Иммунодетекция клеток Azospirillum brasilense в проводящих суспензиях акустическим датчиком


Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/cache/iblock_findfa10a68c85ff5b7c08c31783cdbd7f90.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386
Авторы:
Гулий О.И. , Зайцев Б.Д. , Караваева О.А. , Бородина И.А.
Название:
Иммунодетекция клеток Azospirillum brasilense в проводящих суспензиях акустическим датчиком
Страницы:
181-186
скачано
9 раз(а)


Изучена возможность анализа бактериальных клеток на примере почвенных микроорганизмов Azospirillum brasilense штамма Sp7 при их взаимодействии со специфичными антителами с помощью акустического датчика непосредственно в суспензии с различной начальной электрической проводимостью. Датчик представлял собой двухканальную линию задержки на основе пьезоэлектрической пластины ниобата лития, по которой распространялась поперечно-горизонтальная акустическая волна нулевого порядка. Один канал был электрически свободным, а второй канал - электрически закороченным. Жидкостная ячейка располагалась на пластине таким образом, что суспензия контактировала с поверхностью пластины и охватывала оба канала. Анализ проводился путем измерения временной зависимости фазы и полных потерь выходного сигнала датчика на фиксированной частоте до и после биологического взаимодействия микробные клетки – специфичные антитела. Проводимость буферного раствора менялась от 2.2 до 10 мкСм/см, а минимальная определяемая концентрация микробных клеток составила ~104 кл/мл.
Введение
Важную роль в процессах азотфиксации играют грамотрицательные рост-стимулирующие бактерии рода Azospirillum. Среди азоспирилл наибольшее внимание исследователей привлекает вид Azospirillum brasilense как модельный объект при изучении ассоциативных и эндофитных ризосимбиозов, образуемых бактериями и высшими растениями. Состав и численность ассоциативной микрофлоры зависит от сезонных колебаний и антропогенных воздействий. Поэтому разработка методов, в том числе методов детекции клеток азоспирилл, позволяющих осуществлять мониторинг состава ризосферных бактерий, является одной из актуальных задач современной экологической микробиологии.
Особенность антител (Ат) образовывать специфичные соединения с соответствующими антигенами используется для определения микробных клеток. Исследование взаимодействия антиген-антитело широко применяется в сенсорных системах для детектирования различных видов микроорганизмов. В последнее время активно развиваются исследования по определению микробных клеток с использованием методов электроакустического анализа.
Принцип действия электроакустических методов анализа основан на регистрации биологических взаимодействий непосредственно в жидкой суспензии, контактирующей с поверхностью пьезоэлектрика. Существует два типа акустических биологических датчиков, для анализа бактерий непосредственно в суспензии без использования иммобилизованных микроорганизмов. Первый тип основан на использовании пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем. При добавлении соответствующих реагентов (антитела, бактериофаги и фаговые антитела) происходит изменение проводимости суспензии клеток, что приводит к соответствующему изменению регистрируемых характеристик резонатора [Pinkham et al., 2005; Wark et al., 2007; Maurer, Gujer, 1995; Zaitsev et al., 2012; Гулий и др. (Guliy et al.), 2012; 2016]. Второй тип биологических акустических датчиков основан на использовании акустической волны, распространяющейся вдоль пьезоэлектрической пластины. Добавление вышеупомянутых специфичных реагентов в суспензию клеток, приводящее к изменению ее проводимости, изменяет полные потери и фазу выходного сигнала такого датчика [Borodina et al., 2015].
Важным обстоятельством является определение микробных клеток в реальных образцах с различной электрической проводимостью. Электрическая проводимость определяется неорганическими ионами калия, натрия, хлора, карбонатов, фосфатов, а также ионами органических кислот, белков и других органических соединений. Высокая проводимость среды значительно затрудняет возможность определения клеток при их взаимодействии с антителами. Ранее нами была показана возможность определения микробных клеток при их взаимодействии с антителами акустическим датчиком, при этом проводимость среды измерения не превышала 2 мкСм/см [Гулий и др. (Guliy et al.), 2015; Borodina et al., 2015].
Целью данной работы являлось исследование возможности определения микробных клеток на примере почвенных микроорганизмов Azospirillum brasilense штамма Sp7 при их взаимодействии со специфичными антителами в растворах с различной электрической проводимостью при помощи акустического датчика, основанного на использовании акустической волны, распространяющейся вдоль пьезоэлектрической пластины.
Материалы и методы исследования
Микробные клетки
В работе использовали Azospirillum brasilense штамм Sp7 (IBPPM 150) и Escherichia coli XL-1, полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН.
Культивирование микроорганизмов
Для культивирования бактерий использовали жидкую питательную среду LB следующего состава (г/л): NaCl (Becton Dickinson and Co, США) – 5.0; пептон (Becton Dickinson and Co, США) – 10.0; дрожжевой экстракт (Difco, США) – 5.0. Твердая среда LB содержала 3% агар-агара.
Культуры бактерий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB. Клетки инкубировали на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин в течение 18-20 ч при 30±1°С.
Используемые растворы
В работе использовали стандартный буферный раствор с величиной рН, равной 7.0. Были использованы образцы раствора с проводимостью 2.4; 5.0; и 10 мкСм/см.
Электропроводность определяли с помощью кондуктометра HANNA HI 8733 (США).
Антитела
Для получения антител, специфичных к соматическим антигенам бактерий, использовали методику иммунизации животных целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными 2%-ным раствором глутарового альдегида (ГА). Культуру клеток выращивали в течение 18 ч на жидкой синтетической среде, отделяли центрифугированием, дважды отмывали в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) и переносили в тот же буфер, содержащий 2% ГА. Полученную суспензию хранили при +4°С. Непосредственно перед иммунизацией клетки дважды отмывали в ЗФР. Для иммунизации использовали суспензии клеток с оптической плотностью А660=0.5 в кювете толщиной l=1см, что соответствует их концентрации примерно 109 кл/мл. Животных иммунизировали 6 раз ежедневно внутривенным введением суспензий клеток объемом от 0.4 до 1.6 мл. Спустя неделю инъекции повторяли 4 раза (ежедневно), используя по 2 мл суспензии. Отбор крови проводили через 6 суток после последней иммунизации [Матора и др. (Matora et al.), 1998]. Антитела для работы любезно предоставил сотрудник лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН к.б.н., с.н.с. Г.Л. Бурыгин.
Проведение анализа с помощью электроакустического датчика
Исследование возможности регистрации биологических взаимодействий в проводящей суспензии проводилось с помощью двухканальной акустической линии задержки на основе пьезоэлектрической пластины Y-X ниобата лития толщиной 0.2 мм. Методом фотолитографии были нанесены две пары встречно–штыревых преобразователей (ВШП) для возбуждения и приема акустической волны с поперечно-горизонтальной поляризацией нулевого порядка в каждом канале. Один из каналов линии задержки был электрически закорочен путем нанесения слоя алюминия на поверхность между ВШП, второй канал оставался электрически свободным. Жидкостной контейнер для суспензии объемом ~5 мл был закреплен на поверхности пластины между ВШП с помощью клея, не вносящего потери. Указанный датчик подключался к 4 портовому измерителю S параметров типа Е5071С (Agilent). Методика детекции микробных клеток с помощью данного датчика основывалась на измерении временных зависимостей фазы и полных потерь выходного сигнала каждого канала датчика на фиксированной частоте 3.3 МГц (частота минимальных потерь) до и после взаимодействия микробных клеток с антителами.
Процесс измерения состоял из следующих этапов:
I – в измерительную ячейку вносили суспензию микробных клеток с заданной концентрацией и проводимостью и измеряли временные зависимости фазы и полных потерь выходного сигнала каждого канала на фиксированной частоте 3.3 МГц;
II – в измерительную ячейку вносили специфичные/неспецифичные антитела при продолжающемся измерении временных зависимостей фазы и полных потерь выходного сигнала каждого канала;
III – проводили анализ полученных данных относительно взаимодействия антител с микробными клетками. При этом наблюдались следующие ситуации:
III (а) – если антитела взаимодействовали с микробными клетками, значения регистрируемых параметров для суспензий клеток с антителами и без них значительно различались;
III (б) – если антитела не взаимодействовали с микробными клетками, то значения регистрируемых параметров для суспензий клеток с антителами и без них практически не различались.
Результаты и их обсуждение
Исследование проводилось на примере клеток A. brasilense Sp7 и О-специфичных антител в буферных растворах с проводимостью 2.4 – 10 мкСм/см. Исследовались суспензии с концентрацией клеток 104, 106 и 108 кл/мл при концентрации антител 2.2 мкг/мл. Выбор данной концентрации антител был обусловлен ранее проведенными исследованиями [Гулий и др. (Guliy et al.), 2013]. Зависимости изменения полных потерь и фазы выходного сигнала датчика вследствие добавления специфичных антител от проводимости буферного раствора представлены на рисунке 1 для клеток c концентрацией 104, 106 и 108 кл/мл.
Из представленных данных видно, что во всех случаях изменения полных потерь и фазы выходного сигнала датчика в случае свободного канала линии задержки значительно превышают по величине изменения этих параметров для закороченного канала. Представленные зависимости позволили подтвердить сделанный ранее вывод о том, что специфичное взаимодействие приводит к существенному увеличению проводимости суспензии клеток [Borodina et al., 2015].
Рисунок 1. Зависимости изменения полных потерь (а, в, д) и фазы (б, г, е) выходного сигнала датчика от проводимости буферного раствора при специфичном взаимодействии «бактериальные клетки A. brasilense Sp7 - антитела». Пунктирная и сплошная кривые относятся к электрически свободной и электрически
закороченной поверхностям линии задержки, соответственно, при концентрации
клеток - 104 кл/мл (а, б), 106 кл/мл (в, г) и 108 кл/мл (д, е)
Согласно литературным данным, поверхностный заряд клеток зависит от целостности клеточных мембран. Повреждение мембран микробных клеток ионами буферного раствора приводит к понижению клеточного потенциала [James, 1982].
В свою очередь, повреждение клеточных мембран, связанное с возрастанием их проницаемости, а, следовательно, и пассивного транспорта между внутри- и внеклеточными пространствами, приводит к понижению трансмембранных разностей потенциалов согласно уравнению Гольдмана. Помимо уменьшения заряда клеток при повреждении их мембран под действием буферного раствора с высокой ионной силой происходит снижение мембранных потенциалов клеток и дегидратации бактерий и, соответственно, поступлением во внеклеточную среду содержимого клетки. С увеличением проводимости буферного раствора количество клеток с поврежденными мембранами увеличивается. Вероятно, что появление в измеряемой суспензии содержимого цитоплазмы микробных клеток приводит к дополнительному увеличению проводимости среды и этим объясняется некоторое уменьшение аналитического сигнала при проводимости буферного раствора выше 10 мкСм/см.
Дополнительно проводился эксперимент, в ходе которого в суспензию микробных клеток E. coli XL-1 добавлялись поликлональные Ат, специфичные только в отношении клеток A. brasilense Sp7. Было установлено, что в этом случае практически не происходило изменение полных потерь и фазы выходного сигнала датчика. (рис. 2 а, б).
Рисунок 2. Зависимости изменения полных потерь (а) и фазы (б) выходного сигнала датчика от
проводимости буферного раствора при неспецифичном взаимодействии «бактериальные
клетки E. coli XL-1 – антитела, специфичные к клеткам A. brasilense Sp7».
Пунктирная и сплошная кривые относятся к электрически свободной и электрически закороченной поверхностям линии задержки, соответственно. Концентрация бактериальных клеток составляет 104 кл/мл.
Таким образом, в работе показана возможность детекции клеток азоспирилл при использовании специфичных антител с помощью биологического датчика на основе поперечно-горизонтальной волны в тонкой пластине ниобата лития. Установлено, что изменения полных потерь и фазы выходного сигнала датчика в результате специфичного взаимодействия «бактериальные клетки - антитела» при прочих равных условиях более значительны для электрически открытого канала линии задержки по сравнению с электрически закороченным каналом. Это означает то, что специфичное взаимодействие бактериальных клеток с антителами приводит к существенному увеличению проводимости суспензии. Степень изменения выходных параметров датчика зависит от концентрации клеток, что открывает возможность проведения не только качественного, но и количественного анализа бактерий. Полученные результаты показали хорошую чувствительность и быстродействие датчика. При этом нижний предел детекции составляет 104 кл/мл при проводимости буфера не более 10 мкСм/см.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQLf726b743ab0857ed64066a7f31029441.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQL/b_lang7f07e942ce4c4dc665a233e3d8a79a75.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQL/b_lang_domaineeee9d3fd34522c8c21ed916540b4801.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQL50171b5823ef22b327374dfdd115317e.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQLb507d952a91648662e356e17b7503651.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQL/b_lang_domain0b56006cb948b6e2434d84bd5f22215d.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQLc7fc26714ad23f77e3ecc598c9fef6ed.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQL/b_task_operationd0c460dd839d39090f8ac93d043dc917.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386

Warning: fopen(/home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/managed_cache/MYSQLf9abf7ff97c5a57a387b47983d114075.tmp): failed to open stream: Disk quota exceeded in /home/c/co83925/biomicsj.ru/public_html/bitrix/modules/main/lib/data/cacheenginefiles.php on line 386