Нormone-producing and growth-stimulating bacteria reduce the level of oxidative stress in salt-stressed wheat plants

Авторы:
Архипова Т.Н. , Кузьмина Л.Ю. , Кудоярова Г.Р.
Название:
Нormone-producing and growth-stimulating bacteria reduce the level of oxidative stress in salt-stressed wheat plants
Страницы:
365-371
скачано
11 раз(а)


Soil salinity inhibits growth of glycophyte plants, to whom cultivated plants belong, resulting in their decreased productivity. The area of salinized soil increases due to aridness of climate and watering, demanding the study of the mechanisms of growth inhibiting action of salinity and an increase in salt resistance. Application of growth promoting bacteria is a mean to increase plant resistance to salinity and the study of the mechanisms of their action attracts great attention. The goal of the present work was in testing suggestion that the increase in salt resistance brought about by growth promoting bacteria is due to plant protection from oxidative stress. We performed bacterization of wheat seeds with phosphate mobilizing bacteria Advenella kashmirensis IB-K1, cytokinins producing Bacillus subtilis IB-22 and Pseudomonas extremaustralis IB-K13-1 characterized by high level of phosphate mobilization and auxins production. Seeds of wheat Omskaya 35 (Triticum aestivum L.) were places into Petri dishes on water or 100 mM NaCl. On the third day of experiment, seedlings were weighted and MDA, proline concentration was estimated. On the background of 100 мМ NaCl, seed treatment with phosphate mobilizing bacteria did not influence the growth of wheat seedlings, whereas the treatment with hormone producing bacteria resulted in positive effect. Presence hormone producing bacteria protected plants from oxidative stress suggested by lower levels of MDA, but the best results were obtained with cytokinins producing bacteria. Maximal accumulation of proline was detected in the plants treated with A. kashmirensis IB-K1 that was 2.5 higher than in the variants with the seed treatment with B. subtilis IB-22 and 1.5 higher in the variant with P. extremaustralis IB K13 1A treatment. It is concluded that the effect of microbial hormones on the reduction of the level of reactive oxygen species and that the increase in growth rate during bacterization of wheat seeds by hormone-producing microorganisms is not associated with proline accumulation.
Введение
Проблема засоления почвы, ее деградация и сокращение в связи с этим пахотных земель является одной из общемировых проблем. При засолении почвы ингибируется рост гликофитных растений, к которым относятся возделываемые культуры, и снижается их урожайность. Из-за усиливающейся аридности климата и применения поливного земледелия площади засоленных почв постоянно растут, что требует изучения механизмов рост-ингибирующего действия засоления и повышения солеустойчивости растений. Интродукция в ризосферу растений рост стимулирующих бактерий является одним из эффективных способов повышения устойчивости растений к засолению [Воеводина, Балакай (Voevodina, Balakai), 2017; Numan et al., 2018]. Однако механизмы защитного действия рост стимулирующих бактерий остаются не до конца понятными. Известно, что большинство стрессовых воздействий, включая засоление, сопровождается оксидативным стрессом и защита от него растений обеспечивает повышение солеустойчивости [Abd-Elgawad et al., 2016]. Вместе с тем, данные литературы свидетельствуют о способности фитогормонов ауксинов и цитокининов индуцировать реакции, направленные на защиту растений от оксидативного стресса, повышая тем самым их стресс-устойчивость [Merewitz et al., 2011; Kim et al., 2013]. Цель данной работы – проверить предположение о том, что повышение солеустойчивости растений при действии гормонпродуцирующих и рост стимулирующих бактерий связано с защитой растений от оксидативного стресса.
Материалы и методы
Объектами исследований служили штаммы из Коллекции микроорганизмов Уфимского института биологии УФИЦ РАН, выделенные из почв сельскохозяйственного назначения (Bacillus subtilis IB22) и из грунтов пещеры Киндерлинская, Республика Башкортостан (Advenella kashmirensis IB-K1 (ВКМ В-3251) и Pseudomonas extremaustralis IBK13-1A (ВКМ В-3249)).
Бактериальные инокуляты для обработки семян получали культивированием штаммов на средах: бактерии рода B. subtilis IB-22 росли на среде К1G [крахмал (10 г/л), кукурузный экстракт, пептон, дрожжевой экстракт (3 г/л каждого), (NH4)2SO4 and KH2PO4 (2 г/л каждого), A. kashmirensis IB-К1 – на среде Г1G (вариант среды К1G, где вместо крахмала была использована глюкоза в той же концентрации) и P. extremaustralis IB-К13-1А на среде Кинг Б [King, 1954]. Штаммы микроорганизмов культивировали в колбах Эрленмейера с соответствующей питательной средой на шейкерах – бациллы в течение 72 ч при температуре 37°С, грамотрицательные бактерии – 48 часов при 28°С. Биомассу отделяли центрифугированием и разводили в стерильной водопроводной воде, создавая плотность инокулята при обработке 105 КОЕ/семя.
Стерилизацию семян мягкой пшеницы сорта Омская 35 (Triticum aestivum L.) проводили их замачиванием в растворе 96% этанола и 3% H2O2 (1:1) в течение 3 минут. Затем, после многократной промывки семян стерильной водопроводной водой, проводили их бактеризацию. Для этого семена обрабатывали необходимым количеством биомассы известного титра с добавлением Na-карбоксиметилцеллюлозы (4%).
Семена пшеницы раскладывали по 20 штук в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 4 мл стерильной водопроводной воды или 100 мМ раствором NaCl. Контролем служил вариант без обработки семян микроорганизмами. Чашки Петри находились в темноте при комнатной температуре в течение трех суток. В конце эксперимента оценивали длину колеоптиля, длину корней, сырую массу проростков, содержание в тканях растений малонового диальдегида (МДА) и пролина. Содержание МДА определяли согласно [Малый практикум по физиологии растений, 1994]. Определение содержания свободного пролина в образцах растений пшеницы (0,2 - 0,3 г проростков) проводили по классическому методу Bates [Bates et all., 1973] в модификации Калинкиной с соавт. [Калинкина и др., 1990] с использованием кислого нингидринового реактива.
Способность штаммов расти при разном градиенте содержания NaCl изучали в жидком бульоне Хоттингера при концентрациях от 1 до 10% с шагом в один процент. Питательную среду засевали клетками 24ч культуры (0.1 мл с титром 106 КОЕ/мл). Через 5 сут оценивали рост штаммов.
Статистическую обработку данных проводили по стандартным программам MS Excel. На рисунке и в таблице представлены средние значения и ошибка средней. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Использованные нами бактерии характеризуются различной способностью к фосфатмобилизации и продукции гормонов: P. extremaustralis IB-K13-1A, наряду с высоким уровнем фосфатмобилизации, способна продуцировать ауксины [Кузьмина и др. (Kuzmina et al.), 2015], B. subtilis IB-22 является цитокининпродуцирующей культурой [Arkhipova et al., 2005], A. kashmirensis IB-K1 имеет высокую фосфатмобилизующую активность (табл. 1). Однако все использованные в работе культуры микроорганизмов можно отнести к галотолерантным бактериям: штамм P. extremaustralis IB-K13-1A мог расти при концентрации соли в среде культивирования до 4 - 5% NaCl, а штаммы B.subtilis IB-22 и A. kashmirensis IB-K1 способны расти при 7% NaCl.
Таблица. 1
Влияние бактеризации семян пшеницы на уровень малонового диальдегида (МДА) и пролина
в 3-х суточных проростках (побег + корень) пшеницы в норме и при засолении (100 мМ NaCl).
Effect of seed bacterization on the MDA and proline content of 3-days old wheat seedlings (shoot + root)
under normal conditions and in the presence of 100 mM NaCl
Обработка семян суспензией клеток    Seed bacterization of microbe biomassМДА, нМ/г сырой массы    MDA, nM/g fresh massКонцентрация пролина, мкМ/г сырой массы    Proline content, μM/g fresh mass
Без добавления NaCl  Without NaCl
Контроль (без бактеризации)    control without treatment31,8+0,2а1,43+0,03а
A. kashmirensis IB-K133,7+0,3а1,77+0,1б
P. extremaustralis IB-K13-1A34,1+0,2а2,53+0,07в
B. subtilis IB-2233,5+1,1а2,36+0,02в
В присутствии 100 мМ NaCl    With 100 мМ NaCl
Контроль (без бактеризации)    control without treatment63,0+0,3в1,79+0,11б
A. kashmirensis IB-K145,8+4,2б в4,06+0,05г
P. extremaustralis IB-K13-1A46,0+0,6б2,49+0,07в
B. subtilis IB-2235,8+3,5а1,66+0,03б
В таблице указаны средние значения и ошибки средней. Значимые различия между средними в столбцах обозначены различными буквами (p≤0,05, ANOVA).
Values are means±SE. Significantly different means in columns are labeled with different letters (p ≤0.05, ANOVA).
Рис. 1. Влияние бактеризации семян фосфатмобилизующей бактерией A. kashmirensis IB-K1, фосфатмобилизующей и ауксинпродуцирующей бактерией P. extremaustralis IB-K13-1A
и цитокинипродуцирующей бактерией B. subtilis IB-22 на рост 3-х суточных проростков пшеницы.
(А) - суммарная длина всех корней, (Б) - длина колеоптиля, сырая масса проростков без
воздействия соли (В) и при 100 мМ NaCl (Г). *Различия средних по сравнению
с контролем без бактеризации достоверны при р ≤ 0.05, t-тест.
Fig. 1. Effect of seed bacterization by phosphate-mobilizing bacteria A. kashmirensis IB-K1, auxin producing bacteria P. extremaustralis IB-K13-1A and cytokinin-producing bacteria B. subtilis IB-22 on the growth of 3-days old wheat seedlings. (A) - sum root length, (B) - shoot length and fresh mass of seedlings without NaCl (С) and with 100 мМ NaCl (D).* The differences in the mean compared to the control without bacterization are significant (p ≤0.05, t-test).
Из рис.1 можно видеть, что обработка семян фосфатмобилизующей бактерией A. kashmirensis IB-K1 не оказывала влияния на рост проростков пшеницы ни на фоне 100 мМ NaCl, ни в отсутствии засоления. В тоже время обработка гормонпродуцирующими бактериями P. extremaustralis IB-K13-1A и B. subtilis IB-22 давала положительный эффект. В отсутствии засоления на этой стадии роста растений пшеницы бактеризация в большей степени повлияла на рост корней, чем побегов: корни стали длиннее на 24% в обоих вариантах бактериальной обработки (P. extremaustralis IB-K13-1A и B. subtilis IB-22) и увеличилась их масса на 21% и 18% соответственно. Прибавка длины и массы побега была максимальной при обработке цитокининпродуцирующей бактерией B. subtilis IB-22 и составила 17% и 15% соответственно, против 14% и 11% при бактеризации семян клетками ауксинпродуцирующей бактерией P. extremaustralis IB-K13-1A. Т.е. мы наблюдали ожидаемое ускорение роста проростков под действием гормонпродуцирующих микроорганизмов.
Присутствие 100 мМ NaCl тормозило рост проростков пшеницы: длина и масса побега была на 40%, а суммарная длина и масса корней на 30% меньше, чем у растений без бактеризации, выращенных на воде. На фоне засоления при обработке семян пшеницы цитокининпродуцирующей бактерией наблюдалось удлинение корней и побегов на 33% и 29%, соответственно и увеличение сырой массы и корней, и побегов на 20%, в то время как присутствие ауксинпродуцирующей бактерии стимулировало только рост корней. Корни в этом случае удлинялись на 30%, а прибавка их сырой массы составила 15%. Следовательно, применение гормонпродуцирующих бактерий в данных условиях на данном этапе развития растений повышает устойчивость растений к засолению.
Общим интегральным процессом, характеризующим негативное действие стрессоров различной природы, включая засоление, является усиление генерации активных форм кислорода (АФК). Активные формы кислорода постоянно генерируются клеточными органеллами в качестве метаболического побочного продукта и функционируют как сигнальные молекулы, но их синтез резко возрастает в стрессовых условиях. АФК являются крайне реакционными и их взаимодействие с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами приводит к нарушению структуры и функции мембран, активности ферментов, мутагенезу и, в итоге, к остановке клеточного цикла и апоптозу [Apel, Hert, 2004]. Интегральным маркером уровня окисидативного стресса, возникающего при нарушении баланса между образованием АФК и их разрушением, считается интенсивность образования малонового диальдегида (МДА) – конечного продукта перекисного окисления липидов. Уменьшение МДА в клетках при стрессе свидетельствует о сохранении липидных компонентов биомембран и о большей устойчивости растений к абиотическим факторам. В нашем эксперименте внесение гормонпродуцирующих ростстимулирующих бактерий защищало растения пшеницы от оксидативного стресса, о чем свидетельствуют более низкие по сравнению с контролем значения концентрации МДА (табл. 1). При засолении наилучшее действие оказывали цитокининпродуцирующие бактерии: уровень МДА в этом случае составил 50% от содержания МДА в контрольных, неинокулированных растениях. При обработке семян ауксинпродуцирующей бактерией уровень МДА составил 70% от контроля. Таким образом, можно сделать вывод о роли гормонов в снижении уровня активных форм кислорода. В литературе есть сведения об опытах с трансгенными растениями со сверхэкспрессией гена YUCCA, кодирующего фермент, обеспечивающий синтез ауксинов, когда было показано, что мутантные растения лучше переносили засуху по сравнению с растениями дикого типа, и авторы объясняют это более эффективной защитой трансгенных растений от оксидативного стресса благодаря повышенной продукции ауксинов [Kim et al., 2013].
В функционировании защитных систем растения значительная роль отводится пролину [Szatados, Savoure, 2009; Carvalho et al., 2013]. Увеличение концентрации пролина при воздействии абиотических стрессовых факторов (засолении, засухе, УФ-облучении, тяжелых металлов и др.) считается универсальной реакцией растений. В настоящее время в литературе преобладает гипотеза о полифункциональных биологических свойствах пролина в растениях в условиях стресса. В нашем эксперименте бактеризация семян увеличивала содержание пролина на 25%, 77% и 65% для A. kashmirensis IB-K1, P. extremaustralis IB-K13-1A и B. subtilis IB-22, соответственно по сравнению с контрольными, неинокулированными растениями в отсутствии засоления (табл. 2). В литературе есть данные о том, что накопление пролина происходит в ответ на инфицирование растений авирулентными патогенами [Fabro et al., 2004], то есть штаммы P. extremaustralis IB-K13-1A и B. subtilis IB-22 можно рассматривать как слабые патогены. При 100 мМ хлоридном засолении у проростков пшеницы, семена которых не обрабатывались бактериями, содержание пролина возросло на 25%. Присутствие A. kashmirensis IB-K1 на фоне засоления приводило к 2,5 кратному увеличению содержания пролина в обработанных растениях по сравнению с контролем. В то время как при обработке семян P. extremaustralis IB-K13-1A уровень пролина был повышенным, но одинаковым в обоих вариантах опыта (в норме и при стрессе), а в присутствии цитокининпродуцирующей бактерии B. subtilis IB-22 содержание пролина на засолении не отличалось от контроля (неинокулированных растений, которые росли в отсутствие засоления). Полученные нами данные согласуются с мнением J. Widodo с соавторами [Widodo et al., 2009] о том, что накопление пролина не всегда коррелирует с повышением скорости роста растений и не является адаптивным ответом на засоление. Таким образом, в наших экспериментах именно в вариантах обработки семян гормонпродуцирующими бактериями наблюдалось их ростстимулирующее действие на фоне засоления, в отличие от бактеризации семян A. kashmirensis IB-K1, проявляющей только фосфатмобилизующую активность.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз