ГЕНОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ БЕЛОГО ФОСФОРА

Наши предыдущие исследования [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2018a; Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2018b] посвящены микробиологическому превращению белого фосфора в биогенный фосфат. Тем не менее, одним из показателей опасности вещества является его генотоксичность, т.е. повреждающее действие на ДНК, увеличивающее частоту мутагенеза и канцерогенеза. Одной из целей представленной работы стало исследование генотоксичности культуральной среды, содержащей белый фосфор и его метаболиты для более углубленного изучения их токсичности вообще.
Генотоксичность белого фосфора определялась при помощи теста Эймса, по методике, описанной в работе [Mortelmans, Zeiger, 2000]. В тесте были использованы индикаторные штаммы Salmonella typhimurium TA1535 (генотип hisG46 rfa uvrB), TA1538 (генотип hisD3052 rfa uvrB). Все эксперименты проводили в трех повторностях. Штаммы имеют мутации в генах гистидинового оперона, в результате чего бактерии не могут расти на среде без гистидина. Однако, если мутагенный агент присутствует, он может вызвать обратные мутации, что приводит к появлению прототрофных ревертантов. Тест Эймса: ночную культуры Salmonella typhimurium (109 клеток/мл) в 0.015 М фосфатном буфере (рН 7.4) инкубировали с тестируемым соединением в диапазоне концентраций при 37°С 90 мин без встряхивания. После инкубации 2.5 мл расплавленного верхнего агара (0.6% агара, 0.6% NaCl, 0.05 мМ L-гистидина, 0.05 мМ биотина, рН 7,4 при 45° С) добавляли в пробирки, и смесь наносили на минимальную агаризованную среду (1.5% агар, среда Фогеля-Боннера, содержащая 2% глюкозы) и инкубировали при 37°С в течение 66 ч. После этого срока подсчитывали число колоний His+ ревертантов, выросших на поверхности агара. В качестве позитивного контроля использовали 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ) для штамма ТА1538, и этилметансульфонат (ЭМС) для TA1535 соответственно. Согласно методике, мутагенной считается та концентрация тестируемого вещества, если число ревертантов в опыте будет выше контрольных значений более чем в два раза. Все эксперименты проводили в трех повторностях.
Для проведения SOS-lux теста на генотоксичность использовалась среда из работы [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2016]. SOS-тест позволяет напрямую определять ДНК-повреждающую активность веществ, т.е. служит дополнением к тесту Эймса, уточняющим оценку генотоксичности. Об активности SOS-регулона в SOS-lux тесте судят по степени биолюминесценции. Для оценки индукции SOS-ответа использовали индикаторный штамм S. typhimurium ТА1535/pDEW238, способный к биолюминесценции, в ответ на ДНК-повреждающие агенты. Штамм получен в результате трансформации штамма S. typhimurium ТА1535 плазмидой pDEW238, которая содержит luxCDABE – оперон под контролем recA промотора. Плазмида предоставлена Rachel Rozen (The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel).
Для оценки индукции SOS-ответа использовали индикаторный штамм S. typhimurium ТА1535/pDEW238, способный к биолюминесценции, в ответ на ДНК-повреждающие агенты.
Эксперимент был выполнен, как описано в работе [Cooper, Lovett, 2011]. Делали серию разведений среды, содержащей вначале 0.2% белого фосфора (2000 мкг/мл). В качестве позитивного контроля использовали митомицин C. Сначала смешивали пополам с культурой сальмонелл, при этом концентрация падала до 1000 мкг/мл. С этой концентрации начинали измерение общей токсичности и генотоксичности. В конце серии разведений доводили концентрацию Р4 до 1 мкг/мл (0.0001%). Ночную культуру штамма, выращенную в питательном бульоне с ампициллином (100,0 мкг/мл), вносили в планшеты по 0,1 мл в лунку и добавляли в каждую раствор среды с Р4 в различных концентрациях. Планшеты Greiner GR-675090. Определяли интенсивность биолюминесценции с помощью микропланшетного ридера Infinite F200 Pro, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряли в относительных световых единицах (ОСЕ) (Relative Light Units, RLU), рассчитанных как число световых единиц в секунду, деленное на оптическую плотность клеточной культуры (OD) при 550 нм.
Определяли интенсивность биолюминесценции с помощью микропланшетного ридера Infinite F200 Pro, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции при 550 нм измеряли в относительных световых единицах (ОСЕ).
Повторный SOS-lux тест провели по аналогичной методике, но в качестве позитивного контроля использовали, помимо митомицина C, пероксид водорода в концентрации, в которой наблюдается наиболее выраженный мутагенный эффект (около 0.03%).
Также, для оценки генотоксического действия белого фосфора использовали тест-систему Allium cepa. Анализ клеток корневой меристемы проводили на микроскопе Axio Observer.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) на временных давленых препаратах после окрашивания ацетокармином [Fiskesjo, 1997]. Предварительно отобранные стандартные луковицы репчатого лука A. cepa проращивали в течение 2-3 дней в стеклянных стаканах. Когда длина корешков достигала 1 см (это условие выполняется для проверки способности луковиц к прорастанию), опытные луковицы на 48 часов помещали в стаканчики объемом 50 мл с белым фосфором в различной концентрации. В качестве контроля использовали отстоянную отфильтрованную водопроводную воду. Затем корешки отрезали ножницами на 1 см от кончика и фиксировали корешки в фиксаторе Кларка (смесь этилового спирта (95%) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Фиксатор мгновенно останавливает жизнедеятельность, в т.ч. клеточные циклы. Материал хранили при температуре +4˚С. Окрашивание проводили оранжевым красителем кармином или красно-фиолетовым орсеином. В каждом препарате учитывали общее количество клеток, количество делящихся клеток из зоны деления корешка, находящихся в той или иной стадии митоза. На основании полученных данных определили митотический индекс (MI), распределение клеток по стадиям митоза. Митотический индекс показывает отношение числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу проанализированных клеток, исследованных на препарате изучаемой ткани. Расчет MI был сделан в соответствии с формулой, приведенной ниже:
MI,%=[[П+М+А+Т] /N]×100,
где [П+М+А+Т] – сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метофазы, анафазы и телофазы. Частота хромосомных аберраций определялась как отношение суммы мутантных клеток с мостами, фрагментами и отставаниями хромосом в опытном варианте к общему количеству ана- и телофаз, выраженное в процентах (ана-телофазный метод учета хромосомных аберраций).
20 мл модифицированной культуральной среды Придхем-Готлиба с концентрацией белого фосфора 0.2% для проведения Allium теста готовили так же, как описано в [Миндубаев и др., 2016 (Mindubaev et al., 2016)].
В «Токсикологическом профиле белого фосфора» за 1997 год [Toxicological profile for white phosphorus, 1997] сообщается об отсутствии генотоксичности данного вещества. Тест проводился на пяти ауксотрофных штаммах сальмонеллы и не выявил увеличение частоты мутаций. Мы решили проверить эти данные, начав с проведения спот-теста (от англ. spot - пятно) – варианта теста Эймса для качественного определения генотоксичности.
Тестирования показали, что среда очень токсична для S. typhimurium TA1535 и TA1538. Они погибают в этой среде даже при ее разбавлении питательным мясным бульоном до 90%. В течение 1 часа плотность популяции падает с 2.47×108 клеток/50 мкл до 10 клеток/50 мкл. Это высокий показатель токсичности. При разбавлении бульоном до 50% через час исходная плотность популяции упала до 4×105 клеток/50 мкл.
Но при внесении капли среды объемом 10 мкл в чашку Петри с посевом сальмонеллы, генотоксичность не проявляется. При разбавлении среды бульоном до концентрации 10% снижение жизнеспособности сальмонелл не наблюдается, т.е. достигнута субвитальная концентрация. При инкубировании в среде штамма ТА1535 в течение 1 часа число мутантов изменилось с 1.19±0.29, до 1.310±0.28. Различия недостоверны. При инкубировании в ней штамма ТА1538 в течение 1 часа число мутантов не выросло, а упало с 10.09±0.81 до 9.0±0.72. В позитивном контроле с мутагеном 2.4-динитрофенилгидразином их число выросло до 22.5±3.1. То есть, генотоксичность у нашей культуральной среды с белым фосфором и его метаболитами, отсутствует.
При внесении в чашку с посевом капли большего объема (50 мкл), в месте падения капли образуется пятно мертвых клеток. Несмотря на то, что капля растекается по дну чашки в круг диаметром 1 см, гибель клеток наблюдается только в месте ее падения. Круги из мутантных клеток, специфичные для теста Эймса, в нашем случае вокруг капли не образовались.
Предположительно, такая картина наблюдается потому, что белый фосфор при нанесении на поверхность агаризованной среды быстро окисляется кислородом воздуха и теряет токсические свойства. Он попадает в среду вместе с каплей локально, но не успевает растекаться по чашке вместе с ней. В норме, в случае более стабильных веществ, вокруг упавшей капли образуется круговая зона подавления, в которой бактерии не растут. Она тем шире, чем токсичнее вещество.
Спустя еще 45 суток провели второй повтор спот-теста. В качестве положительного контроля выступал известный мутаген этилметансульфонат. В этом опыте использовался штамм S. typhimurium TA1535 (у S. typhimurium TA1538 другой тип мутации гистидинового оперона, и реакция на присутствие этилметансульфоната иная). Спот-тест на генотоксичность не показал мутагенной активности препарата белого фосфора, в то время как этилметансульфонат дал характерный рисунок распределения мутантных колоний вокруг точки нанесения мутагена.
В оценке мутагенных и антимутагенных свойств белого фосфора с помощью SOS-lux теста, в качестве контроля использовался противоопухолевый антибиотик митомицин С. Помимо митомицина С, в качестве позитивного контроля использовался другой сильный ДНК повреждающий агент – пероксид водорода. Несмотря на сходный эффект, механизмы мутагенного действия этих веществ различны. Если митомицин С образует аддукты с азотистыми основаниями ДНК, то перекись водорода является окислителем и оказывает разрушительное воздействие на большинство органических веществ, в том числе и нуклеиновые кислоты.
Диаграмма (рис. 1) демонстрирует, что по сравнению с перекисью белый фосфор является слабым ДНК повреждающим агентом. Здесь, однако, следует внести поправку. Концентрация Н2О2 в эксперименте составляла 0.03%, а концентрация белого фосфора 62.5 мкг/мл соответствует 0.00625%. То есть, концентрация Р4 была меньше в 4.8 раза по сравнению с концентрацией перекиси. Поскольку более высокие концентрации белого фосфора оказывают губительное влияние на сальмонелл, достоверно оценивать их генотоксичность сложно. Хотя можно предполагать, что с ростом концентрации ДНК повреждающая активность Р4 должна только возрастать. То есть, следует говорить не о низкой генотоксичности белого фосфора, а о том, что его общая токсичность для клеток намного выше, чем его генотоксичность [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2017]. Наибольшей силы SOS ответ достигает через 6-8 часов после начала эксперимента, поэтому все последующие измерения мы проводили через это время (6 часов после внесения культуры сальмонелл в лунку планшета).
Рис. 1. Сравнение влияния белого фосфора на SOS-индукцию с перекисью водорода и негативным контролем (среда без мутагена). Р4 в концентрации 62.5 мкг/мл является слабым мутагеном, по сравнению с пероксидом.
Р4 в концентрации 1000 мкг/мл убивает культуру за 9 часов эксперимента. В контроле SOS-индукция также незначительно возрастает, что связано с ростом культуры и накоплением ДНК (соответственно,
растет и число ее повреждений даже в отсутствие мутагена).
Fig.1. Comparison of the influence of white phosphorus on SOS-induction with hydrogen peroxide and negative control (medium without mutagen). P4 at a concentration of 62.5 μg / ml is a weak mutagen as compared to the peroxide. P4 at a concentration of 1000 μg / ml kills the culture in 9 hours of the experiment. In the control, SOS-induction also increases insignificantly, which is due to culture growth and accumulation of DNA
(accordingly, the number of its damages grows even in the absence of a mutagen).
В контроле интенсивность люминесценции составила 10026 ОСЕ, в присутствии белого фосфора (100 мкг/мл) до 12590, а в позитивном контроле с антибиотиком составила 45186 ОСЕ. То есть, ДНК повреждающая активность белого фосфора оказалась слабой, но достоверной, и это при разбавлении среды (изначально содержавшей 0.2% Р4) до 5%. При более высоких концентрациях белого фосфора его токсические свойства проявляются сильнее.
Эксперимент с Н2О2 ставился с целью определить антимутагенные свойства белого фосфора. Судя по результатам, антимутагенным действием белый фосфор не обладает. Напротив, наблюдается значительное усиление SOS ответа у смеси белого фосфора с пероксидом по сравнению с одним белым фосфором. Возможно, продукты окисления белого фосфора Н2О2 обладают более выраженной генотоксичностью, чем у исходного Р4.
Тем не менее, исследование генотоксических свойств на том этапе не было завершено. Дело в том, что в качестве тест-объектов применялись прокариоты – бактерии Salmonella typhimurium. Но для оценки генотоксического воздействия вещества на организм человека следует изучать его на эукариотах, к которым относимся мы сами. Идеальными кандидатами на роль тест-объектов являются растения, генетический материал которых устроен так же, как у животных и человека. А одним из самых удобных в этой роли растений является лук репчатый Allium cepa L. (семейство луковые Alliaceae) – растение небольших размеров, неприхотливое, с быстрым жизненным циклом и легкодоступное. Кроме того, у лука репчатого всего 16 хромосом, что облегчает их подсчет, и быстрый клеточный цикл (менее 18 часов у интенсивно делящихся клеток корешков). На основании этих преимуществ был разработан Allium тест на генотоксичность веществ для эукариот. Он позволяет оценивать не столько повреждения отдельных генов (как тест Эймса) или произвольных фрагментов ДНК (как SOS lux тест), сколько повреждения хромосом (хромосомные аберрации) и нарушения расхождения хромосом в ходе клеточного цикла у многоклеточных эукариот (геномные нарушения).
Проведена оценка цитогенетического действия белого фосфора на клетки меристемы корешков лука с помощью Allium-теста. Учитывалась динамика роста корней репчатого лука, то есть оценивалось не только генотоксическое, но и фитотоксическое действие Р4. Кроме этого, оценивался также показатель митозмодифицирующего действия – митотический индекс. Корешки лука в опыте с белым фосфором отставали в росте по сравнению с контролем [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2018с].
Показателем уровня митотической активности тканей является митотический индекс (MI). Индекс указывает на нормальное протекание митоза, на угнетение процесса деления клеток или на усиление митотической активности тканей. На основании этого можно сделать заключение о митотическом или митозстимулирующем действии изучаемого фактора. Зависимое от концентрации ингибирование митотического индекса, наблюдаемое нами, демонстрирует цитотоксический потенциал белого фосфора (Табл. 1). Эти данные были статистически значимыми по сравнению с контролем (р меньше0,001).
Установлено также, что препарат белого фосфора существенно снижает митотическую активность тканей по сравнению с контролем и, следовательно, обладает митотоксической активностью (Табл. 1).
Таблица 1.
Митотический индекс при различных концентрациях белого фосфора
Контроль0.008%0.012%0.016%
Общее число проанализированных клеток6181337844835426
MI7,25±1,153,31±0,882,35±0,651,35±0,25
M/P-метафаза/профаза отношение0,770,720,640,42
% аберрантных клеток (тип аберраций)0,78 (мост)1,79 (отставание)5 (отставание, фрагмент)7,69    (мост)
Table 1. Mitotic index (MI) at different concentrations of white phosphorus
Control0.008%0.012%0.016%
Total number of analyzed cells6181337844835426
MI7,25±1,153,31±0,882,35±0,651,35±0,25
M/P-Metaphase/Prophase ratio0,77        0,72        0,64    0,42    
% of aberrant cells (type of aberration)0,78    (bridge)1,79    (lagging)5    (lagging, fragment)7,69    (bridge)
Анализ соотношений фаз митоза показал увеличение доли клеток на стадии профазы с соответствующим уменьшением процентного отношения других стадий. Это может быть связано с блокировкой деления клеток в конце стадии профазы в результате накопления повреждений генома. Подобное накопление профазных клеток наблюдалось ранее, например, в экспериментах с применением пестицидов [Lamsal et al., 2010]. Поскольку на этой стадии формируется веретено деления, возможно, белый фосфор угнетает его образование.
Данные по частоте клеток с хромосомными аберрациями приведены в таблице 1. Показано, что обработка препаратом белого фосфора при всех тестируемых концентрациях увеличивала процент аберраций хромосом в митотических клетках. При этом, частота митотических аномалий увеличиваются с увеличением концентрации белого фосфора. Обработка белым фосфором при концентрации 0.008 - 0.016%, увеличивала примерно в 10 раз процент клеток с аберрациями по сравнению с контролем. То есть, негативное влияние белого фосфора на расхождение хромосом при митозе очень велико.
Все концентрации были способны индуцировать различные типы хромосомных аномалий. Не было обнаружено какого-либо пропорционального или значительного увеличения или уменьшения количества определенных типов аберраций.

1. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Аккизов А.Ю., Яхваров Д.Г. Оценка генотоксичности белого фосфора. Развитие бактериальной культуры в среде с фосфитом калия в качестве единственного источника фосфора. Бутлеровские сообщения. 2016. Т. 47. №7. С. 1-20. @@ Mindubaev A.Z., Babynin E.V., Voloshina A.D., Validov S.Z., Kulik N.V., Minzanova S.T., Mironova L.G., Akkizov A.Y., Yakhvarov D.G. Evaluation of white phosphorus genotoxicity. Growth of bacterial culture in a medium with potassium phosphite as a sole source of phosphorus. Butlerov Communications. 2016. V. 47. No. 7. P. 1-20. (In Russian).
2. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Сахапов И.Ф., Кулик Н.В., Валидов Ш.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Аккизов А.Ю., Яхваров Д.Г. Генотоксичность белого фосфора. Бутлеровские сообщения. 2017. Т.49. №1. С. 1-20. @@ Mindubaev A.Z., Babynin E.V., Voloshina A.D., Sakhapov I.F., Kulik N.V., Validov S.Z., Minzanova S.T., Mironova L.G., Akkizov A.Y., Yakhvarov D.G. Genotoxicity of white phosphorus. Butlerov Communications. 2017. V. 49. No. 1. P. 1-20. (In Russian).
3. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Пискунов Д.Б., Махиянов А.Н., Бадеева Е.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Акосах Й.А., Волошина А.Д. Цитогенетическое действие белого фосфора. Бутлеровские сообщения. 2018. Т.55. №9. С. 1-21. @@ Mindubaev A.Z., Babynin E.V., Piskunov D.B., Makhiyanov A.N., Badeeva E.K., Minzanova S.T., Mironova L.G., Abayie A.Y., Voloshina A.D. Cytogenetic effect of white phosphorus. Butlerov Communications. 2018. V. 55. No.9. P. 1-21. (In Russian).
4. Миндубаев А.З., Валидов Ш.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г. Рост штамма Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора. Биомика. 2018. Т.10(3). С. 286-289. DOI:10.31301/2221-6197.bmcs.2018-38. @@ Mindubaev A.Z., Validov Sh.Z., Voloshina A.D., Kulik N.V., Minzanova S.T., Mironova L.G. Aspergillus niger АМ1 strain growth in medium with two phosphorus sources. Biomics. 2018. V.10. No3. С. 286-289 (In Russian).
5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Сапармырадов К.А., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Хаяров Х.Р. Резистентность к белому фосфору грибов и стрептомицетов. Биомика. 2018. Т.10. № 2. С. 214-219. DOI:10.31301/2221-6197.bmcs.2018-31. @@ Mindubaev A.Z., Voloshina A.D, Kulik N.V., Saparmyradov K.A., Minzanova S.T, Mironova L.G, Khayarov Kh.R. Resistance to white phosphorus of fungi and streptomycetes. Biomics. 2018. V.10. No. 2. P. 214- 219. (In Russian).
6. Cooper D.L., Lovett S.T. Toxicity and tolerance mechanisms for azidothymidine, a replication gap-promoting agent, in Escherichia coli. DNA Repair (Amst). 2011. Vol. 10. No. 3. Р. 260-270. DOI:10.1016/j.dnarep.2010.11.007
7. Fiskesjo G. Allium test for screening chemical evaluation of cytological parameters. in Wang W., Gorsuch J.W., Hughes J.S. 6005 J.S. (Eds), New York, NY:CRC Lewis Publishers. 1997. P. 307-333.
8. Lamsal K., Ghimire B.K., Sharma P., Ghimiray A.K., Kim S.W., Yu C.Y., Chung I.M., Lee Y.S., Kim J.-S., Shakya S.R. Genotoxicity evaluation of the insecticide ethion in root of Allium cepa L. Afr. J. Biotechnol. 2010. Vol. 9. No. 27. P. 4204-4210.
9. Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research. 2000. Vol. 455. No. 1-2. P. 29-60. DOI:10.1016/S0027-5107(00)00064-6
10. Toxicological profile for white phosphorus. U.S. Department of health and human services. USA. 1997. 248 p.