Исследование мажорных антигенов клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum и их вклад в растительно-микробные взаимодействия

Литературные данные и наши результаты изучения структуры и свойств поверхностных антигенов ризосферных бактерий позволяют констатировать высокую эффективность иммунохимического анализа не только в традиционной для него области биомедицинских исследований, но также и для изучения фундаментальных основ взаимодействий между растениями и почвенными микроорганизмами, участниками других коммуникаций, представляющих интерес для биотехнологии, ветеринарии и др. Его главным инструментом являются высоко специфичные антитела (Ат), получению которых, начиная с работы [Матора и др. (Matora et al.), 1998], посвящен ряд наших исследований, в том числе с применением нанобиотехнологий [Dykman, Khlebtsov, 2017]. В них используются активные взаимодействия с клетками иммунной системы конъюгатов наночастиц с различными антигенами, проявляющиеся, в частности, в обнаруженных адъювантных свойствах коллоидного золота [Dykman et al., 2010]. Этот эффект находит применение, прежде всего, для решения проблем получения Ат на слабоиммуногенные бактериальные, растительные и животные антигены, но имеет также перспективу в развитии нанобиотехнологий получения вакцин нового поколения [Dykman, Khlebtsov, 2017].
В настоящее время мы располагаем Ат к поверхностным компонентам 27 штаммов 11 видов 7 родов ассоциативных бактерий – белковым и углеводным бактериальным структурам, выполняющим ключевую роль в растительно-микробных взаимодействиях на стадии формирования и функционирования ассоциативного симбиоза в ризосфере растений. Разработанная серологическая тест-система [Bogatyrev et al., 1992] обеспечивает создание системы серотипирования Azospirillum, на данном этапе с 74 штаммами бактерий этого рода, распределенными по трем серогруппам. Изучаются корреляции серологических данных с результатами анализа химического строения О-специфического полисахарида [Сигида и др. (Sigida et al.), 2014], таксономическими характеристиками штаммов [Щеголев (Shchyogolev), 2018], что может стать важным этапом их системного анализа, отражающим связь установленных фено(серо)типов с эволюционной историей бактерий рода азоспирилл.
Рис. 1. Структура повторяющегося звена полисахаридного фрагмента (А) [Belyakov et al., 2012]
и фолдинг полипептидной основы (Б) флагеллина полярного жгутика A. brasilense Sp7.
Fig. 1. Structure of the repeating unit of the polysaccharide fragment (А) [Belyakov et al., 2012] and the main polypeptide chain folding (Б) of the A. brasilense Sp7 polar flagellum flagellin.
Для модельных штаммов A. brasilense продемонстрирована структурная и антигенная гетерогенность их О-антигена [Матора и др. (Matora et al.), 2008], у ряда штаммов азоспирилл констатировано отсутствие индивидуального капсульного антигена [Матора, Щеголев (Matora, Shchyogolev), 2002]. Анализ химического строения гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 показал наличие в его составе нескольких полисахаридных цепей, иммунохимически идентичных липополисахариду (ЛПС) данных бактерий [Belyakov et al., 2012]. Методом гомологичного моделирования (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER) впервые определена 3D структура протеиновой основы флагеллина азоспирилл (рис. 1Б) с использованием аминокислотной последовательности белка (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_059398886.1). Впервые методом иммуноэлектронной микроскопии на поверхности бактерий рода Azospirillum выявлены белковые пилеподобные структуры, см. пример на рисунке 2 для штамма SK048, являющегося мутантом A. brasilense Sp245, лишенным полярного жгутика.
Рис. 2. Иммуноэлектронная микроскопия клеток
Gri+ мутанта A. brasilense SK048 с использованием родоспецифичных Ат на поверхностные белковые детерминанты, меченных сферическими наночастицами золота (диаметр 15 нм)
Fig. 2. Immune electron microscopy of the A. brasilense SK048 Gri+ mutant cells made with the use of the genus specific antibodies to protein surface determinants labelled with the gold spherical nanoparticles
(diameter 15 nm).
Рис. 3. ИФА образцов почв Саратовской области
с антителами на ЛПС A. brasilense штаммов Sp245 (светлая окраска) и Sp7 (темная окраска).
Fig. 3. The enzymoimmunoassay of the soil samples from Saratov region with the use of antibodies to A. brasilense lipopolysaccharides of Sp245 (light dye) and Sp7 (dark dye) strains.
На основе иммуноферментного анализа (ИФА) с полученными специфическими Ат разработаны приемы определения распространенности азоспирилл в образцах почв [Красов и др. (Krasov et al.), 2009; Широков и др. (Shirokov et al.), 2015], позволившие оценить динамику численности интродуцированных в почву бактерий и выявить наличие антигенов азоспирилл в течение вегетативного сезона в 6 типах почв Саратовской области. Оценка их распространенности в различных почвах (рис. 3) впервые выявила более значительный вклад серотипа Sp245 по сравнению с серотипом Sp7 среди азоспирилл, представленных в микробиоме почв Саратовской области. Была исследована способность разных штаммов к колонизации корней растений, выявлены стимулирующие эффекты бактерий и их изолированных поверхностных компонентов по морфометрическим и цитологическим показателям растений. Продемонстрирована роль и оценён вклад ЛПС, флагеллина и белковых пилеподобных структур азоспирилл в бактериальную колонизацию растений и индукцию рост-стимулирующих эффектов [Evseeva et al., 2011]. Впервые для ассоциативных бактерий обнаружено положительное влияние изолированного флагеллина полярного жгутика A. brasilense Sp245 на пролиферативную активность проростков пшеницы, что иллюстрируют результаты, представленные в таблице 1.
Таблица 1.
Митотический индекс проростков пшеницы, обработанных препаратом изолированного флагеллина полярного жгутика штамма A. brasilense Sp245
Обработка Митотический индекс, %
Время после инокуляции, сутки
1 3 7
Препаратом флагеллина Sp245 5,6+0,6 6,3+0,6 6,7+0,6
Контроль (без добавок) 3,7+0,4 3,9+0,4 5,2+0,6
Проводятся работы по выделению и идентификации новых ризосферных бактериальных штаммов-симбионтов растений (представителей родов Ochrobactrum, Acinetobacter, Ensifer, Enterobacter, Kocuria и др.) с оценками их рост-стимулирующего потенциала [Бурыгин и др. (Burygin et al.), 2017; Щеголев, Бурыгин (Shchyogolev, Burygin), 2018].

1. Бурыгин Г.Л., Попова И.А., Каргаполова К.Ю., Ткаченко О.В., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Бактериальный изолят из ризосферы картофеля (Solanum tuberosum L.), идентифицированный как Ochrobactrum lupini IPA7.2. Сельхозяйственная биология. 2017. Т. 52, №1. С. 105-115. @@ Burygin G.L., Popova I.A., Kargapolova K.Yu., Tkachenko O.V., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. A bacterial isolate from the rhizosphere of potato (Solanum tuberosum L.) identified as Ochrobactrum lupini IPA7.2. Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya 2017. Vol. 52, № 1. P. 105-115. DOI:10.15389/agrobiology.2017.1.105rus (In Russian).
2. Красов А.И., Попова И.А., Филипьечева Ю.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Применение иммуноферментного анализа для выявления азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum в почвенных суспензиях. Микробиология. 2009. Т.78, № 5. С. 662-666. @@ Krasov A.I., Popova I.A., Filip’echeva Y.A., BuryginG.L., Matora L.Y. Application of enzyme immunoassay for detection of the nitrogen-fixing bacteria of the genus Azospirillum in soil suspensions. Microbiology. (Microbiologiya) 2009. V. 78. P. 598-602. DOI:10.1134/S0026261709050117 (In Russian).
3. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense. Микробиология. 1998. Т. 67(6). С. 815-820.@@ Matora L.Yu., Shvartsburd B.I., Shchegolev S.Yu. Immunochemical analysis of O-specific polysaccharides of soil nitrogen-fixing bacteria Azospirillum brasilense. Mikrobiologiya. 1998. V. 67. P. 815-820. DOI:10.1023/A:1015146104397 (In Russian).
4. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense. Микробиология. 2002. Т. 71, №2. С. 211-214.@@ Matora L.Yu., Shchegolev S.Yu. Antigenic identity of the capsule lipopolysaccharides, exopolysaccharides, and O-specific polysaccharides in Azospirillum brasilense. Microbiology (Microbiologiya.). 2002. V. 71. P. 178-181. doi:10.1023/A:1015146104397 (In Russian).
5. Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Исследование иммунохимической гетерогенности липополисахаридов Azospirillum brasilense. Микробиология. 2008. Т. 77, № 2. С. 196-200. @@ Matora L.Yu, Burygin G.L., Shchyogolev S.Yu. Study of immunochemical heterogeneity of Azospirillum brasilense lipopolysaccharides. Microbiology (Microbiologiya.). 2008. V. 77. P. 166-170.] DOI:10.1134/S0026261708020070 (In Russian).
6. Сигида Е.Н., Федоненко Ю.П., Здоровенко Э. Л., Бурыгин Г.Л., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липополисахаридов бактерий рода Azospirillum, отнесенных к серогруппе II. Микробиология. 2014. Т. 83. №. 4. С. 416-416.@@ Sigida E.N., Fedonenko Y.P., Zdorovenko E.L., Burygin G.L., Konnova S.A., Ignatov V.V. Characterization of the lipopolysaccharides of serogroup II Azospirillum strains. Microbiology (Microbiologiya). 2014. V.83. P.326-334. DOI:10.7868/S0026365614040156 (In Russian).
7. Широков А.А., Красов А.И., Селиванов Н.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Иммунохимическое выявление бактерий рода Azospirillum в почве с помощью родоспецифичных антител. Микробиология. 2015. Т. 84, № 2. С. 244-249. @@ Shirokov A.A., Krasov A.I., Selivanov N.Y., Burygin G.L., Shchyogolev S.Y., Matora L.Y. Immunochemical detection of Azospirilla in soil with genus-specific antibodies. Microbiology (Microbiologiya). 2015. V. 84. P. 263-267. DOI:10.7868/S0026365615020135 (In Russian).
8. Щеголев С.Ю. О систематике прокариот: актуальные проблемы и пути выхода из кризиса. Вестник физико-химической биологии и биотехнологии. 2018. Т. 14(1). C.5-14. @@ Shchyogolev S.Yu. On prokaryote systematics: topical problems and ways out of the crisis. Yu.A. Ovchinnikov bulletin of biotechnology and physical and chemical biology. 2018. V.14(1). P.5-14. (In Russian).
9. Щеголев С.Ю., Бурыгин Г.Л. Опыт применения современных подходов к геносистематике прокариот в таксономических исследованиях ризосферной микрофлоры. Биомика. 2018. Т. 10(2). С.156-160. DOI:10.31301/2221-6197.bmcs.2018-21 @@ Shchyogolev S.Yu., Burygin G.L. Application of modern approaches to genetic systematics of prokaryotes in taxonomic studies of rhizosphere microflora. Biomics. 2018. V.10(2). P.156-160. DOI:10.31301/2221-6197.bmcs.2018-20 (In Russian)
10. Belyakov A.Ye., Burygin G.L., Arbatsky N.P., Shashkov A.S., Selivanov N.Y., Matora L.Y., Knirel Y.A., Shchyogolev S.Y. Identification of an O-linked repetitive glycan chain of the polar flagellum flagellin of Azospirillum brasilense Sp7. Carbohydr. Res. 2012. V. 361. P. 127-132. DOI:10.1016/j.carres.2012.08.019
11. Bogatyrev V.A. Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting. FEMS Microbiol. Lett. 1992. Vol. 96. P. 115-118. DOI:10.1111/j.1574-6968.1992.tb05402.x
12. Dykman L.A., Staroverov S.A., Bogatyrev V.A., Shchegolev S.Yu. Gold nanoparticles as an antigen carrier and an adjuvant. New-York: Nova Sci. Publ., 2010. 54 p.
13. Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Gold Nanoparticles in Biomedical Applications. Boca Raton: CRC Press, 2017. 332 p.
14. Evseeva N.V., Matora L.Yu., Burygin G.L., Dmitrienko V.V., Shchyogolev S.Yu. Effect of Azospirillum brasilense Sp245 lipopolysaccharide on the functional activity of wheat root meristematic cells. Plant Soil. 2011. V. 346. P. 181-188. DOI:10.1007/s11104-011-0808-9