К вопросу об участии ауксинов в индукции и регуляции морфогенеза в модельной каллусной системе in vitro (на примере злаков)

Авторы:
Круглова Н.Н. , Сельдимирова О.А. , Веселов Д.С.
Название:
К вопросу об участии ауксинов в индукции и регуляции морфогенеза в модельной каллусной системе in vitro (на примере злаков)
Страницы:
289-297
скачано
43 раз(а)


Универсальность путей морфогенеза in vivo
in situ и in vitro позволяет выбрать модель для изучения закономерностей и особенностей морфогенетических процессов у растений
в том числе при эмбриональном и раннем постэмбриональном развитии. Перспективные модельные системы в этой области исследования – каллусные культуры in vitro. В данной статье представлен краткий обзор литературных и собственных данных
полученных при исследовании фитогормональных (главным образом ауксиновых) особенностей индукции каллусогенеза и путей морфогенеза in vitro в каллусах культурных злаков. Показана зависимость между ауксиновым статусом эксплантов и их способностью как к формированию каллусов
так и к морфогенезу каллусов in vitro. Методологический подход
состоящий в выявлении и использовании оптимального баланса эндогенных (в составе экспланта) и экзогенных (в составе питательной среды) ауксинов
позволяет приблизиться к  процессу управления путями морфогенеза in vitro в модельных каллусных системах.
Сложнейшей фундаментальной проблемой биологии развития остается морфогенез растений – последовательная цепь изменений формы в онтогенезе
приводящих к созданию высокоспецифичной пространственной структуры (по
[Синнот
1963; Бутенко
1964; Гилберт
1995; Иванов
2011]). Особенно острое звучание эта проблема приобретает при анализе морфогенеза растений in vitro
[Бутенко
1994; Nosov
1999; Zhuravlev
Omelko
2008]
а также эмбрионального и раннего постэмбрионального развития растений как in vivo
[Батыгина
1987
2000
2014; Batygina
1999
2005]
так и in vitro
[Батыгина и др. 1978; Круглова и др.
2005; Батыгина и др.
2010; Elhiti
Stasolla
2011; Seldimirova
Kruglova
2013; Сельдимирова
Круглова
2014].
Исследования в области морфогенеза растений приобрели особую значимость. Это вызвано рядом причин. Во-первых
растительный морфогенез – весьма пластичный и обратимый процесс
что позволяет достаточно легко манипулировать развитием растения
изучать отдельные стадии развития независимо от других. Кроме того
активно развивающиеся в последнее время практические направления
использование достижений генной инженерии для создания новых форм растений требуют и более фундаментальных знаний и соответственно исследований в области биологии растений
в том числе изучения механизмов их развития. Однако исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов
зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий.
При изучении феномена морфогенеза большое внимание уделяется системному подходу
позволяющему понять функционирование организмов как целостных и динамических систем
не сводимых к простой сумме своих элементов
[Берталанфи
1969; Урманцев
1979; Gutierrez et al.
2005; Kumar 2013]. Использование системного подхода выявило универсальность путей морфогенеза в естественных условиях in vivo и в условиях экспериментов in situ и in vitro
[Батыгина и др. 1978; Батыгина
2000
2014; Батыгина и др.
2010; Batygina
2012; Батыгина
Осадчий
2015]. Такая универсальность позволяет выбрать более удобную
чем целый организм
модель для изучения закономерностей и особенностей морфогенетических процессов у растений.
Перспективные модельные системы в этой области исследования – каллусные культуры in vitro. Основанием для использования каллусных тканей в качестве моделей служит главным образом важная роль клеток в процессах морфогенеза – темпы и ориентация клеточных делений
рост клеток и их дифференциация.
Первые работы
посвященные получению каллуса из сегментов мезофилла листа и изучению каллусогенеза как пути морфогенеза in vitro
появились еще в конце XIX-начале XX вв. (по
[Sugiyama
2015])
однако однозначного определения каллуса не предложено (по
[Круглова
Сельдимирова
2010; Ikeuchi et al.
2013
2015]). В своих исследованиях мы придерживаемся следующих характеристик каллуса: это изначально гетерогенная интегрированная система
образующаяся в результате пролиферации клеток разных органов; состоит из групп клеток
имеющих морфогенетические потенции
которые реализуются различными путями морфогенеза in vitro (по
[Батыгина и др.
2010; Круглова
Сельдимирова
2010]).
Особый интерес вызывают каллусы
полученные из различных эксплантов злаков. Такой интерес обусловлен сложностью морфогенетических процессов в культуре in vitro у представителей этой группы растений как проявлением изменчивости генома в процессе каллусообразования in vitro
которой злаки особенно подвержены в силу незначительной «ювенилизации» генома однодольных (по
[Kunakh
1999]). Немаловажное значение в данном случае имеет и разработка биотехнологических способов получения новых генотипов культурных злаков
в том числе на основе использования каллусов
[Основы биотехнологии..
2017 и др.]
Цель данной статьи – краткий обзор литературных и собственных данных
полученных при исследовании особенностей индукции каллусогенеза и путей морфогенеза in vitro в каллусах культурных злаков под воздействием ауксинов.
Хорошо известно
что ауксины (гетероауксин
ИУК
НУК
2,4-Д) – группа обладающих аттрагирующим эффектом фитогормонов стимулирующего действия
главным образом активирующих деление
растяжение и дифференциацию клеток
а также формирование сосудов и боковых корней
[Медведев
Шарова
2011]
т.е. принимающих участие в основных морфогенетических процессах растений. Неудивительно поэтому их активное применение в экспериментах по исследованию различных аспектов морфогенеза in vitro
в том числе в каллусных культурах.
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том
что индукция формирования в условиях in vitro  каллусов различных растений
не только злаков
в значительной степени определяется физиологическим статусом экспланта в момент инокуляции на питательную среду
а также условиями культивирования
важнейшее среди которых – оптимальная концентрация в питательной среде фитогормонов
главным образом ауксинов
[Батыгина и др.
2010; Круглова
Сельдимирова
2010
2011; Segui-Simarro
2010; Ikeuchi et al.
2013; Gorbatyuk et al.
2015; Doubled haploidy..
2016; Hisano et al.
2016; Seldimirova et al.
2016b,c; Основы биотехнологии..
2017 и др.].
Подчеркнем
что оптимальная концентрация ауксинов расценивается как важнейший фактор
определяющий индукцию иных
помимо каллусогенеза
путей морфогенеза in vitro в  эксплантах злаков – эмбриоидогенеза и полиэмбриоидогенеза
[Батыгина и др.
2010; Круглова
Сельдимирова
2011
2013; Мирошниченко и др.
2012; Cельдимирова
Круглова
2015; Zur et al.
2015
2016; Seldimirova et al.
2016b,c; Titova et al.
2016]. Важная роль ауксинов в процессах каллусогенеза in vitro обусловлена большим значением этой группы фитогормонов в различных аспектах морфогенеза
[Mockaitis
Estelle
2008; Медведев
Шарова
2011; Phytohormones..
2012; Розов и др.
2013; Bykova et al.
2016 и др.] и эмбриогенеза
[Hess et al.
2002; Сельдимирова и др.
2017; Seldimirova et al.
2017] растений.
Накоплен достаточный экспериментальный материал по изучению влияния ауксинов на индукцию формирования каллусов в культуре in vitro таких эксплантов злаков
как пыльники
зародыши
апикальная меристема побега
семена
[Круглова
Катасонова
2009; Cha-um et al.
2009; Круглова
Сельдимирова
2010
2011; Lee
Huang
2013; Slesak et al.
2013; Bevitori et al.
2014; Delporte et al.
2014; Gorbatyuk et al.
2015; Doubled haploidy..
2016; Hisano et al.
2016; Mohd Din et al.
2016 и др.]. Установлено
что в ходе культивирования in vitro на индукционной среде происходит дедифференциация исходных специализированных или меристематических клеток экспланта с переходом их в состояние каллусных. Этот процесс связан со структурной перестройкой исходных клеток и индукцией в них способности к последовательным делениям с итоговой пролиферацией клеток. В целом
вопрос репрограммирования клеток каллуса решается в контексте общей проблемы изменчивости генома в процессе дедифференциации и каллусообразования in vitro
[Кunakh
1999; Дубровная
Бавол
2011; Sugiyama
2015].
После переноса на регенерационную среду в каллусах злаков выявлены различные пути морфогенеза in vitro: эмбриоидогенез (формирование эмбриоида – зародышеподобной структуры)
органогенез по типам геммогенеза (формирование почек)
ризогенеза (формирование корней)
гемморизогенеза (формирование и почек
и корней)
а также гистогенез (формирование различных тканей). Установлено
что в случае органогенеза in vitro к формированию растений приводит гемморизогенез
в ряде случаев – геммогенез после фитогормонального индуцирования ризогенеза в том же самом каллусе
тогда как ризогенез представляет собой «тупик» морфогенеза
[Круглова
Сельдимирова
2010
2011
2013; Батыгина и др.
2010; Segui-Simarro
2010; Slesak et al.
2013; Основы биотехнологии..
2017 и др.].
Индукция конкретного пути морфогенеза in vitro в каллусах злаков
как и в случае индукции формирования каллуса
также во многом детерминирована физиологическим статусом экспланта и условиями культивирования
главным образом
оптимальной концентрацией фитогормонов
[Круглова
Сельдимирова
2010
2011
2013 и др.]. Однако морфогенетические потенции клеток каллуса могут меняться в зависимости от характера связей между группами клеток в каллусе
что
в свою очередь
обусловлено формой и размером каллуса и иными факторами.
Предприняты попытки найти место фитогормонов в прохождении путей морфогенеза в каллусах in vitro. Еще в 1957 г. Ф. Скуг и К. Миллер
[Skoog
Miller
1957]
изучив влияние экзогенных фитогормонов на морфогенез в каллусе
полученном из сердцевинной паренхимы стебля табака
предложили концепцию
согласно которой морфогенетические реакции тканей и органов регулируются количественным соотношением экзогенных ауксинов и цитокининов. Данная концепция доминирует в области культивирования эксплантов in vitro до настоящего времени.
Важен вопрос о содержании и распределении в клетках каллусов в процессе органогенеза in vitro эндогенных фитогормонов. Один из способов оценки содержания гормонов в клетках основан на использовании искусственных конструкций
в которых репортерный ген ставится под контроль промотора
чувствительного к тому или иному гормону. У растений
трансформированных с помощью такой конструкции
искомые гормоны активируют экспрессию трансгенов
кодирующих или белки ферменты
или флюоресцирующие белки
присутствие которых в клетках можно обнаружить визуально. Выявлено
например
распределение и взаимодействие эндогенных ауксинов и цитокининов в клетках каллусов арабидопсиса в процессе органогенеза in vitro
[Cheng et al. 2013]. Однако использование этого подхода для каллусов злаков ограничено сложностями трансформации однодольных растений.
Использование иммуногистохимического метода
[Vysotskaya et al.
2007; Kudoyarova et al.
2014] позволило внести определенную ясность в сложный вопрос изменения в распределении ауксинов и цитокининов при индукции формирования каллуса и процесса гемморизогенеза in vitro у злаков на примере пшеницы
[Seldimirova et al.
2016a]. Обнаружено значительное иммуноокрашивание обоих гормонов в пролиферирующем каллусе и особенно в тех его зонах
клетки которых участвуют в формировании органов; интенсивное иммуноокрашивание обоих гормонов было также обнаружено в местах каллуса
где инициируются апексы побега и корня. В ходе дальнейшего развития апексы побегов значительно окрашивались на цитокинины
тогда как иммуноокрашивание на ауксины было более интенсивным в местах инициации примордиев листьев. В развивающихся корнях интенсивность иммуноокрашивания обоих гормонов достигала максимума в апексе корня и постепенно снижалась по мере удаления от него. Клетки развивающихся прокамбиальных тяжей также интенсивно окрашивались на цитокинины и ауксины. Как полагают авторы
полученные данные свидетельствуют о значительном сходстве распределения изученных гормонов в органах in vitro и in vivo.
Однако ставшая классической концепция Скуга-Миллера рядом авторов оценивается скорее как эмпирическая закономерность. Л.Р. Сайб и М.К. Карабаев
[Сайб
Карабаев
1991]
исходя из общей теории онтогенеза
предложили свою модель фитогормональной регуляции морфогенеза растений. Формирование органов при этом рассматривается как пространственная организация дифференциации. Этот процесс
по мнению исследователей
можно объяснить с помощью теории морфогенетических полей Чайлда
согласно которой вдоль развивающейся системы должен существовать градиент некоторых свойств (метаболический
морфогенетического потенциала и т.п.). При этом апикальный или дистальный район системы
образующийся автономно или являющийся доминантным
вырабатывает поле определенной протяженности
которое контролирует морфогенетические процессы в системе. По-видимому
такая концепция имеет право на существование
однако требует экспериментальных подтверждений.
Кроме того
концепция Скуга-Миллера
разработанная на примере табака
не всегда «работает» на других видах растений. Выявлено
например
что морфогенез in vitro в каллусах ряда злаков зависит от концентрации иных
помимо ауксинов и цитокининов
экзогенных фитогормонов: этилена
[Kiviharju et al.
2005]
гибберелловой кислоты
[Colebrook et al.
2014]
абсцизовой кислоты
[Zur et al.
2015].
На наш взгляд
при анализе путей морфогенеза in vitro клеток каллуса применима концепция эпигенетической изменчивости растений
[Медведев
Шарова
2010; Ashapkin et al.
2016]. Вполне вероятно
что в рассматриваемых случаях происходит реализация эпигеномных подпрограмм развития компетентных к морфогенезу in vitro клеток каллуса. В случаях с каллусами
полученными в культуре пыльников
ситуация усложняется тем
что каллусные клетки
способные к развитию по определенному пути морфогенеза in vitro с формированием эмбриоидов
органов или тканей
берут начало от одной клетки – микроспоры
реализующей в данном случае свою эпигеномную спорофитную подпрограмму развития. Более того
в зависимости от условий культивирования (главным образом
от ауксинового состава индукционной среды) микроспора может развиваться по спорофитной подпрограмме с образованием растения-регенеранта не только через этап формирования каллуса
но и альтернативно – через этап формирования эмбриоида.
Абсолютное большинство исследователей для определения оптимального гормонального состава питательной среды как для индукции формирования каллуса
так и для индукции конкретного пути морфогенеза in vitro в нем используют эмпирический перебор широкого диапазона различных комбинаций и концентраций фитогормонов. В результате подбор оптимальной концентрации фитогормонов оказывается достаточно трудоемким и дорогостоящим. Необходим поиск надежного подхода к прогнозированию этого параметра на основе эндогенных физиологических показателей эксплантов. Учитывая большое значение эндогенных фитогормонов в определении тотипотентности
[Phytohormones..
2012]
можно предположить
что морфогенетическая компетентность эксплантов и каллусов обусловлена содержанием в них эндогенных фитогормонов.
В литературе вопрос о соотношении эндогенных фитогормонов (в составе экспланта) и экзогенных фитогормонов (в составе питательной среды) как в индукции формирования каллусов
так и в регуляции путей морфогенеза in vitro в каллусах злаков поставлен достаточно давно
[Gorbunova et al.
2001; Jimenez
Bangerth
2001]
однако исследований на эту тему выполнено сравнительно немного (например
[Huang et al.
2012; Hisano et al.
2016]). Основная причина этого – сложность и трудоемкость традиционных методов определения содержания эндогенных фитогормонов в эксплантах. Избежать этих трудностей позволяет метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) растительных образцов
[Иммуноанализ..
2000] для предварительного анализа эксплантов.
Используя метод ИФА
а также методологический подход
предложенный В.Ю. Горбуновой и др.
[Gorbunova et al.
2001]
нами на пшенице показана возможность индукции формирования пыльниковых каллусов и регуляции путей морфогенеза in vitro в них путем выявления для каждого сорта адекватного баланса между содержанием эндогенной ИУК в пыльниках донорных растений при инокуляции на питательную среду и концентрацией экзогенного ауксина в составе питательной среды. Так
методом ИФА было выявлено
что ряд изученных сортов пшеницы
отнесенных к группе высокоауксиновых
содержали в пыльниках сравнительно высокое количество эндогенного ауксина ИУК: сорт Скала – 324,8±38,1; сорт Башкирская 26 – 276,9±3,7; сорт Омская 35 – 429,5±6,3 нг/г сухого веса. Индукция формирования каллусов наблюдалась у этих сортов при использовании питательной среды
содержащей синтетический ауксин 2,4-Д в сравнительно низких концентрациях – 1,0 мг/л у сорта Омская 35 и 1,0-1,5 мг/л у сортов Скала и Башкирская 26. Другие изученные сорта
отнесенные к группе низкоауксиновых
характеризовались сравнительно низким эндогенным содержанием ауксина ИУК в пыльниках: сорт Салават Юлаев – 71,4±6,5; сорт Жница – 59,4±10,3; сорт Дуэт – 45,8±2,3 нг/г сухого веса. К индукции формирования каллуса у этих сортов приводило использование питательной среды со сравнительно высокими концентрациями 2,4-Д – 1,5 мг/л у сортов Жница и Дуэт и 1,5-2,0 мг/л у сорта Салават Юлаев
[Seldimirova et al.
2016с].
На примере этих же сортов пшеницы нами показана возможность регуляции путей морфогенеза in vitro в пыльниковых каллусах при культивировании на питательной среде с различной концентрацией экзогенного ауксина ИУК. Приведем в качестве примера индуцирование таких важных в биотехнологическом отношении путей морфогенеза в каллусах
как эмбриоидогенез и гемморизогенез. Выявлено
что эмбриоидогенез в каллусах высокоауксиновых сортов пшеницы индуцируется при концентрации экзогенной ИУК 0.1 мг/л
а в каллусах низкоауксиновых сортов – 0.5 мг/л. К гемморизогенезу в каллусах высокоауксиновых сортов приводило использование концентрации экзогенной ИУК 0.5 мг/л
а в каллусах низкоауксиновых сортов – 1.5 мг/л
[Cельдимирова
Круглова
2015].
Анализ приведенных экспериментальных данных свидетельствуют о том
что баланс между содержанием эндогенного ауксина ИУК в экспланте и концентрацией экзогенного ауксина 2,4-Д в питательной среде для индукции формирования каллуса и ИУК для индукции путей морфогенеза in vitro в каллусах состоит в обратной зависимости между этими показателями. На наш взгляд
определяющую роль в таком балансе играет генотип донорного растения
детерминирующий признак «уровень эндогенных гормонов в экспланте».
Взаимодействие эндогенных и экзогенных фитогормонов и в частности ауксинов в культуре in vitro до настоящего времени остается на уровне констатации феномена. Это можно объяснить множественным действием на эксплант одного и того же гормона (например
[Colebrook et al.
2014; Zur et al.
2015; Hisano et al.
2016])
поэтому очень трудно связать воедино механизм действия гормона и клеточный ответ на него. Тем не менее
предложенный подход предварительного выявления для каждого сорта пшеницы адекватного баланса между содержанием эндогенных ауксинов в эксплантах при инокуляции на питательную среду и концентрацией экзогенных ауксинов в составе питательной среды позволяет оптимизировать процесс биотехнологии тиражирования регенерантов на основе индукции нужного для этого пути морфогенеза in vitro в каллусах (как правило
это гемморизогенез
[Seldimirova et al.
2016a]). В целом
широкий спектр физиологической активности ауксинов и достигнутые с их помощью успехи в реализации морфогенетического потенциала каллусных клеток позволяют считать именно баланс эндогенных и экзогенных ауксинов одним из основных факторов управления морфогенезом in vitro.
Таким образом
для злаков хорошо установлено участие ауксинов как в формировании каллусов
так и в регуляции путей морфогенеза в каллусах in vitro. Методологический подход
состоящий в выявлении и использовании оптимального баланса эндогенных (в составе экспланта) и экзогенных (в составе питательной среды) ауксинов
позволяет приблизиться к  процессу управления путями морфогенеза in vitro в модельных каллусных системах.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз