Участие цитокининов в начальных этапах эмбриоидогенеза in vitro в зародышевых каллусах яровой мягкой пшеницы

Авторы:
Галин И.Р. , Зайцев Д.Ю. , Сельдимирова О.А. , Круглова Н.Н.
Название:
Участие цитокининов в начальных этапах эмбриоидогенеза in vitro в зародышевых каллусах яровой мягкой пшеницы
Страницы:
141-146
скачано
34 раз(а)


Изучали иммунолокализацию цитокининов на начальных этапах эмбриоидогенеза in vitro в зародышевых каллусах пшеницы сорта Башкирская 26. Установлено, что на стадии индукции эмбриоидогенеза цитокинины локализовались преимущественно в морфогенетических очагах и меристематической зоне, клетки которой представляют собой инициали эмбриоидов. В фазе бластомеризации цитокинины равномерно распределялись в клетках апикальной части раннеглобулярного собственно эмбриоида, а также обнаруживались в гипофизе. В позднеглобулярном эмбриоиде цитокинины определялись в клетках собственно эмбриоида, преимущественно в его апикальной части. Обсуждается роль цитокининов в создании позиционной информации, необходимой для дифференциации клеток эмбриоида и инициации в нем органов.
Введение
Эмбриогенез как совокупность протекающих в развивающемся организме сопряженных процессов образования специализированных тканей и органов, ведущих к формированию целого организма, остается одной из сложнейших проблем биологии развития растений. Определяющая роль в регуляции эмбриогенеза отводится фитогормонам. Роль гормонов в эмбриогенезе изучается с середины прошлого века, и публикации на эту тему не иссякают до сих пор, при этом доминируют исследования роли ауксинов, особенно на ранних этапах эмбриогенеза [Hamann, 2001; Chen et al, 2010; De Smet et al., 2010; Robert et al., 2015], которые рассматриваются как критические [Батыгина (Batygina), 2014]. В то же время, данные о роли цитокининов в эмбриогенезе малочисленны и ограничиваются, как правило, сведениями о роли этих гормонов в развитии апикальной меристемы побега [Shani et al., 2006; De Smet et al., 2010; Su et al., 2011].
Следует отметить, что исследования эмбриогенеза растений in vivo затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий. Удобной моделью для изучения различных аспектов эмбриогенеза in vivo, в том числе и гормональных, может служить эмбриоидогенез (соматический эмбриогенез) in vitro – формирование и развитие зародышеподобных структур (эмбриоидов) из соматических клеток/групп клеток, осуществляемое в строго контролируемых экспериментальных условиях in vitro, в том числе в каллусных культурах [Zimmerman, 1993; Носов (Nosov), 1999; Somatic Embryogenesis .., 2016; Winkelmann, 2016].
Цель работы состояла в изучении иммунолокализации цитокининов на ранних этапах эмбриоидогенеза in vitro в зародышевых каллусах яровой мягкой пшеницы.
Материал и методы исследования
Объектом исследования послужили зародышевые эмбриоидогенные каллусы яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Башкирская 26. Донорные растения выращивали в полевых условиях научного стационара Уфимского Института биологии УФИЦ РАН (Уфимский район). В качестве эксплантов для индукции каллуса использовали незрелые зародыши на 13-15 сутки после массового цветения. Получение зародышевых эмбриоидогенных каллусов и индукцию в них эмбриоидогенеза проводили согласно [Круглова, Сельдимирова (Kruglova, Seldimirova), 2011]. Экспланты высаживали на среду, содержащую макро-, и микросоли и витамины по прописи Мурасиге-Скуга [Murashige, Skoog, 1962] и дополненную 2.0 мг/л 2,4-Д и 0.2 мг/л кинетина, и культивировали в темноте при 26ºС в течение 4 недель. Для индукции эмбриоидогенеза полученные каллусы пересаживали на безгормональную среду Мурасиге-Скуга и культивировали при 26°C, 16-часовом фотопериоде, освещении 16000 люкс.
Иммунолокализацию цитокининов проводили, как описано в работе [Seldimirova et al., 2016]. Образцы фиксировали в 2 мл раствора 4% парафармальдегида и 0.1 % глютарового альдегида под вакуумом в течение 3.5 часов, отмывали в 0.1 М фосфатном буфере (рН=7.3), обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, заключали в метакрилатную смолу JB-4 (Electron Microscopy Sciences, США). Полутонкие срезы готовили при помощи микротома HM 325 (Microm, Германия).Для выявления цитокининов на срезы наносили анти-ZR сыворотку кролика в рабочем разведении, инкубировали во влажной камере 2 часа, промывали фосфатным буфером, содержащим Tween 20. Затем срезы обрабатывали меченными коллоидным золотом иммуноглобулинами козы против антител кролика (BioCell, Великобритания), инкубировали во влажной камере 1 час, промывали фосфатным буфером, содержащим Tween 20 и обрабатывали препаратом серебра для усиления окрашивания (BioCell, Великобритания).
Препараты просматривали с применением микроскопа проходящего света Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Германия).
Результаты и обсуждение
Ранее нами [Сельдимирова и др. (Seldimirova et al.), 2011; Seldimirova, Kruglova, 2013] при анализе данных детального цито-гистологического анализа путей морфогенеза in vitro зародышевых и пыльниковых каллусов пшеницы различных сортов было установлено, что начальный этап всех путей универсален и состоит в обособлении в каллусе зоны меристематических клеток с плотной цитоплазмой и центральным расположением ядра, характеризующихся интенсивными делениями. Эти клетки четко отличаются от остальных клеток каллуса, которые приобретают паренхиматозные признаки – увеличиваются в размерах и становятся сильновакуолизированными. Зона меристематических клеток была обозначена нами как морфогенетический очаг.
В настоящей работе такие морфогенетические очаги также выявлены в зародышевых каллусах изучаемого сорта пшеницы. Методом иммунолокализации установлено, что цитокинины локализуются преимущественно в клетках такого очага, отличающихся от других клеток каллуса интенсивным иммуногистохимическим окрашиванием (рис. 1а).
В ходе дальнейшего развития морфогенетические очаги преобразовываются в поверхностную меристематическую зону, клетки которой являются инициальными клетками эмбриоидов. Установлено, что цитокинины преимущественно локализуются именно в клетках меристематической зоны, тогда как паренхиматозные клетки периферической и внутренних зон каллуса не демонстрируют специфическую окраску на цитокинины (рис. 1б).
Рис. 1. Иммунолокализация цитокининов в клетках морфогенетического очага (а) и меристематической зоны (б) зародышевого каллуса пшеницы. Масштаб: (а) – 100 мкм, (б) – 200 мкм. Условные обозначения: МЗ – меристематическая зона, МО – морфогенетический очаг, ПК – паренхиматозные клетки.
Fig. 1. Immunocalization of cytokinins in the cells of the morphogenetic center (a) and the meristematic zone (b) of the wheat embryo callus of. Scale: (a) - 100 μm, (b) - 200 μm. Legend: МЗ – meristematic zone,
MO – morphogenetic center, ПК – parenchymatous cells.
Инициальные клетки делятся с формированием эмбриоидов. Следует отметить, что плоскости деления могут ориентироваться случайным образом, как это было показано нами ранее [Seldimirova, Kruglova, 2013], что ведет к образованию различно ориентированных бластомеров (рис. 2а). В фазе бластомеризации на стадии раннеглобулярного эмбриоида иммуногистохимическое окрашивание на цитокинины наблюдается как в апикальной части эмбриоида, так и в клетке, которую можно рассматривать как гипофизу. В клетках суспензора окрашивания на цитокинины не наблюдается (рис. 2а).
В фазе бластомеризации на стадии позднеглобулярного эмбриоида (перед переходом к органогенезу) цитокинины локализуются в клетках собственно эмбриоида, преимущественно в его апикальной части. В клетках суспензора окрашивания по-прежнему не наблюдается (рис. 2б).
Несмотря на то, что к настоящему времени накоплен значительный фактический материал, касающийся различных аспектов исследования эмбриоидогенеза in vitro в каллусах злаков (в том числе, пшеницы) различного происхождения [Круглова, Сельдимирова (Kruglova, Seldimirova), 2010; 2011; Seldimirova, Kruglova, 2013; Seldimirova et al., 2016; Somatic Embryogenesis ..., 2016], многие вопросы остаются открытыми. Так, до сих пор не выявлены факторы, стимулирующие индукцию различных путей морфогенеза in vitro в инициальных клетках меристематической зоны каллусов.
Известно, что один из важнейших эффектов цитокининов – стимуляция клеточных делений. Кроме того, цитокинины повышают аттрагирующую способность клеток, то есть способность аккумулировать питательные вещества за счет их транспорта из других тканей. Причем аттрагирующая способность, как правило, характерна именно для меристематических клеток [Медведев, Шарова (Medvedev, Sharova), 2011]. Можно предположить, что цитокинины, накапливаясь в клетках морфогенетических центров и меристематической зоны каллусов, участвуют в создании позиционных сигналов (в виде притока определенных веществ – “морфогенов”), необходимых для появления инициальных клеток эмбриоидов в определенных клеточных “нишах” каллусов.
Рис. 2. Иммунолокализация цитокининов в клетках раннеглобулярного (а) и позднеглобулярного (б) эмбриоидов. Масштаб: (а) – 25 мкм, (б) – 100 мкм. Условные обозначения: АпЧ – апикальная часть,
БзЧ – базальная часть, Гф – гипофиза, МЗ – меристематическая, С – суспензор.
Красной линией обозначены контуры отдельных эмбриоидов.
Fig. 2. Immunolocalization of cytokinins in cells of early globular (a) and late globular (b) embryoids.
Scale: (a) - 25 μm, (b) - 100 μm. Legend: АпЧ – apical part, БзЧ –- basal part, Гф – hypophysis, МЗ – meristematic zone, C – suspensor. The red line indicates the contours of individual embryoids.
Накопление цитокининов в клетках ранних глобулярных эмбриоидов, по-видимому, служит сигналом для индукции интенсивных клеточных делений, необходимых для создания так называемой “критической массы” эмбриоида – определенного количества клеток, необходимого для дальнейшей дифференциации эмбриоидов.
Кроме того, вызывает интерес присутствие цитокининов в гипофизе – клетке, из которой в будущем будет формироваться корень и корневой чехлик. Известно, что формирование продольной оси будущего растения обуславливается функционированием апикальных меристем побега и корня и находится под контролем цитокининов совместно с ауксинами. При этом считается, что цитокинины стимулируют развитие апикальной меристемы побега и подавляют развитие апикальной меристемы корня (см. обзор [Romanov, 2009]). Однако имеются данные, подтверждающие участие цитокининов в развитии корня, по крайней мере, у пшеницы [Высоцкая и др. (Vysotskaya et al.), 2011; Seldimirova et al., 2016]. Полученные нами данные о локализации цитокининов в гипофизе, а также данные об экспрессии генов ARR7 и ARR15 гипофизе зародыша арабидопсиса [De Smet et al., 2010], поддерживают мнение об участии цитокининов (наряду с ауксинами) в развитии корня, в частности, в формировании ниши стволовых клеток корня (покоящегося центра) [De Smet et al., 2010].
Позднеглобулярная стадия развития зародыша/эмбриоида (перед переходом от фазы бластомеризации к фазе органогенеза) рассматривается многими исследователями как критическая, поскольку именно на этой стадии клетки зародыша/эмбриоида характеризуются более высокой степенью компетенции к различным воздействиям (внешним и внутренним), по сравнению с предыдущими и последующими стадиями развития. Поэтому локализация цитокининов преимущественно в клетках апикальной части эмбриоида на позднеглобулярной стадии развития также может рассматриваться как проявление позиционной информации для инициирования образования органов эмбриоида.
Таким образом, можно сделать вывод, что накопление цитокининов в определенных группах клеток как каллуса, так и эмбриоидов, является одним из основных факторов, влияющих на активность митотических делений и дальнейшую дифференциацию клеток меристематической зоны каллуса, а впоследствии и эмбриоида. Полученные данные еще раз подтверждают важную (и, по-видимому, определяющую) роль цитокининов в индукции митотической активности и дифференциации клеток как in vivo, так и в условиях культуры in vitro.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз