Особенности формирования плодов у первичных трансгенных растений томата, полученных методом агробактериальной трансформации

19.11.2018
Авторы:
Кононенко Н.В. , Чабан И.А. , Баранова Е.Н. , Богоутдинова Л.Р. , Халилуев М.Р.
Название:
Особенности формирования плодов у первичных трансгенных растений томата, полученных методом агробактериальной трансформации
Страницы:
37-41
скачано
21 раз(а)


Среди трансгенных растений томата с генами, кодирующими хитинсвязывающие белки из Amaranthus caudatus L. (ас) и Amaranthus retroflexus L. (RS-intron-Shir), а также гевеиноподобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. (SmAMP1 и SmAMP2), выделены линии, у которых формировались нормальные и партенокарпические плоды. Проведено сравнение структуры плодов у трансгенных растений. Установлены существенные различия между контрольными и трансгенными растениями с нормальным и аномальным фенотипом по количественному соотношению диплоидных и полиплоидных клеток в перикарпии плодов. Обсуждаются возможные причины формирования партенокарпических плодов у полученных трансгенных растений.
Партенокарпия – частный случай партеногенеза, при котором развитие плода происходит в отсутствие опыления и/или оплодотворения. Это явление широко распространено среди растений рода Solanum. Создание партенокарпических томатов является актуальным направлением современной селекции и представляет хозяйственное значение как для салатных, так и промышленных сортов и гибридов, поскольку бессемянные плоды характеризуются большей сочностью и мясистостью, обладают более высокими вкусовыми качествами, а также имеют преимущества при технологической обработке (например, при изготовлении паст и соусов). На современном этапе развития физиологии растений
Особенности формирования плодов у трансгенных томатов
38
принято считать, что партенокарпия у томата обусловлена гормональным дисбалансом, о чем свидетельствуют экспериментальные данные, полученные при экзогенной обработке растений гормонами и регуляторами роста, а также при их выращивании в неблагоприятных условиях (преимущественно при пониженных или повышенных температурах) [Gorguet et al., 2005]. Однако физиологические механизмы, лежащие в основе этого процесса, остаются в значительной степени неизвестными. В настоящее время охарактеризованы генотипы томата, которые содержат гены, индуцирующие партенокарпическое развитие плодов (pat, pat-2, pat3, pat4, pat4.1, pat4.2, pat5.1, pat9.1, Pat-k) [Gorguet et al., 2005; Takisawa et al., 2017]. Партенокарпия у культурного томата была достигнута также за счет применения различных генно-инженерных стратегий, приводящих к изменению уровня биосинтеза ауксинов и гиббереллинов. Одной из них является подавление экспрессии ауксин-регулируемых генов транскрипционных факторов SlIAA9 [Wang et al., 2005] и SlARF7 [de Jong et al., 2009]. Нокаут гена SlIAA9 в геноме культурного томата был осуществлен японскими исследователями посредством системы CRISPR/Cas9 редактирования генома [Ueta et al., 2017]. Кроме того, образование партенокарпических плодов у трансгенных растений томата было достигнуто за счет экспрессии химерного гена DefH9-iaaM, который состоит из кодирующей области гена iaaM из Pseudomonas syringae pv. savastanoi под контролем семяспецифичного DefH9 промотора из Anthirrhinum majus L. Ген iaaM участвует в триптофан-зависимом пути биосинтеза 3-индолилуксусной кислоты (ИУК) через индолацетамид [Ficcadenti et al., 1999]. Накопление GA-20-оксидазы (фермента, катализирующего синтез ряда гиббереллинов) за счет сверхэкспрессии гена CcGA20ox1, выделенного из цитранжа (гибрида Citrus sinensis x Poncirus trifoliate), также приводила к развитию бессемянных плодов у трансгенных растений томата сорта Micro-Tom [García-Hurtado et al., 2012].
Среди независимых первичных трансгенных линий томата, полученных методом агробактериальной трансформации, достаточно часто встречаются растения, у которых происходит формирование бессемянных плодов или же плоды не образуются вовсе, что исключает возможность их применения в дальнейших исследованиях. Цель настоящего исследования – изучить особенности формирования плодов у Т0-трансгенных растений томата, содержащих гетерологичные гены, кодирующие защитные хитинсвязывающие белки, классифицированные в PR-4 семейство, а также гевеиноподобные антимикробные пептиды.
Материалы и методы
Растительным материалом для исследований служили растения томата дикого вида Solanum habrochaites S. Knapp & D.M. Spooner, S. lycopersicum L. селекционной линии ЯЛФ, используемой для агробактериальной трансформации (дикий тип), а также независимые первичные трансгенные линии, содержащие гены, кодирующие хитинсвязывающие белки из Amaranthus caudatus L. (ас) и A. retroflexus L. (RS-intron-Shir), а также гевеиноподобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. (SmAMP1 и SmAMP2) [Халилуев и др. / Khaliluev et al., 2010]. Контрольные и трансгенные растения были выращены в условиях теплицы при температуре 22–25°C днем и 18–19°C ночью, влажности 60–70% и освещенности 4000-5000 люкс.
Для цитофотометрического анализа использовали фрагменты перикарпия плодов, которые фиксировали в смеси этанола и уксусной кислоты (соотношение 3:1) в течение 3 ч, после чего проводили гидролиз 5N HCl в течение 40 мин при 22°С. Окрашивание препаратов проводили реактивом Шиффа (Merck, Германия). Содержание ДНК в клетках перикарпия плодов определяли в относительных единицах с помощью цитофотометра SMP-20 (Opton, Германия) с объективом ×16, окуляром ×10 и зондами 0.08–2.5 мм.
Результаты и обсуждение
В результате серии экспериментов по агробактериальной трансформации были получены независимые трансгенные растения томата с чужеродными генами, кодирующими хитинсвязывающие белки и антимикробные пептиды. В зависимости от целевого гена эффективность трансформации варьировала от 6.7 до 11.3% [Халилуев и др. / Khaliluev et al., 2010]. При выращивании в условиях защищенного грунта Т0-трансгенные растения были условно разделены на 4 группы: линии, у которых не происходило образования плодов (I); линии, у которых формировались плоды с полноценными жизнеспособными семенами (II); линии с партенокарпическими плодами (III). Кроме того, с каждым из целевых генов отмечены линии, существенно отличающиеся по фенотипу от растений дикого типа, у которых наблюдались кардинальные изменения генеративных органов в результате нарушения идентичности флоральной меристемы. Это выражалось в формировании эктопических генеративных побегов, что, в ряде случаев, приводило к образованию многоярусных партенокарпических плодов (IV) [Khaliluev et al., 2014]. Частота встречаемости растений с нормальными и партенокарпическими плодами представлена в табл. 1.
Особенности формирования плодов у трансгенных томатов
39
Табл. 1.
Частота встречаемости Т0-трансгенных растений томата с нормальным и партенокарпическим развитием плодов
Table 1. Frequency of occurrence of T0-transgenic tomato plants with normal and parthenocarpic fruit development
Целевой ген
Target gene
Т0-трансгенные линии томата (число/процент)
Всего
Total
Не образовавшие плоды
No fruiting occurred
Формирующие плоды с полноценными семенами
Fruits with viable seeds
Формирующие нормальные партенокарпические плоды
Normal parthenocarpic fruits
Формирующие аномальные партенокарпические плоды
Abnormal parthenocarpic fruits
ac
6/100
3/49,9
1/16,7
1/16,7
1/16,7
rs-intron-shir
10/100
2/20,0
3/30,0
4/40,0
1/10,0
amp1
13/100
3/23,1
4/30,8
5/38,4
1/7,7
amp2
11/100
3/27,3
3/27,3
4/36,3
1/9,1
Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой частоте встречаемости трансгенных растений с каждым из целевых генов, у которых происходило формирование бессемянных плодов. Это позволяет сделать вывод о том, что явление партенокарпии у трансгенных растений не зависит от вида перенесенного гена. С уверенностью можно также сказать, что индукция партенокарпического развития плодов у трансгенных линий не связана с климатическими факторами, поскольку все плоды растений дикого типа содержали полноценные жизнеспособные семена при одинаковых условиях выращивания. Наиболее вероятной причиной формирования партенокарпических плодов у трансгенных линий томата является изменение гормонального статуса, которое, скорее всего, обусловлено образованием избыточного количества активных форм кислорода в процессе культивирования in vitro. Так, к настоящему времени хорошо известно, что при проведении агробактериальной трансформации растительная ткань подвергается целому ряду стрессовых воздействий (заражение патогенным микроорганизмом, поранение эксплантов, а также их длительное культивирование на питательных средах с добавлением регуляторов роста и высоких концентраций селективных агентов). Все это сопровождается явлениями, характерными для первичного неспецифического стрессового ответа, который выражается в окислительном взрыве и активации окислительных ферментов [S¸en 2012].
Впоследствии было проведено сравнение структуры плодов трансгенных линий, у которых происходило формирование полноценных семян, а также партенокарпических плодов с аномальным фенотипом. В качестве контроля использовали плоды селекционной линии ЯЛФ (дикий тип), а также дикого вида S. habrochaites S. Knapp & D.M. Spooner (рис. 1а).
Рис. 1. Поперечные срезы плодов (а) и плоидность клеток перикарпия (б) растений томата S. habrochaites (1), S. lycopersicum линия ЯЛФ (2), а также Т0-трансгенных линий с нормальным (3) и аномальным фенотипом (4).
Fig. 1. Transverse section of fruits (a) and ploidy of pericarp cells (b) of tomato plants S. habrochaites (1), S. lycopersicum line YALF (2), as well as T0-transgenic lines with normal (3) and abnormal phenotype (4).
Особенности формирования плодов у трансгенных томатов
40
На поперечном срезе плода дикого вида томата можно отчетливо видеть 2 гнезда со сравнительно массивным перикарпием и небольшими плацентами, на которых располагаются семена. Плод томата линии ЯЛФ обычно содержит 5-7 правильно расположенных гнезд. Семена формируются на выпуклых массивных плацентах. Плоды трансгенных растений, содержащих полноценные семена, характеризуются увеличенным числом (10 и более) хаотично расположенных гнезд. У трансгенных линий с аномальным фенотипом плоды схожи по числу гнезд и их расположению с плодами растений дикого типа. Однако в них наблюдались сильно разросшиеся плаценты, на поверхности которых располагались мелкие неразвившиеся семязачатки.
Цитофотометрический анализ показал, что плоидность клеток перикарпия плодов всех изученных растений варьирует от 2С до 32С (рис. 1б). Существенные различия между ними оказались в количественном соотношении диплоидных (2С и 4С) и полиплоидных клеток (8С и более). Так, в перикарпии плодов S. habrochaites только 14% клеток содержали полиплоидные ядра, тогда как у растений дикого типа (линия ЯЛФ), а также трансгенных линий с нормальным и аномальным фенотипом – около 23, 29 и 37% соответственно.
Рис. 2. Количество полиплоидных клеток перикарпия трехъярусного плода томата трансгенной линии с аномальным фенотипом, экспрессирующей ген ac.
Fig. 2. Polyploid pericarp cells number of multilayered tomato fruit of transgenic line expressing the ac gene with an abnormal phenotype.
По современным данным процесс роста плода на клеточном уровне осуществляется преимущественно за счет эндоредупликации ДНК в клетках тканей перикарпия [de Jong et al., 2009; Bourdon et al., 2011]. Удобным объектом для изучения влияния количественного содержания ДНК на размер ядра и клетки в целом служил трехъярусный плод трансгенной линии, у которой размер плодов разных ярусов уменьшался в соотношении 5:2:1 (рис. 2).
Установлено, что количество полиплоидных клеток в тканях перикарпия нижнего плода составляет около 36%, а максимальная плоидность достигает 64С. В среднем плоде количество полиплоидных клеток составляет 29%, а в верхнем –20%. При этом максимальная плоидность клеток в среднем и верхнем плодах одинакова и составляет 32С. Действительно, как показал цитофотометрический анализ многоярусного плода исследуемой трансгенной линии томата, размер одинаковых по зрелости плодов непосредственно связан с количеством полиплоидных клеток и уровнем их плоидности. Увеличение плоидности в клетках перикарпия партенокарпического плода свидетельствует о том, что в ядрах происходит эндоредупликация ДНК, приводящая к формированию полиплоидных соматических клеток. Как установлено ранее, этот процесс сопровождается изменением структуры хроматина, числа и структуры хромосом [Bourdon et al., 2011] и соответственно уровнем плоидности клеток перикарпия. В то же время, в одинаковых по величине и зрелости плодах контрольных и трансгенных растений с аномальным фенотипом максимальная плоидность клеток одинакова (32С), а количество полиплоидных клеток у последних достоверно выше. Это означает, что в данном случае эндоредупликация ДНК (или полиплоидизация клеток) не является единственным способом увеличения размера плодов.
Работа выполнена в рамках государственного задания ФАНО России № АААА-А17-117091460013-5 и при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-04-00658.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз