание ДМСО в стоковых растворах сохраняли постоянным.        В качестве ДНК-матрицы для ПЦР использовали ДНК богомола обыкновенного (Mantis religiosa), которую выделяли из мышечной ткани насекомого с помощью коммерческого набора ДНК-Экстран-2 (Синтол) строго по протоколу производителя. Для амплификации  брали прямой MR F (5'-TTAAGGATCGTTTCGACGGAGCATC-3') и обратный MR R (5'-CTGTCGTCCATGCGTTCCCT-3') праймеры, которые подбирали с использованием online-утилиты OligoAnalyzer (Integrated DNA Technologies) к гену 28S рРНК на основе нуклеотидной последовательности, депонированной в GenBank. Синтез праймеров осуществлен на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет) амидофосфитным способом, их очистку проводили методом гель-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Концентрацию всех нуклеиновых кислот определяли по оптической плотности водного раствора при 260 нм на спектрофотометре BioSpec-Mini (Shimadzu).     Полимеразную цепную реакцию проводили в реальном времени в ДНК-амплификаторе iQ5 (Bio-Rad Laboratories). Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 3 нг ДНК богомола, 0.5 мкл каждого из праймеров с концентрацией 1.0 О.Е./мл, 2.5 ед. акт. Taq полимеразы, 1.0 мкл смеси dNTP с концентрацией 2.5 мМ, 1 мкл буфера для Taq полимеразы (67 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 2.0 мМ MgCl2, 18 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Твин-20), 1 мкл 10-кратного раствора SYBR Green I и 1 мкл раствора одного из производных I-VIII. Каждый образец был представлен в трех повторах. Использовали программу, рекомендуемую для ПЦР в режиме реального времени с применением интеркалирующих красителей: начальная денатурация при 94°С (3 мин), 70 циклов - денатурация при 94°С (15 с), отжиг при 60°С (40 с), элонгация при 72°С (30 с), конечная элонгация при 72°С (2 мин).               Результаты и обсуждение     Характер влияния того или иного соединения на протекание полимеразной цепной реакции (ее ингибирование или повышение эффективности амплификации) зависит от структуры вещества. В связи с необходимостью повышения чувствительности и специфичности ПЦР продолжается поиск так называемых энхансеров ПЦР, способствующих повышению эффективности данной реакции.               Рис. 1. Структуры использованных в работе производных гексагидропиримидина (I-IV), бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) (V-VII) и соли тетрагидропиримидиния (VIII).     В настоящей работе было изучено влияние ряда производных гексагидропиримидина, бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) I - VII и соли тетрагидропиримидиния (VIII) - аналогов эктоинов, известных в качестве энхансеров ПЦР. Структуры взятых соединений приведены на рисунке 1. Соединения I - IV являются производными гексагидропиримидина, соединения V - VII - производными бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина), а соль тетрагидропиримидиния VIII содержит характерное для эктоинов гетероциклическое ядро с четвертичным атомом азота. Влияние солевых форм указанных веществ на протекание амплификации оценивали путем проведения ПЦР в режиме реального времени. Амплификации подвергали фрагмент высококопийного гена 28S рРНК богомола обыкновенного с использованием пары праймеров с традиционным расположением. В эксперименты были взяты для всех веществ четыре концентрационные точки: 10, 1, 0.1 и 0.01 мМ (в конечном растворе). Поскольку вещества умеренно растворимы в воде, использовали их растворы в разбавленном водном ДМСО, конечная концентрация которого в ПЦР-образцах составляла 3% (об.), что недостаточно для влияния непосредственно самого ДМСО на протекание ПЦР.  В качестве параметров, характеризующих влияние протестированных веществ, были  использованы пороговый цикл Ct и относительная интенсивность флуоресценции RFU. Значения пороговых циклов Ct соответствуют началу экспоненциальной фазы накопления ампликонов и прямо коррелируют со скоростью реакции. При прочих равных условиях величина Ct обратно пропорциональна логарифму начальной концентрации ДНК-матриц, однако при наличии ингибиторов ПЦР значения Ct смещаются в сторону бoльших величин. Чем сильнее влияние ингибитора, тем больше значение порогового цикла. Значение интенсивности флуоресценции RFU определяется по завершению экспоненциальной фазы реакции. Оно коррелирует с количеством двуцепочечных продуктов и, соответственно, с эффективностью амплификации: чем выше значение RFU, тем большее количество продуктов образовалось. Полученные в результате проведенных экспериментов значения Ct и RFU приведены в таблице 1.   Таблица 1.  Характеристики кривых амплификации: Ct - значение порогового цикла, RFU - относительная интенсивность флуоресценции после выхода кривых на плато.   Соединение Параметр Концентрация соединения (мМ)   10 1 0.1 0.01 0 I Ct 17.4±0.4 17.6±0.3 17.0±0.4 17.5±0.3 17.2±0.4  RFU 525±40 550±20 550±35 600±80 570±40 II Ct 18.2±0.3 16.8±0.2 16.9±0.2 17.1±0.4 16.8±0.5  RFU 580±30 620±50 600±25 620±20 600±25 III Ct 17.5±0.3 17.0±0.4 17.2±0.3 16.9±0.3 16.7±0.4  RFU 690±40 710±45 650±30 670±35 700±30 IV Ct F* F 17.0±0.2 16.4±0.3 16.4±0.2  RFU F F 710±45 790±30 830±30 V Ct N/A** 16.9±0.6 16.6±0.3 16.8±0.4 16.3±0.3  RFU N/A 450±30 590±45 670±30 730±20 VI Ct N/A 16.6±0.3 16.6±0.2 16.2±0.4 16.8±0.5  RFU N/A 520±20 520±25 620±30 600±20 VII Ct 20.2±0.2 17.6±0.3 16.8±0.5 16.7±0.4 16.4±0.3  RFU 450±35 430±30 510±30 615±40 720±10 VIII Ct N/A 17.3±0.3 17.5±0.4 17.3±0.4 17.6±0.3  RFU N/A 250±30 680±35 800±30 810±20 * F - исследованное соединение флуоресцирует и маскирует результат амплификации. ** N/A - подъема кривых не наблюдалось.                        Полученные значения Ct и RFU показывают, что ни одно из проанализированных соединений не выступает в качестве энхансера ПЦР. Наоборот, они либо практически не влияют на протекание ПЦР (соединения I - III), либо оказывают ингибирующий эффект. При этом ингибирующий эффект проявляется двояко (рис. 2): либо только путем снижения интенсивности флуоресценции (для соединений V и VIII), либо преимущественно путем увеличения порогового цикла (для соединения VII).                   Рис. 2. Характер изменения кривых амплификации: (А) - ингибирование, приводящее к снижению интенсивности флуоресценции RFU (соединение V: кривые 1 - 0 мМ, 2 - 0.01 мМ, 3 - 0.1 мМ, 4 - 1 мМ,  5 - 10 мМ), (Б) - ингибирование, приводящее к увеличению величины порогового цикла Ct  (соединение VII: кривые 1 - 0 мМ, 2 - 0.01 мМ, 3 - 0.1 мМ, 4 - 1 мМ, 5 - 10 мМ)                 Соединения V, VI и VIII в максимальной из взятых концентраций (10 мМ) полностью ингибируют ПЦР. Оказалось неожиданным, что соединение IV флуоресцирует в области детекции использованного красителя SYBR Green I (канал 520 нм), что сделало невозможным оценку влияния двух максимальных концентраций данного вещества на протекание ПЦР. Таким образом, протестированные производные гексагидропиримидина (структуры I - IV) практически не влияют на протекание ПЦР. Некоторые производные бис(1,2,3,4-тетрагидропиридина) (структуры V и VI) полностью ингибируют ПЦР в концентрации 10 мМ. Умеренный ингибирующий эффект оказывает аналог эктоина - соль тетрагидропиримидиния VIII.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз