Липопептиды эндофитов и фитоиммунитет: перспективы практического использования

высокую токсичность для высших организмов (Bassil et al, 2007). Этих проблем можно избежать путем создания средств защиты растений (СЗР), индуцирующих фитоиммунитет (Yakhin et al., 2017), а также на основе технологий РНК-интерференции и активного геномного редактирования (Ji et al., 2015; Zhang et al., 2016). Другим подходом к защите растений может быть подбор штаммов микроорганизмов, характеризующихся антагонизмом к вредным организмам и вызывающим у них болезни. Уникальной составляющей биологических СЗР могут стать эндофиты - микроорганизмы, определяемые как «способные жить в тканях растений, не вызывая у них болезней» (Compant et al., 2016; Cocq et al., 2017). Создание таких СЗР позволяет в перспективе снизить число фитозащитных мероприятий. Yang (2013) показал, что обработка хлопчатника композицией штаммов Paenibacillus xylanilyticus, Paenibacillus polymyxa и Bacillus subtilis была более эффективна против патогена Verticillium dahliae, чем их действие по отдельности. Хороший результат также дала обработка растений банана композицией штаммов P. fluorescens Pf1, Bacillus sp. EPB10 и Bacillus sp. EPB56, снижающая пораженность грибом F. oxysporum на 18,5% (Kavino et. al., 2016).
К сожалению, на рынке CЗР число препаратов на основе эндофитных штаммов ограничено и используются они не достаточно широко, особенно в России (Михайликова, Стребкова, 2015). Так, фитозащитные свойства доказаны для штамма B.subtilis 26Д основы препарата Фитоспорин-М (Башинком, Россия), для Bacillus amyloliquefaciens FSB-24 - RhizoPlus (AbiTep GmbH, ФРГ) и Taegro (Novozyme, Дания), B.amyloliquefaciens IN937a - BioYield® (Gustafson, США), B.pumulus QST 2808 - Ballad+ (AgraQuest Inc., USA). Некоторые производители для усиления фитозащитных свойств биопрепаратов используют смеси бактериальных штаммов: B.subtilis GB03, B.lichenoformis and B. megaterium – в препарате Companion (Growth Products Ltd, США)); B.nigrum 132, B. subtilis MBI600 и Bradyrhizobium japonicum – в препаратах Бактрил (Биофарматек, Россия), SPHiStick N/T, Sublitex, Pro-Mix (Becker Underwood, США и Premier Horticulture Inc., Канада) (Maksimov, Khairullin, 2016).
Эндофиты производят широкий спектр биологически активных молекул, таких, как сидерофоры, биосурфактанты, цианистый водород, гидролазы, повышающих их конкуренцию с патогенами ради подходящей ниши для колонизации. Как только учѐные обнаружили, что ряд бактерий, в том числе B. subtilis, способны синтезировать поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), они стали активно исследовать их природу. Так был открыт новый класс биологически активных молекул – липопептиды, представляющие собой циклические низкомолекулярные соединения пептидной природы с жирнокислотным компонентом. В 1949 году впервые был детально описан липопептид полимиксин А из Bacillus polymyxa (Jones, 1949). Jones в том же году показал как наиболее эффективный продуцент биосурфактантов штамм B.subtilis IAM1213 (Baindara, Korpole, 2016). С тех пор многие исследователи начали детально изучать липопептиды, выделяя их и из других штаммов рода Bacillus, а также актиномицетов и грибов. Преимущество эндофитных штаммов бактерий, способных к синтезу липопептидов, перед синтетическими аналогами состоит в том, что такие препараты быстро биодеградируют, экологически безопасны, высокостабильны в широком диапазоне рН и температуры. Это обусловливает перспективность их применения в медицине, сельском хозяйстве, нефтехимии и рекультивации земель (Rodrigues et al., 2006).
Молекулы известных липопептидов содержат от 4 до 16 аминокислотных остатков; пептидные цепи линейные, циклические или смешанного строения. Аминокислотные остатки имеют L- или D-конфигурацию (Ongena et al., 2005). В зависимости от аминокислотной последовательности и ответвлений жирных кислот, липопептиды принято подразделять на три класса: 1) итурины (итурин А, микосубтилин и бацилломицин); 2) фенгицины (в том числе плипастатин); 3) сурфактины. Липопептиды обладают определенной антибиотической избирательностью. Так, если сурфактин характеризуется главным образом антибактериальными и противовирусными свойствами, то итурин и фенгицин - антифунгальной (Falardeau et al., 2013; Jasim et al., 2016). Исследователями отмечается подавление развития гриба Fusarium oxysporum бактериями B.subtilis GM5, обусловленное присутствием липопептидов – сурфактина и фенгицина - на стадиях прорастания спор, формирования ростковых трубок и ветвления гиф, аномальное их развитие (Mardanova et al., 2017). Есть работы, свидетельствующие об усилении антифунгальной активности при синергичном влиянии фенгицина и микосубтилина (Mihalache et al., 2017).
Липопептиды эндофитов и фитоиммунитет
59
Антибиотические способности липопептидов связывают с их способностью образовывать в водных средах мицеллы и мембранотропными свойствами этих амфифильных молекул, вызывающими нарушение нормального функционирования мембран вследствие их интеграции в липидный бислой и формированием в мембранах пор (Aranda et al. 2005; Falardeau et al., 2013), но есть данные о том, что они могут активировать экспрессию некоторых защитных генов в крайне низких концентрациях. Так, фенгицины в культуре растительных клеток индуцировали компоненты фенилпропаноидного пути (Dixon et al., 2002), а сурфактины активную генерацию перекиси водорода (Garcia-Gutierrez et al., 2013) и ряд компонентов оксилипиновой сигнальной защитной системы от патогенов (Cawoy et al., 2015; Rahman et al., 2016). Штаммы B.subtilis, продуцирующие итурин и фенгицин, кроме того индуцировали в растениях экспрессию генов фенилпропаноидного метаболизма, запуская механизмы СИУ, например, против некротрофов (Falardeau et al., 2013), а сурфактин вызывал зависимое от ионов Са2+ подщелачивание среды и накопление активных форм кислорода (АФК). Эти данные предполагают, что путь системной приобретѐнной устойчивости (СПУ), связанный с генерацией АФК и запускающийся салициловой кислотой, также может быть вовлечен в механизмы индукции защитной системы, опосредованный липопептидами. Штамм B.subtilis 168 – продуцент сурфактина и фенгицина усиливал устойчивость растений томатов и фасоли к B. cinerea, посредством активации ферментов липоксигеназного пути (Ongena et al., 2010), ответственных за синтез важной молекулы, регулирующей СИУ - жасмоновой кислоты (ЖК) Сурфактин индуцироваловал СИУ в растениях фасоли, дыни, томата, табака и винограда, тогда как фенгицин - защитный ответ у картофеля, томатов и табака (Farace et al., 2015). Обработка корней томатов массетолидом А из P.fluorescens повышала устойчивость листьев растений к оомицету Phytophthora infestans (Tran et al., 2007). Штамм B.amyloliquefaciens, продуцирующий сурфактин, индуцировал СИУ в растениях рапса против Botrytis cinerea (Sarosh et al. 2009), также, как и B.amyloliquefaciens FZB42 индуцировал СИУ в растениях латука против R.solani через ЖК/этилен-зависимый сигнальный защитный путь индукции экспрессии гена PDF 1.2 (Chowdhury et al., 2015). Обнаружено, что микосубтилин запускает защитные реакции у растений винограда (Farace et al., 2015). Вместе с тем, рекомбинантные штаммы B.amyloliquefaciens FZB42, дефицитные по синтезу сурфактина (CH1), а также по синтезу сурфактина, фенгицина и бацилломицина Д (CH5) теряли способность повышать устойчивость растений салата к ризоктониозу (Chowdhury et al., 2015). Показано, что штамм B.subtilis BBG111 индуцирует СИУ к R.solani в ризосфере риса, по меньшей мере, благодаря секреции фенгицина и сурфактина, тем самым вызывая реакцию сверхчувствительности и гибель клеток, причем иммунные реакции развиваются по ЖК/этилен-, АБК- и ауксин-зависимым сигнальным путям, что блокирует рост и развитие патогена на ранней стадии патогенеза (Chandler et al., 2015).
Будущие исследования должны обеспечить дополнительное понимание тонких механизмов, с помощью которых липопептиды взаимодействуют с клетками растений, дополнительно поясняя дифференциальную их эффективность. Так, использование геномного шаффлинга Zhang с сотрудниками (2016) позволил получить штамм эндофитной бактерии B. amyloliquefaciens FMB72. синтезирующий в 8,3 раз больше фенгицина, чем исходный штамм B. amyloliquefaciens ES-2-4, выделенный из шлемника S. baicalensis Georgi. Штамм обладал высокой биоцидной активностью против патогенов.
Вызываемая эндофитами СИУ сохраняется в растениях долгое время и эффективно работает против патогенов даже в условиях хранения (Максимов и др., 2011). Он проявляется в каскадном раннем, быстром и многократном накоплении уровня АФК, в том числе и Н2О2, после начала инфицирования и запуске экспрессии редокс-чувствительных транскрипционных факторов и генов PR-белков, а также регулирует взаимодействие СК, ЖК и этиленового сигнальных путей. Так, ризобактерия P. putida LSW17S индуцировала быстрое накопление транскриптов PR-генов и продукцию Н2О2 в растениях томата, инфицированных P.syringae pv. tomato DC3000, что ингибировало развитие патогена (Ahn et al., 2011). Снижение степени развития гриба Rhizopus stolonifer на плодах персика, обработанных B. cereus AR156 и B. subtilis SM21, было связано с генерацией Н2О2, увеличением экспрессии генов хитиназы, β-1,3-глюканазы и фенилаланинаммоний-лиазы и активностью их белковых продуктов (Wang et al., 2013). Штаммы B.subtilis BSCBE4 и P.chlororaphis PA23 активировали пероксидазы и полифенолоксидазы, катализирующе завершающие реакции биосинтеза лигнина, в проростках перца, инфицированных Pythium aphanidermatum (Nakkeeran et al., 2006).
При развитии СИУ, индуцированной эндофитными бактериями, генерация АФК в растениях может играть критическую роль в формировании эффекта прайминга. Феномен
Липопептиды эндофитов и фитоиммунитет
60
праймирования генома хозяина под влиянием бактериальных агентов заключается в приобретении растительными клетками повышенной чувствительности к воздействию чужеродных веществ и характеризуется более быстрой и сильной активацией клеточных механизмов защиты растения при атаке патогенами или насекомыми и может длиться довольно долго, что приводит к повышению устойчивости растений. Выдвигаются предположения, что такое праймирование под влиянием бактерий связано с изменением статуса метилирования ДНК в геноме растений (Da et al., 2012).
Таким образом, поиск высокоэффективных эндофитных штаммов, перенос «полезных» генов в них из других хозяйственно значимых видов бактерий, а также конструирование их эффективных консорциумов способствует созданию на их основе биопрепаратов нового поколения для комплексной защиты растений от и патогенов и вредителей. Способность эндофиов продуцировать фунги- и инсекто-токсичные белки, праймировать фитоиммунные реакции и долговременно сосуществовать в тканях растений может способствовать уходу от использования в растениеводстве трансгенных растений, продуцирующих соответствующие белки.
Работа выполнена в рамках научного проекта РФФИ № 17-29-08014 (2018).

1. Максимов И.В., Абизгильдина Р.Р., Юсупова З.Р., Хайруллин Р.М. Влияние бактерий B. subtilis 26Д на содержание пероксида водорода и активность пероксидазы в растениях яровой пшеницы // Агрохимия. 2010. № 1. С. 55–60.
2. Михайликова В.В., Стребкова Н.С. Использование средств защиты растений в Российской Федерации // Агрохимия. 2015. «12. С. 56-59.
3. Ahn I.P., Lee S.W., Kim M.G., Park S.R., Hwang D.J., Bae S.C. Priming by rhizobacterium protects tomato plants from biotrophic and necrotrophic pathogen infections through multiple defense mechanisms // Mol. Cells. 2011. V. 32. P. 7-14.
4. Aranda F.J., Teruel J.A., Ortiz A. Further aspects on the hemolytic activity of the antibiotic lipopeptide iturin A. // Biochim Biophys Acta. 2005. V.1713. P.51–56.
5. Bassil K.L., Vakil C., Sanborn M., Cole D.C., Kaur J.S., Kerr K.J. Cancer health effects of pesticides // Canadian Family Physician. 2007. V.53 (10). P.1704–1711.
6. Baindara P., Korpole S. Lipopeptides: Status and Strategies to Control Fungal Infection // Recent Trends in Antifungal Agents and Antifungal Therapy. 2016. P. 97-121.
7. Cawoy H., Debois D., Franzil L., De Pauw E., Thonart P., Ongena M. Lipopeptides as main ingredients for inhibition of fungal phytopathogens by Bacillus subtilis/amyloliquefaciens. // Microb Biotechnol. 2015. V.8 (2). P.281-295.
8. Chandler S., Van Hese N., Coutte F., Jacques Ph., Hofte M., De Vleesschauwer D. Role of cyclic lipopeptides produced by Bacillus subtilis in mounting induced immunity in rice (Oryza sativa L.) // Physiological and Molecular Plant Pathology. 2015. V.91. P. 20-30.
9. Compant S., Saikkonen K., Mitter B., Campisano A., Mercado-Blanco J. Editorial special issue: soil, plants and endophytes // Plant Soil. 2016. V.405. P. 1–11. DOI10.1007/s11104-016-2927-9.
10. Cocq K.L., Gurr S.J., Hirsch P.R., Manuchline T.H. Exploration of endophytes for sustainable agricultural intensification // Mol. Plant pathol. 2017. V. 18(3). P. 469-473.
11. Chowdhury S.P., Uhl J., Grosch R., Alquéres S., Pittroff S., Dietel K., Schmitt-Kopplin P., Borriss R., Hartmann A. Cyclic lipopeptides of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum colonizing the lettuce rhizosphere enhance plant defense responses toward the bottom rot rathogen Rhizoctonia solani // Mol. Plant Microbe Interact. 2015. V.28 (9). P. 984-995. doi:10.1094/MPMI-03-15-0066-R.
12. Da K., Nowak J., Flinn B. Potato cytosine methylation and gene expression changes induced by a beneficial bacterial endophyte, Burkholderia phytofirmans strain PsJN // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V.50. P.24-34.
13. Dixon R.A., Achnine L., Kota P., Liu C.J., Reddy M.S., Wang L. The phenylpropanoid pathway and plant defense - a genomics perspective. // Mol. Plant Pathol. 2002. V.3. P.371-390.
14. Falardeau J., Wise C., Novitsky L., Avis T.J. Ecological and mechanistic insights into the direct and indirect antimicrobial properties of Bacillus subtilis lipopeptides on plant pathogens // J. Chem. Ecol. 2013. V. 39. P. 869–878. doi10.1007/s10886-013-0319-7.
15. Farace G., Fernandez O., Jacquens L., Coutte F., Krier F., Jacques P., Clément C., Barka E.A., Jacquard C., Dorey S. Cyclic lipopeptides from Bacillus subtilis activate distinct patterns of defence responses in grapevine // Mol. Plant Pathol. 2015. V.16 (2). P.177-187. doi:10.1111/mpp.12170.
16. Jasim B., Sreelakshmi K.S., Mathew J., Radhakrishnan E.K. Surfactin, Iturin and Fengycin Biosynthesis by Endophytic Bacillus sp. from Bacopa monnieri // Microb Ecol. 2016. V.72. P.106–119.
17. Jones T.S. Chemical evidence for the multiplicity of the antibiotics produced by Bacillus polymyxa // Ann. N. Y. Acad. Sci, 1949. V.51. P.909-916.
18. Ji X., Zhang H., Zhang Y., Wang Y., Gao C. Establishing a CRISPR–Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants // Nature plant. 2015. V.1. Article 15144. DOI:10.1038/NPLANTS.2015.144.
19. Kavino M., Manoranjitham S.K., Vijayakumar, N.K.R. Plant growth stimulation and biocontrol of Fusarium wilt (Fusarium oxysporium f. sp. cubene) by coinoculation of banana (Musa sp.) plantlets with PGPR and endophytes. // Recent Trends in PGPR Research for Sustainable Crop Productivity, 2016. P.77.
20. Maksimov I.V., Khairullin R.M. The role of Bacillus bacterium in formation of plant defense: Mechanism and reaction The Handbook of Microbial Bioresourses (eds V.K Gupta et al.) c CAB International 2016. Chapter 4. P.56-80.
21. Mardanova A.M., Hadieva G.F., Lutfullin M.T., Khilyas I.V., Minnullina L.F., Gilyazeva A.G., Bogomolnaya L.M., Sharipova M.R. Bacillus subtilis Strains with Antifungal Activity against the Phytopathogenic Fungi. // Agricultural Sci. 2017. V.8. P.1-20. doi. 10.4236/as.2017.81001
22. Mihalache G., Balaes T., Gostin I., Stefan M., Coutte F., Krier F. Lipopeptides produced by Bacillus subtilis as new biocontrol products against fusariosis in ornamental plants. // Environ Sci. Pollut. Res. Int. 2017. V.20. doi:10.1007/s11356-017-9162-7.
23. Nakkeeran S., Kavitha K., Chandrasekar G., Renukadevi P., Fernando W.G.D. Induction of plant defense compounds by Pseudomonas chlororaphis PA23 and Bacillus subtilis BSCBE4 in controlling damping-off of hot pepper caused by Pythium aphanidermatum // Biocontrol Sci. Techn. 2006. V. 16. P. 403-416.
24. Ongena M., Henry G., Thonart P. The role of cyclic lipopeptides in the biocontrol activity of Bacillus subtilis // Recent Developments in Management of Plant Diseases (Plant Pathology in the 21st century). V.1 / Eds. Gisi U. et al., Dordrecht Heidelberg, London New Yoerk, Springer Science+Business Media B.V. 2010. P. 59-69. DOI10.1007/978-1-4020-8804-9_5.
25. Ongena M., Jacques P., Toure Y., Destain J., Jabrane A., Thonart P. Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential of Bacillus subtilis // Applied Microbiology and Biotechnology. 2005. V.69(1). P.29–38.
26. Rahman A., Uddin W., Wenner N.G. Induced systemic resistance responses in perennial ryegrass against Magnaporthe oryzae elicited by semi-purified surfactin lipopeptides and live cells of Bacillus amyloliquefaciens // Mol. Plant. Pathol. 2015. V.16 (6). P.546-558.
27. Rodrigues L., Banat I.M., Teixeira J., Oliveira R. Biosurfactants: potential applications in medicine. // J. Antimicrob. Chemother. 2006. V.57. P.609-618.
28. Sarosh B.R., Danielsson J., Meijer J. Transcript profiling of oilseed rape (Brassica napus) primed for biocontrol differentiate genes involved in microbial interactions with beneficial Bacillus amyloliquefaciens from pathogenic Botrytis cinerea. // Plant Mol. Biol. 2009. V.70 (1-2). P.31-45. doi:10.1007/s11103-009-9455-4.
29. Tran H., Ficke A., Asiimwe T., Höfte M., Raaijmakers J.M. Role of the cyclic lipopeptide massetolide A in biological control of Phytophthora infestans and in colonization of tomato plants by Pseudomonas fluorescens // New Phytol. 2007. V.175 (4). P.731-742.
30. Wang X., Wang J., Jin P., Zheng Y. Investigating the efficacy of Bacillus subtilis SM21 on controlling Rhizopus rot in peach fruit // Int. J. Food Microbiol. 2013. V.164. P.141–147.
31. Yakhin O.I., Lubyanov A.A., Yakhin I.A., Brown P.H. Biostimulants in Plant Science: A Global Perspective // Frontier in plant science. 2017. V.7. Article 2049. doi:10.3389/fpls.2016.02049.
32. Yang P., Sun Z.X., Liu S.Y., Lu H.X., Zhou Y., Sun, M. Combining antagonistic endophytic bacteria in different growth stages of cotton for control of Verticillium wilt. // Crop Protection. 2013. V.47. P.17-23.
33. Zhang T., Zhao Y.-L., Zhao J.-H., Wang S., Jin Y., Chen Z.-Q., Fang Y.-Y., Hua C.-L., Ding S.-W., Guo H.-S. Cotton plants export microRNAs to inhibit virulence gene expression in a fungal pathogen // Nature plants. 2016. V.2. Article 16153. DOI:10.1038/NPLANTS.2016.153.