Генетическое состояние алтайской популяции темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L
Авторы:
Название:
Генетическое состояние алтайской популяции темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L
Страницы:
281-285
Алтайская популяция темной лесной пчелы, наряду с башкирской и орловской, считалась наиболее известной и стабильной. До последнего времени в Алтайском крае предполагалось существование горнотаежной и лесостепной популяций Apis mellifera mellifera L., однако их генофонд требовал ревизии. Установление современного генетического состояния и уровня интрогрессии генов из эволюционной линии С в данной популяции даст возможность определить степень ее сохранности и позволит предпринять меры по улучшению ситуации. Представлены результаты анализа подвидовой принадлежности медоносной пчелы из лесостепной и горнотаежной зон Алтайского края при помощи SSR локусов Ap243, 4a110, А24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 и локуса COI-COII мтДНК. Анализ локуса COI-COII мтДНК подтвердил текущий опасный завоз пчёл эволюционной линии С в лесостепную зону. Кластерный анализ на основе полиморфизма девяти SSR локусов ядерной ДНК выявил уровень интрогрессии С на уровне 0.28. Тогда как в выборках A.m.mellifera из Республики Башкортостан и Пермского края он был лишь на уровне 0.013 и 0.003 соответственно. В то же время относительно низкий показатель гетерозиготности позволяет рассчитывать на возможность восстановления генофонда алтайской популяции тёмной лесной пчелы. Различий между выборками из лесостепной и горнолесной зон не выявлено. Горно-таежная зона Алтайского края представляет собой перспективную территорию для разведения темной лесной пчелы.
Введение
Рост потерь пчелиных семей заставил генетиков и селекционеров обратить особое внимание на устойчивость колоний к окружающей среде, свойственную, в первую очередь, аборигенным популяциям. Для пчеловодства России и Северной Европы в целом наиболее значимым с точки зрения устойчивости является такой подвид как тёмная лесная пчела A.m.mellifera. За последние годы было обнаружено несколько сохранившихся популяций A.m.mellifera: бурзянская и татышлинская - в Республике Башкортостан (РБ), вишерская - в Пермском крае, камбарская - в Республике Удмуртия [Ильясов и др., 2016]. Поиск резерватов продолжается. Большой интерес представляет вопрос о сохранности алтайской популяции, которая в советское время наряду с башкирской и орловской (полесской) считалась наиболее известной и стабильной [Билаш, Кривцов, 1991].
Естественный ареал медоносной пчелы на востоке ограничен Уральскими горами. Впервые в Сибирь, на Алтай в Усть-Каменогорскую крепость 30 колод с пчелами были завезены в 1776 году из Башкирии по ходатайству главного медика пограничных сибирских войск Беренса, однако зимних кормов было оставлено недостаточно, и в период зимовки 1778 года пчелы погибли [Миньков, 1954]. В 1786 году по просьбе полковника Аршеневского пчелы были повторно завезены из Полесья Киевской губернии. Условия оказались благоприятными: пчел стали разводить, а затем и продавать. В итоге линия казацких крепостей между Кузнецком и Бийском стала опорной базой расселения тёмной лесной пчелы в Сибири [Костенков, 1992].
До последнего времени в Алтайском крае предполагалось существование горнотаежной и лесостепной популяций этого подвида [Шунк, 2008], однако их генофонд требовал ревизии. По морфометрическим данным С.Е. Чернышева [Чернышев, 1982] эти популяции в конце прошлого века были гибридными, но сохраняли физиологические и поведенческие особенности пчёл среднерусской породы.
Для установления подвидовой принадлежности алтайских пчел мы проанализировали выборки пчел из лесостепной и горно-таежной зон при помощи SSR локусов Ap243, 4a110, А24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 и локуса COI-COII мтДНК.
Материалы и методы
В исследовании были использованы рабочие пчелы из Алтайского края (N=74 семей), собранные осенью 2017 года в c. Староалейское Третьяковского района (N=27), с. Волчиха Волчихинского района (N=19), урочище Кулемное Чарышского (N=20) района и в г. Барнаул (N=8). Также были использованы данные, полученные в 2003 году для выборки из Шипуновского района (N=12). Город Барнаул, Волчихинский, Третьяковский и Шипуновский районы имеют равнинный рельеф и относятся к лесостепной зоне, тогда как Чарышский район - к горнотаежной. В качестве референтных групп были использованы выборки A.m.mellifera из Бурзянского района РБ (N=123) и Пермского края (N=135), и выборки из Республики Адыгея (A.m.carnica, N=15), Краснодарского края (A.m.caucasica, N=42) и Закарпатской области Украины (A.m.carpatica, N=15), принадлежащие к эволюционной ветви С.
Выделение ДНК проводили набором реактивов ДНК-ЭКСТРАН-2 фирмы Синтол. Исследование включало ПЦР-анализ локуса COI-COII мтДНК и SSR локусов Ap243, 4a110, А24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28. Смесь ПЦР включала 17 мкл дистиллированной воды, 2 мкл магниевого буфера, 0,4 мкл dNTP (10 мкм), 0,6 мкл F- и R-праймеров (2 ОЕ) и 0,3мкл Taq-полимеразы. Режим ПЦР: 5 мин 940С, затем 30 циклов с денатурацией 30 сек при 940С, отжигом 30 сек при 54,50С, элонгацией 60 сек при 720С и конечной элонгацией 7 мин при 720С.
Вычисления показателей генетического разнообразия производили при помощи программ FSTAT ver. 2.9.3.2 и GenePop ver.4.7.0. Для определения генетической структуры популяций медоносной пчелы была использована программа Structure 2.3.4 с заданным числом кластеров от 1 до 10 и от 1 до 5. Количество предполагаемых групп (К) рассчитывали в Structure Harvester. Анализ был выполнен при помощи модели Admixture с указанием информации о географической локализации выборок (LocPrior) и с Burnin Period и MCMC равных 10 000 и 100 000 повторов соответственно. Результаты анализа обрабатывали в CLUMPP 1.1.2 с помощью алгоритма FullSearch.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования представлены на рисунке 1. Анализ локуса COI-COII мтДНК показал встречаемость аллеля Q, характерного для эволюционных линий С и О, с частотой 0.148 в Третьяковском районе и 0.834 в Шипуновском районе, что отражает продолжающийся завоз южных пород в лесостепную зону Алтайского края. В пробах из остальных районов был выявлен аллель PQQ, характерный для A.m.mellifera L., с частотой 1.00.
Рис. 1. Географическая локализация выборок Apis mellifera L. из Алтайского края: TR - выборка из Третьяковского района, VR - выборка из Волчихинского района, ChR - выборка из Чарышского района, BA - выборка из г. Барнаул, ShR - выборка из Шипуновского района
Fig. 1. Geographic localization of samples of Apis mellifera L. from the Altai region: TR - a sample from the Tretyakov district, VR - samples from Volchikhinskiy district ChR - samples from the Charyshsky district, BA - samples from Barnaul, ShR - samples from Shipunovsky district
Кластерный анализ показал наличие двух предполагаемых групп как при заданном числе кластеров от 1 до 10, так и от 1 до 5. Первая группа была образована выборками темной лесной пчелы из РБ и Пермского края. В состав второй группы вошли пчелы из эволюционной линии С. Уровень интрогрессии генофонда линии С в алтайской популяции (рис. 2) составил в среднем 0.28, тогда как в выборках A.m.mellifera из РБ и Пермского края он был лишь на уровне 0.013 и 0.003 соответственно.
Среди выборок, собранных в 2017 году, уровень интрогрессии чужеродного генофонда был приблизительно на одном уровне, как в лесостепной зоне (Волчихинский район - 0.32, Третьяковский - 0.27), так и горнолесной (Чарышский район - 0.30). В выборке из Барнаула интрогрессия составила 0.24, в Шипуновском районе - 0.37 (рис.1). Для сравнения в Польше, на территориях, где разрешается разводить разные породы пчел, уровень интрогрессии составляет 0.32, а на территориях где разрешено содержать только темную лесную пчелу он варьирует от 0.08 до 0.11 [Oleksa et al., 2011]. Среди резерватов тёмной лесной пчелы Западной Европы максимальный уровень интрогрессии наблюдался в датском заказнике - 0.12 [Jensen et al., 2005].
При анализе генетического разнообразия был выявлен дефицит гетерозигот (р = 0.0006). Значение Fis варьировало от -0.219 (Барнаул) до +0.317 (Шипуновский район). Уровень дивергенции Fst (таб.1) между выборками из районов Алтайского края варьировал от 0.0287 между Чарышским и Третьяковским районами до 0.4387 между Барнаулом и Шипуновским районом, что в большей степени отражает географическую удалённость, чем расположение в разных растительных зонах, и также, как и уровень интрогрессии, не подтверждает наличие двух разных популяций.
Таблица 1.
Попарные расстояния Fst между выборками Apis mellifera L., где * - p меньше 0.05, **- p меньше 0.01
Table 1. Pairwise distances of Fst between samples of Apis mellifera, where * - p меньше 0.05, **- p меньше 0.01
TR
VR
ChR
BA
ShR
0.0000
0.0518**
0.0287*
0.1017**
0.2151**
0.0301**
0.1988**
0.1713**
0.1382*
0.2489**
0.4387**
Интересно, что при явной гибридизации алтайской выборки, значения гетерозиготности для неё были относительно невелики: наблюдаемая (Ho) - 0.326, ожидаемая (He) - 0.373. В случае межподвидовой гибридизации гетерозиготность существенно возрастает, в то время как в генетически чистых, естественных популяциях медоносных пчел значения гетерозиготности не превышают 0.3, как, например, в бурзянской (Ho=0.28; Не=0.25) и вишерской (Ho=0.18; Не=0.15) популяциях [Ильясов и др., 2016]. Близкий уровень гетерозиготности в алтайской выборке оставляет надежду на относительно хорошую сохранность генофонда за счёт более жёсткой селекции.
Таким образом, несмотря на преобладание гаплотипа PQQ мтДНК, соответствующего эволюционной линии М, выборка из Алтайского края показала значительный уровень интрогрессии генофонда линии С (обозначено светло-серым на круговой диаграмме, рис. 1), т.е. исследуемая выборка пчел из алтайской популяции представлена в основном гибридами. Не выявлено различий между выборками из лесостепной и горнолесной зон. В тоже время, относительно невысокий уровень гетерозиготности позволяет надеяться на восстановление генофонда алтайской популяции A.m.mellifera при проведении необходимых мероприятий.
Горно-таежная зона Алтайского края представляет собой перспективную территорию для разведения темной лесной пчелы. Природный комплекс из долин и окружающих их гор позволит содержать пасеки на обширных территориях, не опасаясь гибридизации с нежелательными подвидами. В любом случае требуется детальная ревизия пчелиных семей региона на породную принадлежность в сочетании с селекцией по хозяйственно-полезным признакам и мероприятиями по восстановлению генофонда.
Рост потерь пчелиных семей заставил генетиков и селекционеров обратить особое внимание на устойчивость колоний к окружающей среде, свойственную, в первую очередь, аборигенным популяциям. Для пчеловодства России и Северной Европы в целом наиболее значимым с точки зрения устойчивости является такой подвид как тёмная лесная пчела A.m.mellifera. За последние годы было обнаружено несколько сохранившихся популяций A.m.mellifera: бурзянская и татышлинская - в Республике Башкортостан (РБ), вишерская - в Пермском крае, камбарская - в Республике Удмуртия [Ильясов и др., 2016]. Поиск резерватов продолжается. Большой интерес представляет вопрос о сохранности алтайской популяции, которая в советское время наряду с башкирской и орловской (полесской) считалась наиболее известной и стабильной [Билаш, Кривцов, 1991].
Естественный ареал медоносной пчелы на востоке ограничен Уральскими горами. Впервые в Сибирь, на Алтай в Усть-Каменогорскую крепость 30 колод с пчелами были завезены в 1776 году из Башкирии по ходатайству главного медика пограничных сибирских войск Беренса, однако зимних кормов было оставлено недостаточно, и в период зимовки 1778 года пчелы погибли [Миньков, 1954]. В 1786 году по просьбе полковника Аршеневского пчелы были повторно завезены из Полесья Киевской губернии. Условия оказались благоприятными: пчел стали разводить, а затем и продавать. В итоге линия казацких крепостей между Кузнецком и Бийском стала опорной базой расселения тёмной лесной пчелы в Сибири [Костенков, 1992].
До последнего времени в Алтайском крае предполагалось существование горнотаежной и лесостепной популяций этого подвида [Шунк, 2008], однако их генофонд требовал ревизии. По морфометрическим данным С.Е. Чернышева [Чернышев, 1982] эти популяции в конце прошлого века были гибридными, но сохраняли физиологические и поведенческие особенности пчёл среднерусской породы.
Для установления подвидовой принадлежности алтайских пчел мы проанализировали выборки пчел из лесостепной и горно-таежной зон при помощи SSR локусов Ap243, 4a110, А24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 и локуса COI-COII мтДНК.
Материалы и методы
В исследовании были использованы рабочие пчелы из Алтайского края (N=74 семей), собранные осенью 2017 года в c. Староалейское Третьяковского района (N=27), с. Волчиха Волчихинского района (N=19), урочище Кулемное Чарышского (N=20) района и в г. Барнаул (N=8). Также были использованы данные, полученные в 2003 году для выборки из Шипуновского района (N=12). Город Барнаул, Волчихинский, Третьяковский и Шипуновский районы имеют равнинный рельеф и относятся к лесостепной зоне, тогда как Чарышский район - к горнотаежной. В качестве референтных групп были использованы выборки A.m.mellifera из Бурзянского района РБ (N=123) и Пермского края (N=135), и выборки из Республики Адыгея (A.m.carnica, N=15), Краснодарского края (A.m.caucasica, N=42) и Закарпатской области Украины (A.m.carpatica, N=15), принадлежащие к эволюционной ветви С.
Выделение ДНК проводили набором реактивов ДНК-ЭКСТРАН-2 фирмы Синтол. Исследование включало ПЦР-анализ локуса COI-COII мтДНК и SSR локусов Ap243, 4a110, А24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28. Смесь ПЦР включала 17 мкл дистиллированной воды, 2 мкл магниевого буфера, 0,4 мкл dNTP (10 мкм), 0,6 мкл F- и R-праймеров (2 ОЕ) и 0,3мкл Taq-полимеразы. Режим ПЦР: 5 мин 940С, затем 30 циклов с денатурацией 30 сек при 940С, отжигом 30 сек при 54,50С, элонгацией 60 сек при 720С и конечной элонгацией 7 мин при 720С.
Вычисления показателей генетического разнообразия производили при помощи программ FSTAT ver. 2.9.3.2 и GenePop ver.4.7.0. Для определения генетической структуры популяций медоносной пчелы была использована программа Structure 2.3.4 с заданным числом кластеров от 1 до 10 и от 1 до 5. Количество предполагаемых групп (К) рассчитывали в Structure Harvester. Анализ был выполнен при помощи модели Admixture с указанием информации о географической локализации выборок (LocPrior) и с Burnin Period и MCMC равных 10 000 и 100 000 повторов соответственно. Результаты анализа обрабатывали в CLUMPP 1.1.2 с помощью алгоритма FullSearch.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования представлены на рисунке 1. Анализ локуса COI-COII мтДНК показал встречаемость аллеля Q, характерного для эволюционных линий С и О, с частотой 0.148 в Третьяковском районе и 0.834 в Шипуновском районе, что отражает продолжающийся завоз южных пород в лесостепную зону Алтайского края. В пробах из остальных районов был выявлен аллель PQQ, характерный для A.m.mellifera L., с частотой 1.00.
Рис. 1. Географическая локализация выборок Apis mellifera L. из Алтайского края: TR - выборка из Третьяковского района, VR - выборка из Волчихинского района, ChR - выборка из Чарышского района, BA - выборка из г. Барнаул, ShR - выборка из Шипуновского района
Fig. 1. Geographic localization of samples of Apis mellifera L. from the Altai region: TR - a sample from the Tretyakov district, VR - samples from Volchikhinskiy district ChR - samples from the Charyshsky district, BA - samples from Barnaul, ShR - samples from Shipunovsky district
Кластерный анализ показал наличие двух предполагаемых групп как при заданном числе кластеров от 1 до 10, так и от 1 до 5. Первая группа была образована выборками темной лесной пчелы из РБ и Пермского края. В состав второй группы вошли пчелы из эволюционной линии С. Уровень интрогрессии генофонда линии С в алтайской популяции (рис. 2) составил в среднем 0.28, тогда как в выборках A.m.mellifera из РБ и Пермского края он был лишь на уровне 0.013 и 0.003 соответственно.
Среди выборок, собранных в 2017 году, уровень интрогрессии чужеродного генофонда был приблизительно на одном уровне, как в лесостепной зоне (Волчихинский район - 0.32, Третьяковский - 0.27), так и горнолесной (Чарышский район - 0.30). В выборке из Барнаула интрогрессия составила 0.24, в Шипуновском районе - 0.37 (рис.1). Для сравнения в Польше, на территориях, где разрешается разводить разные породы пчел, уровень интрогрессии составляет 0.32, а на территориях где разрешено содержать только темную лесную пчелу он варьирует от 0.08 до 0.11 [Oleksa et al., 2011]. Среди резерватов тёмной лесной пчелы Западной Европы максимальный уровень интрогрессии наблюдался в датском заказнике - 0.12 [Jensen et al., 2005].
При анализе генетического разнообразия был выявлен дефицит гетерозигот (р = 0.0006). Значение Fis варьировало от -0.219 (Барнаул) до +0.317 (Шипуновский район). Уровень дивергенции Fst (таб.1) между выборками из районов Алтайского края варьировал от 0.0287 между Чарышским и Третьяковским районами до 0.4387 между Барнаулом и Шипуновским районом, что в большей степени отражает географическую удалённость, чем расположение в разных растительных зонах, и также, как и уровень интрогрессии, не подтверждает наличие двух разных популяций.
Таблица 1.
Попарные расстояния Fst между выборками Apis mellifera L., где * - p меньше 0.05, **- p меньше 0.01
Table 1. Pairwise distances of Fst between samples of Apis mellifera, where * - p меньше 0.05, **- p меньше 0.01
TR
VR
ChR
BA
ShR
0.0000
0.0518**
0.0287*
0.1017**
0.2151**
0.0301**
0.1988**
0.1713**
0.1382*
0.2489**
0.4387**
Интересно, что при явной гибридизации алтайской выборки, значения гетерозиготности для неё были относительно невелики: наблюдаемая (Ho) - 0.326, ожидаемая (He) - 0.373. В случае межподвидовой гибридизации гетерозиготность существенно возрастает, в то время как в генетически чистых, естественных популяциях медоносных пчел значения гетерозиготности не превышают 0.3, как, например, в бурзянской (Ho=0.28; Не=0.25) и вишерской (Ho=0.18; Не=0.15) популяциях [Ильясов и др., 2016]. Близкий уровень гетерозиготности в алтайской выборке оставляет надежду на относительно хорошую сохранность генофонда за счёт более жёсткой селекции.
Таким образом, несмотря на преобладание гаплотипа PQQ мтДНК, соответствующего эволюционной линии М, выборка из Алтайского края показала значительный уровень интрогрессии генофонда линии С (обозначено светло-серым на круговой диаграмме, рис. 1), т.е. исследуемая выборка пчел из алтайской популяции представлена в основном гибридами. Не выявлено различий между выборками из лесостепной и горнолесной зон. В тоже время, относительно невысокий уровень гетерозиготности позволяет надеяться на восстановление генофонда алтайской популяции A.m.mellifera при проведении необходимых мероприятий.
Горно-таежная зона Алтайского края представляет собой перспективную территорию для разведения темной лесной пчелы. Природный комплекс из долин и окружающих их гор позволит содержать пасеки на обширных территориях, не опасаясь гибридизации с нежелательными подвидами. В любом случае требуется детальная ревизия пчелиных семей региона на породную принадлежность в сочетании с селекцией по хозяйственно-полезным признакам и мероприятиями по восстановлению генофонда.
- Билаш Г.Д., Кривцов Н.И. Селекция пчёл. Москва: Агропромиздат, 1991. 304 с. @@ Bilash G.D., Krivtsov N.I. Selektsiya pchyel. Moscow. Agropromizdat, 1991. 304 p. [Bee Breeding - In Russian]
- Ильясов Р. А., Поскряков А. В., Петухов А. В., Николенко А. Г. Молекулярно-генетический анализ пяти сохранившихся резерватов темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera Урала и Поволжья // Генетика. 2016. Т. 52. № 8. С. 931-942. @@ Ilyasov R.A., Poskryakov A.V., Nikolenko A.G., Petukhov A.V. Molecular genetic analysis of five extant reserves of black honeybee Apis mellifera mellifera in the Urals and the Volga region. Russ. J. Genet. 2016. V.52(8). P.828-839. DOI:10.1134/S1022795416060053
- Костенков П.П. Сибирскому пчеловоду. Барнаул: Веди, 1992. 80 с. @@ Kostenkov P.P. Sibirskomu pchelovodu. Barnaul: Vedi, 1992. 80 s. [For Siberian beekeeper - In Russian]
- Миньков С. Г. Из истории пчеловодства на Алтае // Пчеловодство. 1954. № 3. С. 62-64. @@ Min'kov S. G. Iz istorii pchelovodstva na Altae. Pchelovodstvo. 1954. № 3. S. 62-64. [From the history of beekeeping in Altai - In Russian]
- Чернышов С.Е. Эколого-морфологические особенности и хозяйственная ценность медоносных пчел (На примере Алтайского края): Автореф. дис. ... канд. сельскохоз. наук. - Москва, 1982. 20 с. @@ Chernyshov S.E. Ekologo-morfologicheskie osobennosti i hozjajstvennaja cennost' medonosnyh pchyel (Na primere Altajskogo kraja): Avtoref. dis. ... kand. sel'skohoz. nauk. - Moskva, 1982. 20 s. [Ecological and morphological features and economic value of honey bees (on the example of Altai Krai): author. dis. ... kand. agricultural. sciences. - Moscow, 1982. 20 P. - In Russian]
- Шунк А.А. Ройливость местных пчел Алтая // Пчеловодство. 2008. №4. С.35-37. @@ Shunk A.A. Roylivost' mestnykh pchyel Altaya. Pchelovodstvo. 2008. No4. S.35-37. [Swarming of local bees of Altai - In Russian]
- Jensen A.B., Palmer K.A., Boomsma J.J., Pedersen B.V. Varying degrees of Apis mellifera ligustica introgression in protected populations of the black honeybee, Apis mellifera mellifera, in northwest Europe. Mol. Ecol. 2005. V.14. P. 93-106.
- Oleksa A., Chybicki I., Tofilski A., Burczyk J. Nuclear and mitochondrial patterns of introgression into native dark bees (Apis mellifera mellifera) in Poland. J. Apicult. Res. 2011. V. 50(2). P. 116-129.