Создание трансгенных растений табака с генами rol Agrobacterium rhizogenes

Авторы:
Кагирова А.С. , Гумерова Г.Р. , Кашапова Г.М. , Кулуев Б.Р.
Название:
Создание трансгенных растений табака с генами rol Agrobacterium rhizogenes
Страницы:
349-355
скачано
24 раз(а)


Гены rol Agrobacterium rhizogenes играют ключевую роль в формировании hairy roots (косматых корней)
и их встраивание в растительный геном нарушает нормальное развитие растения вследствие гормональных изменений
что в свою очередь приводит к различным фенотипическим отклонениям от нормы. Изолированные от побега культуры hairy roots имеют специфические особенности
такие как высокая скорость и неограниченность роста на питательной среде без фитогормонов
способность активно формировать боковые корни из-за отсутствия апикального доминирования и потери геотропной ориентации. Существует большое количество исследований
в которых показано
что содержание вторичных метаболитов в культуре hairy roots может намного превышать их концентрацию в растениях дикого типа
что связывают со стимулирующим влиянием продуктов rol-генов. В качестве перспективных продуцентов биоактивных молекул
таких как вторичные метаболиты и рекомбинантные белки кроме hairy roots рассматриваются также трансгенные растения. Благодаря высокой регенерационной способности из культуры hairy roots можно получать целые трансгенные растения
без потери приобретенных rol-генов. Такие растения могут потенциально обладать хозяйственно ценными признаками
также они могут быть использованы в качестве продуцентов первичных и вторичных метаболитов. Целью нашей работы была оптимизация основных этапов биотехнологического получения растений-регенерантов табака Nicotiana tabacum L из культуры hairy roots. В ходе работы нами были получены косматые корни табака путем инокуляции листовых эксплантов штаммом А4 A. rhizogenes. Каллусообразование в культурах hairy roots индуцировали на среде МС с добавлением нафтилуксусной кислоты и кинетина. Для регенерации побегов образующийся каллус пересаживали на среду МС с 6-бензиламинопурином и индолил-3-уксусной кислотой. Укоренение регенерировавших побегов проводили на безгормональной среде МС. В ходе работы было акклиматизировано к условиям почвы 15 трансгенных по rol-генам растений табака
которые планируется использовать для изучения влияния продуктов этих онкогенов на рост и стрессоустойчивость
а также на содержание вторичных метаболитов по сравнению с растениями дикого типа.
Введение
Ri плазмида фитопатогенной грамотрицательной бактерии Agrobacterium rhizogenes несет в своей Т-ДНК генетическую информацию
реализация которой приводит к перепрограммированию дифференциации растительных клеток и индуцированию синдрома «hairy root disease». Образующиеся при этом заболевании быстро растущие адвентивные корни в русскоязычной литературе известны под названием косматые
[Ясыбаева и др.
2016]
бородатые
[Михайлова и др.
2017; Мусин и др.
2017] и генетически трансформированные pRi корни
[Кузовкина и др.
2012; Эрст и др.
2017]. Онкогены A. rhizogenes представлены четырьмя rol-генами
расположенными в TL-фрагменте Т-ДНК
тогда как гены синтеза опинов (источников питания агробактерий) входят в состав области TR-ДНК. Встраивание в растительный геном rol-генов (rolA
B
C и D) нарушает нормальное развитие растения вследствие гормональных изменений
что в свою очередь приводит к различным фенотипическим отклонениям от нормы
[Spena et al.
1987; Павлова и др.
2013]. Так
rolА увеличивает чувствительность к ауксину в период цветения
стимулирует корнеобразование и рост корней
[Кулаева и др.
2006]. Растения
содержащие в своем геноме данный онкоген
отличаются морщинистыми листьями
короткими междоузлиями. В тканях стебля экспрессия онкогена имеет более высокий уровень
чем в корнях и листьях
[Carneiro et al.
1993]. Такие фенотипические проявления трансгенных по гену rolА растений часто связаны с изменениями концентрации гибберелловой кислоты
[Mauro et al.
2017].
RolВ считается самым важным онкогеном
так как только его инактивация в составе Т-ДНК приводит к полному подавлению индукции косматых корней
[Nilsson et al.
1997]. RolВ экспрессируется во всех меристематических тканях и в проводящей системе
[Altamura
2004]
способен активировать защитные системы растения в ответ на появление активных форм кислорода
предотвращать гибель некротических клеток и уменьшать апоптотические симптомы
[Bulgakov et al.
2013]. Трансформанты характеризуются повышенным образованием придаточных корней
формированием случайных почек и увеличением размеров цветков
[Schmülling et al.
1988]. Морфологические аномалии этих трансгенных растений наиболее ярко проявлялись в ответ на гормон ауксин
[Кулаева и др.
2006].
RolС стимулирует образование более разветвленных корней на листьях табака
чем корни
индуцированные при помощи генов rolA или rolB
[Mohajjel-Shoja
2010]. У трансформированных геном rolС растений отмечается карликовый фенотип
короткие междоузлия
ланцетовидные листья
раннее цветение
уменьшение размера цветка и количества пыльцы
[Spena et al.
1987]. Некоторые трансгенные по гену rolС растения обладали более тяжелыми плодами и повышенной толерантностью по отношению к паразитам
[Mohajjel-Shoja
2010]. Ген rolС может быть индуцирован в любой клетке
при условии культивирования в среде богатой сахарозой
[Nilsson et al
1997]. Предполагается
что многие эффекты
вызванные rolС
могут быть связаны с увеличением активности гормона цитокинина
[Mauro et al.
2017].
Активность экспрессии rolD значительно изменяется в течение цикла развития. Так
наибольший уровень обнаруживается в растущих органах
но никогда – в апикальной меристеме
и снижается с возрастом
[Mohajjel-Shoja
2010]. Среди всех представителей генов rol
только ген rolD не способен самостоятельно индуцировать косматые корни
[Mauro et al.
1996; Авраменко
2015]. Высота rolD-трансформантов меньше
чем растений дикого типа
так же им присущи следующие морфологические аномалии: ранний переход от вегетативного роста к репродуктивному
уменьшение укоренения
явление гетеростилии и формирование меристем в постэмбриональный период
[Mauro et al.
1996: Павлова и др.
2013]. Промоторы генов rolD и rolВ имеют Dof-связывающий элемент
участвующий в индукции ауксина
[Trovato et al.
1997].
Параллельно с этими проявлениями трансгенные по rol-генам растения сохраняют в условиях in vitro генетическую стабильность и способность к синтезу корнеспецифичных для данного растения вторичных метаболитов
[Bulgakov et al.
2013]
которые могут служить сырьем в различных областях промышленности и фармакологии. К наиболее эффективным индукторам вторичного метаболизма относят два гена - rolB и rolC. Первый увеличивает биосинтез антрахинонов
[Авраменко
2015] и противоопухолевого агента – ресвератрола
[Kiselev et al.
2007]
активирует экспрессию PR-генов
а также генов
кодирующих пероксидазы третьего класса
антиоксидантных ферментов: аскорбатпероксидазы
каталазы
супероксиддисмутазы
[Bulgakov et al.
2013; Mauro et al.
2017] и ферментов синтеза фитоалексинов
[Veremeichik et al.
2012]. Ген rolC оказывает влияние на продукцию тропановых
пиридиновых и индольных алкалоидов
[Palazon et al.
1998; Bonhomme et al.
2000]
гинсенозидов
[Bulgakov et al.
2002] и антрахиноновых фитоалексинов
[Shkryl et al.
2008]
к тому же специфическая экспрессия гена rolC во флоэме делает его полезным инструментом при создании трансгенных растений устойчивых к патогенам
[Mohajjel-Shoja
2010].
Полученные трансгенные по генам rol растения могут быть использованы в качестве модельных объектов для изучения биосинтеза первичных и вторичных метаболитов. Представляет большой интерес отбор трансгенных по генам rol растений-суперпродуцентов ценных вторичных метаболитов. Изучение продуктивности и стрессоустойчивости трансгенных растений
экспрессирующих все 4 rol-гена также является актуальным
так как большинство таких работ проведено лишь на отдельных rol-генах. Можно предполагать
что трансгенные по всем четырем rol-генам растения будут иметь различные фенотипические отклонения
причем некоторые из этих морфофизиологических особенностей могут оказаться весьма полезными при создании новых форм и сортов декоративных и сельскохозяйственных растений. В связи с этим целью нашей работы стала разработка методов получения трансгенных растений-регенерантов из культуры hairy roots без потери приобретенных rol-генов и акклиматизация этих растений к условиям почвы на примере модельного объекта табака.
Материалы и методы
Для получения стерильных листовых эксплантов свежесобранные листья Nicotiana tabacum L
выдерживали в растворе 70% этанола в течение 1 мин и в 10% растворе белизны с добавлением 5 мкл Tween 20 в течение 10 мин. Затем листья промывали 5 раз стерильной дистиллированной водой и нарезали их на отдельные экспланты размером 0,5 х 0,5 см. Для трансформации стерильных листовых эксплантов табака использовали штамм A. rhizogenes А4
который предварительно культивировали в жидкой среде LB с добавлением 100 мг/л рифампицина в течение суток. Затем культуры агробактерий центрифугировали при 4 тыс. об./мин в течение 10 минут при температуре 18°С
и осадок растворяли в 20 мл жидкой среды МС с добавлением 100 мкМ ацетосирингона. Суспензию агробактерий культивировали на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение получаса
после чего проводили инокуляцию листовых эксплантов совместно с A. rhizogenes по стандартной методике
[Дрейпер и др.
1991]. Затем экспланты подсушивали на фильтровальной бумаге и в течение двух суток сокультивировали с агробактериями (при 23°С) на агаризованной среде МС без добавления антибиотиков; после этого экспланты пересаживали на среду
содержащую дополнительно 300 мг/л цефотаксима для избавления от агробактерий (табл. 1). Культуры корней культивировали на безгормональной твердой среде МС при температуре 25˚С на свету. Далее для получения каллусов косматые корни пересаживали на среду МС с добавлением нафтилуксусной кислоты (НУК) (2 мг/л) и кинетина (0,2 мг/л). Для индукции побегообразования полученные каллусные культуры пересаживали на чашки Петри со средой МС с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) (0,5 мг/л) и индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (0,17 мг/л). Укоренение регенерировавших побегов проводили на безгормональной среде МС. Для ПЦР-анализа косматых корней на наличие гена rolA использовали праймеры GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG и TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
а для поиска гена rolC применялись праймеры GATGATGCGATGCTTTTATG и CAGAGACTTTCCCTTTGTTGA.

Таблица 1.
Фитогормоны и антибиотики
добавленные в среду МС
[по Hatamoto et al.
1990].
Вещество
мг/лИндукция hairy rootsИндукция каллусовИндукция побегообразования
Нафтилуксусная кислота-2-
Индолил-3-уксусная кислота--0,17
6-бензиламинопурин--0,5
Кинетин-0,2-
Цефотаксим300300-

Результаты и обсуждение
Методом инокуляции в суспензии A. rhizogenes штамма А4 было трансформировано 20 листовых эксплантов (рис. 1а). Через 10 дней после этапа сокультивирования эксплантов с почвенной агробактерией наблюдали появление адвентивных корней на всех образцах
причем эти корни имели характерный для hairy roots фенотип. У них отмечалась высокая скорость развития
активное образование боковых корней
быстрый и агравитропный рост (рис. 1б). Для получения каллусной культуры наиболее активно растущие корни пересаживали на среду МС с добавлением НУК и кинетина. Спустя 10 дней наблюдали образование светло-зеленой каллусной ткани средней плотности (рис. 1в). Далее культуры полученных каллусов пересаживали на среду МС с добавлением БАП и ИУК с целью индуцирования регенерации побегов. Спустя две недели наблюдали появление многочисленных точек регенерации (рис. 1г).

Рис.1. Получение hairy roots
индукция каллусообразования и побегообразования: а – листовые экспланты после двухсуточного сокультивирования с A. rhizogenes; б - образовавшиеся на трансформированных листовых эксплантах адвентивные корни с фенотипом hairy root; в – образование морфогенного каллуса на hairy roots; г - появление многочисленных точек регенерации побегов на каллусах.
Культивирование развивающихся регенерантов проводили в сосудах со средой МС без добавления фитогормонов (рис. 2а
б). Все регенеранты хорошо укоренялись на среде МС
после чего их пересаживали на почвенную смесь
накрывали прозрачными сосудами и выращивали при температуре 26±1°С на свету (рис. 2в). Акклиматизированные к условиям почвы регенеранты имели признаки
типичные для трансгенных по rol-генам растений. Например
они имели выраженную кустистость
небольшой размер (карликовость)
темно-зеленые ланцетовидные морщинистые листья и короткие междоузлия (рис. 2г). В целом в ходе работы было получено 15 трансгенных по rol-генам растений табака.

Рис. 2. Укоренение и акклиматизация регенерантов к условиям почвы: а – культивирование регенерантов в сосудах со средой МС; б – укоренение регенеранта через 10 дней выращивания; в – регенерант
пересаженный на почвенную смесь для акклиматизации; г – взрослое трансгенное по генам rol растение
После этапа акклиматизации растений-регенерантов к условиям почвы нами была поставлена задача выяснить
сохраняются ли rol-гены в этих растениях и можно ли получить на их листьях косматые корни на безгормональных средах без дополнительных процедур индукции корнеобразования. Для этого производили стерилизацию листьев акклиматизированных регенерантов по стандартной методике (70% спирт и 10% белизна). Далее листовые экспланты культивировали в чашках Петри на безгормональной среде МС. Через несколько дней на эксплантах наблюдали начало появления адвентивных корней по фенотипу похожих на hairy roots. Так
через шесть дней появились первые корни в количестве 4 шт. Максимальное количество корней (14 шт.) отмечалось на восьмой день культивирования. Всего за 15 дней выросло 63 адвентивных корня
далее появление новых корней прекратилось. Необходимо отметить
что на эксплантах табака дикого типа при этих же условиях адвентивные корни вовсе не появлялись. Через две недели после изолированного культивирования полученных адвентивных корней из них были отобраны 20 наиболее активно растущих линий. ПЦР-анализ с праймерами на гены rolA и rolC показал наличие этих онкогенов в ДНК всех исследуемых двадцати линий корней (рис. 3).


Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа полученных корней на наличие генов rolA и rolС. К1 – отрицательный контроль (ДНК табака дикого типа); К2 – положительный контроль (ДНК A. rhizogenes); К3 – положительный контроль (ДНК hairy roots); 1-20 – образцы ДНК двадцати анализируемых адвентивных корней
спонтанно образующихся на эксплантах растений-регенерантов
Таким образом
в ходе проведённых экспериментов нами получены взрослые трансгенные по rol-генам растения табака. На эксплантах листьев этих трансгенных растений на безгормональных питательных средах индуцировалось образование косматых корней. Это позволяет сделать заключение о том
что регенерирующая способность N. tabacum достаточно высока
что дает возможность использование такого способа для устойчивого сохранения культур hairy roots с полезными признаками в течение длительного времени. Также нами получены семена у трансгенных растений и планируются работы по получению растений с rol-генами второго поколения и проведению их морфофизиологического анализа при нормальных и стрессовых условиях.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз