Бактерии родов Advenella, Bacillus и Pseudomonas – перспективная основа биопрепаратов для растениеводства

19.11.2018
Авторы:
Кузьмина Л.Ю. , Архипова Т.Н. , Актуганов Г.Э. , Галимзянова Н.Ф. , Четвериков С.П. , Мелентьев А.И.
Название:
Бактерии родов Advenella, Bacillus и Pseudomonas – перспективная основа биопрепаратов для растениеводства
Страницы:
16-19
скачано
25 раз(а)


Изучены механизмы ростостимулирующей активности прямого и косвенного действия 14 штаммов бактерий из родов Advenella, Bacillus, Pseudomonas. Все изученные штаммы проявляли фосфат-мобилизующую активность, шесть - обладали способностью продуцировать ауксины (283 - 790 нг/мл). У отдельных культур обнаружена также нитрогеназная активность, антагонизм к фитопатогенным грибам, продукция внеклеточных хитиназ и целлюлаз. В группе штаммов, проявляющих нитрогеназную и целлюлозолитическую активность, B. subtilis IB-54 обладал наиболее сильным антагонистическим действием, а A. kashmirensis IB-K1 - значительной фосфатмобилизующей способностью. Штаммы рода Bacillus и A. kashmirensis IB-K1 являлись умеренными галофилами (до 7% NaCl), тогда как представители псевдомонад были устойчивы к концентрации соли 4-5%. В условиях совместного культивирования бациллы подавляли развитие большинства бактерий других родов, но не проявляли антагонизма друг к другу. Только штамм P. extremaustralis IB-K13-1A был способен к совместному росту со всеми исследованными бактериями. Полученные результаты позволяют рассматривать штаммы A. kashmirensisIB-K1, P. extremaustralisIB-K13-1A, P. mandelii IBKi-14, B. atrophaeusIB-21, B. subtilisIB-22 и B. subtilisIB-54, проявляющие свойства PGPR-бактерий, в качестве перспективной основы новых полифункциональных биопрепаратов для растениеводства.
Введение
Бактерии, колонизирующие ризосферу и ускоряющие рост растений с помощью различных механизмов, называют ростостимулирующими ризобактериями PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria). Среди них наиболее характерны представители родов Agrobacterium, Azotobacter, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia и некоторые другие. Механизм положительного влияния PGPR-бактерий на растения связан как с их прямым, так и косвенным действием. К прямым действиям относится синтез бактериями некоторых метаболитов (ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, продукция сидерофоров, антибиотиков и миколитических ферментов - хитиназ, хитозаназ, протеаз, β-1.3- и β-1.3-1.4-глюканаз, целлюлаз и др.). Косвенные механизмы включают в себя факторы, повышающие выживаемость растений в неблагоприятных условиях (солюбилизация труднорастворимых фосфатов, фиксация атмосферного азота, повышение засухоустойчивости). Большой интерес для сельского хозяйства представляет поиск новых PGP бактерий и создание на их основе биопрепаратов, имеющих комплексное действие.
Цель работы оценить комплекс PGP свойств перспективных штаммов бактерий родов Advenella, Bacillus, Pseudomonas - мобилизацию труднорастворимых фосфатов, продукцию фитогормонов, хитиназ, целлюлаз, нитрогеназную активность, антагонизм к фитопатогенным грибам, галотолерантность, а также возможность их совместного использования в составе одного препарата.
Материалы и методы
Объектами исследований служили штаммы из Коллекции микроорганизмов УИБ УФИЦ РАН. Изучено четырнадцать штаммов, из них 11 являются представителями аэробных грамотрицательных бактерий (Advenella kashmirensis IB-K1 и 10 штаммов рода Pseudomonas), 3 - грамположительных бактерий рода Bacillus.
Способность бактерий синтезировать ауксины оценивали в жидких средах: среда Кинг Б для бактерий рода Pseudomonas, среда К1G [Кузьмина и др. / Kuzmina et al., 2015] - род Bacillus, среда Г1G модификация среды К1G - вид A. kashmirensis. Штаммы культивировали 4 суток на шейкере при 160 об/мин, бактерии рода Bacillus при 370С, грамотрицательные - 280С. Определение ауксинов в культуральной жидкости проводили с помощью ИФА после эфирной экстракции в соответствующей тест-системе [Veselov et al., 1992].
Антагонистическую активность изучали на картофельном агаре, фосфатмобилизующую на среде Муромцева [Муромцев / Muromtsev, 1957] с ортофосфатами (Ca, Al, Fe), среде Менкиной с фитином [Менкина / Menkina, 1950]. Хитиназную и целлюлазную активность на среде, г/л: NaCl - 5, MgSO4 - 2, NH4H2PO4 - 1, K2HPO4 - 1, пептон – 3, дрожжевой экстракт – 3, субстрат – 5 (соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) или коллоидный хитин. Культуры инокулировали методом укола на поверхность среды. Размер колоний и зону просветления вокруг них замеряли через 4-7 суток для хитиназной, целлюлазной, антигрибной активности и на 21 день - фосфатмобилизующей. Целлюлазную активность оценивали по диаметру зон просветления вокруг колоний после окрашивания среды 0.25% Конго красным. Оценку ферментативной и фосфатмобилизующей активности рассчитывали по индексу равному отношению размера зоны гало и колонии [Moawad, Vleck, 1996]. Нитрогеназную активность бактерий, выращенных в жидкой культуре, определяли ацетиленовым методом. Галофильность бактерий изучали в жидких средах, варьируя содержание NaCl от 1 до 10%. Изучение антагонизмам между бактериями проводили методом пересекающих штрихов на среде Г1G.
В качестве тест-объектов для изучения антагонистического действия бактерий использовали 20 штаммов микромицетов вызывающих корневые гнили злаков и первичных разрушителей древесины из Всероссийской коллекций микроорганизмов (ВКМ) и коллекции УИБ УФИЦ РАН (ИБ). Грибы были представлены видами: B. sorokiniana ИБ Г-12, Aspergillus glaucus, Choetomium sp., Fusarium avenaceum ВКМ-F-132 (ИБ Г-15), F. culmoruim ВКМ-F-844 (ИБ Г-16), F. gibbosum ВКМ-F-848 (ИБ Г-17), F. graminearum ВКМ-F-1668 (ИБ Г-18), F. moniliforme ВКМ-F-671 (ИБ Г-64), F. nivale ВКМ-F-3106 (ИБ Г-24), F. oxysporum ВКМ-F-137 (ИБ-Г-20), F. sambucinum ВКМ-F-842 (ИБ Г-21), F. semitectum ВКМ-F-1938 (ИБ Г-22), F. solani ВКМ-F-142 (ИБ Г-23). F. sporotrichiella (ИБ Г-57), Rhinocladium sp., Paecilomyces variotii ИБ Г-27,
Бактерии родов Advenella, Bacillus и Pseudomonas – перспективная основа биопрепаратов
18
Penicillium griseo-purpureum, P. simplicissimum, P. variabile, Trichoderma viride (ИБ Г-40).
Результаты и обсуждение
Оценка способности культур бактерий мобилизовать фосфаты на плотной среде показала, что все штаммы хорошо растворяли фосфат кальция и фитин с индексом солюбилизации от 1 до 7, при этом фосфаты алюминия и железа они растворяли значительно слабее (таблица). Максимальной активностью характеризовался штамм A. kashmirensis IBK1, растворяющий фитин и ортофосфат кальция с индексом солюбилизации 5 и 7, соответственно. Среди псевдомонад наибольшей активностью обладал штамм P. extremaustralis IBK13-1A с индексом солюбилизации 5.5 и 6 для фитина и ортофосфата кальция и 1 для фосфата Al и Fe. Среди бацилл только у штамма B. atrophaeus IB21 выявлены индексы солюбилизации фитина и ортофосфата кальция не превышающие 2 и 2.4 (таблица).
Таблица
Ростостимулирующие свойства изученных штаммов бактерий из родов Advenella, Bacillus, Pseudomonas
Growth stimulating properties of the studied bacterial strains of the genera Advenella, Bacillus, Pseudomonas
Штаммы
Strains
Ауксин, нг/мл
Auxin
Индекс
гидролиза
Hydrolysis index
Индекс
солюбилизации
Solubilization index
нитрогеназа, мкг N2/мл/ч
nitrogenase
Рост в NaCl, %
Антагонизм, кол-во штаммов
Antagonism, strain quantity
целлюлозы / cellulose
хитин / chitin
Ca3(PO4)2
Al3PO4 x 3H2O
FePO4 x 2H20
фитин / phytin
A. kashmirensis IBK1
12
3
–1
5
1
+1
7
0.07
7

P. extremaustralis IBK13-1A
625


6
1
1
5.5
0.04
5

P. extremaustralis IBKi13-1B
37
нд nd
+
4
1
+
3.2
0.15
5

P. mandelii IBKi14
772

+
2.7
1
+
2.8

4

Pseudomonas sp.IBKi13-2
790


5.5

1
6.4
0.24
5

Pseudomonas sp. IBKi11-1
560
2.7

5.7

1
6

5

Pseudomonas sp. IBKi11-2
283


5

1
5.4
0.09
5

Pseudomonas sp. IBKi8-1
81
3.3
+
2
1
+
3

5

Pseudomonas sp. IBKi8-2
18
5
+
4
1
+
3.5
0.02
5
1
Pseudomonas sp. IBKi17
нд
5

3
1
1
3
0.05
5
1
Pseudomonas sp. IBKi-19
7
4.3

4.4
1
+
6
0.02
4

B. subtilis IB22
ауксины
auxines
36
3.9

2
1

2
нд nd
73
3
цитокинины2
cytokinines2
640
B. subtilis IB54
нд nd
6.4

1

+
2.7
0.32
10
20
B. atrophaeus IB21
ауксины
auxines
313

2.1
2
1
+
2.4
нд nd
73
15
цитокинины2
cytokinines2
10
Примечание: 1 – отсутствует активность, + - растворение труднорастворимых фосфатов только под колонией и слабый гидролиз хитина; 2– данные по [Архипова и др., 2006]; 3 - рост при более высоких концентрациях NaCl не изучали; нд – нет данных.
Note: 1 – no activity, + - dissolution of insoluble phosphates only under the colony and weak hydrolysis of chitin; 2 – data on [Arkhipova et al., 2006]; 3 - growth at higher concentrations of NaCl was not studied; nd – no data.
Бактерии родов Advenella, Bacillus и Pseudomonas – перспективная основа биопрепаратов
19
Все изученные штаммы псевдомонад были способны к продукции ауксинов (табл.) Его содержание в культуральной жидкости колебалось от 283 до 790 нг/мл. Среди бацилл лишь у штамма B. atrophaeus IB21 выявлена сопоставимая продукция ИУК. Ранее было установлено, что штамм бацилл B. subtilis IB22 способен синтезировать значительные количества цитокинина, в отличие от B. atrophaeus IB21 (таблица) [Архипова и др. 2006].
Значительным потенциалом к фиксации азота (нитрогеназная активность 0.15-0.24 мкг N2/мл/ч) обладали три штамма B. subtilis IB54, Pseudomonas sp. IBKi13-2 и P. extremaustralis IBKi13-1B (таблица).
Высокая целлюлазная активность выявлена у пяти штаммов - B. subtilis IB54, B. subtilis IB22, Pseudomonas sp. IBKi8-2, Pseudomonas sp. IBKi17, Pseudomonas sp. IBKi-19 (индекс гидролиза Na-КМЦ - 4-6). Способность к гидролизу хитина обнаружена у пяти штаммов, причем максимальным потенциалом обладал штамм B. atrophaeus IB21 (индекс 2) (таблица). Умеренную галофильность проявляли все изученные бациллы и A. kashmirensis IB-K1 (7% NaСl), псевдомонады были способны развиваться лишь при более низких концентрациях соли (таблица). Изучение антагонизма к микроскопическим грибам показало, что наибольшую активность проявляли штаммы из рода Bacillus. Среди псевдомонад только два Pseudomonas sp. IBKi8-2 и Pseudomonas sp. IBKi17 подавляли развитие B. sorokiniana (таблица).
Восемь штаммов бактерий, обладающих свойствами ростостимуляции (A. kashmirensis IB-K1, Pseudomonas (IBKi13-1А, IBKi13-1B, IBKi-14, IBKi-19), Bacillus (IB21, IB22, IB54)), были исследованы на взаимный антагонизм. Штаммы рода Bacillus подавляли рост A. kashmirensis IB-K1, P. mandelii IBKi14, P. extremaustralis IBKi13-1B, Pseudomonas sp. IBKi-19, причем штамм B. subtilis IB54 проявлял максимально широкий спектр антагонизма. Следует отметить, что изученные бациллы могли успешно сосуществовать друг с другом. Только штамм P. extremaustralis IBK13-1A мог успешно развиваться со всеми исследованными культурами, не проявляя отрицательного влияния на их рост.
Проведенные исследования позволяют выделить группу штаммов (A. kashmirensis IB-K1 P. extremaustralis IB-K13-1A, P. mandelii IBKi14, B. atrophaeus IB21, B. subtilis IB22, B. subtilis IB54), обладающих комплексом свойств PGPR-бактерий, способных положительно влиять на развитие растений (продукция фитогормонов, оптимизация азотного и фосфорного питания, борьба с заболеваниями растений, вызываемых фитопатогенными грибами, повышение засухоустойчивости), которые могут быть перспективными для создания полифункциональных биопрепаратов для растениеводства.
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-04-00577 А.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз