Применение CRISPR/Cas-локусов не для редактирования геномов

Авторы:
Кулуев Б.Р. , Баймиев Ан.Х. , Чемерис Д.А. , Матниязов Р.Т. , Геращенков Г.А. , Никоноров Ю.М. , Баймиев Ал.Х. , Чемерис А.В.
Название:
Применение CRISPR/Cas-локусов не для редактирования геномов
Страницы:
271-283
скачано
55 раз(а)


В статье рассмотрены различные применения CRISPR-локусов и их компонентов: а) для генотипирования штаммов некоторых бактерий (CRISPR-кассеты); б) для исследования фундаментальных вопросов функционирования отдельных генов, генных сетей и РНК-транскриптов (CRISPR/dCas системы); в) для высокочувствительной CRISPR-Dx детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот (нуклеаза Cas13a).
Введение
CRISPR/Cas-системы находят применение не только для редактирования геномов различных организмов. Исторически первым оказалось использование CRISPR-кассет для генотипирования штаммов бактерий, которое началось задолго до того, как стала ясна роль CRISPR-локусов в жизнедеятельности микроорганизмов. Причем оно продолжается и поныне преимущественно для ряда патогенных микроорганизмов. CRISPR/Cas системы в виде комплекса из гидовых РНК (гидРНК) с каталитически неактивными dCas белками используются для получения фундаментальных знаний о функционировании генов и геномов организмов различных уровней генетической сложности. Недавно одну из Cas нуклеаз (Cas13a или C2c2) предложено использовать для CRISPR-Dx детекции в режиме реального времени результатов предварительной амплификации с помощью рекомбиназной полимеразной амплификации, что сулит определенные преимущества, в том числе благодаря изотермичности этого процесса.
Генотипирование микроорганизмов
с помощью CRISPR-кассет
Методов выявления полиморфизма ДНК, применяемых для генотипирования микроорганизмов, существует немало. Большинство из них предложены достаточно давно, некоторые прошли ряд усовершенствований и до сих пор активно используются, а часть осталась в прошлом. Многие из применяемых и сейчас методов генотипирования штаммов микроорганизмов описаны, например, в обзоре Li и соавторов [Li et al., 2009], озаглавленном «Bacterial strain typing in the genomic era», подготовленном после появления методов полногеномного секвенирования новых поколений, которое также является основой для генотипирования штаммов. Здесь мы не ставим целью рассматривать все существующие методы и подходы и тем более их сравнивать на предмет большей пригодности в тех или иных случаях для ДНК-паспортизации / ДНК-идентификации отдельных штаммов, поскольку фактически коснемся лишь одного метода, основанного на различиях спейсерных участков в составе CRISPR-кассет .
В заглавной статье данного номера журнала [Кулуев и др., 2017] нами затронуты вопросы истории изучения CRISPR-локусов, где было отмечено, что сначала некие особые последовательности нуклеотидов были найдены у кишечной палочки E.coli [Ishino et al., 1987], затем подобные участки были выявлены также у грамм-положительных бактерий [Hermans et al., 1991] и еще через некоторое время - у архей [Mojica et al., 1993]. Получилось так, что именно обнаружение в геноме археи Haloferax mediterranei почти совершенных повторов длиной 30 п.н., разделенных спейсерами сходного размера, послужило развитию дальнейших исследований в этой области и привело в итоге через два десятилетия к нынешней CRISPR/Cas технологии геномного редактирования. При этом в начале 90-х прошлого столетия после обнаружения необычных повторов у туберкулезной палочки Mycobacterium tuberculosis [Hermans et al., 1991] параллельно стало развиваться и это направление исследований, приведшее к разработке способа ДНК-идентификации штаммов некоторых видов бактерий, в первую очередь патогенных в виде DVR-PCR (Direct Variable Repeat) амплификации [Groenen et al., 1993]. Спустя несколько лет на основе полиморфизма тех же повторов был предложен иной метод, получивший название spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) [Aranaz et al., 1996], в основе которого лежит амплификация CRISPR-кассет с помощью фланкирующих квазитандемные повторы праймеров, (один из которых мечен биотином), сопровождаемая молекулярной гибридизацией с выбранными 43 спейсерами, сорбированными на нейлоновых фильтрах, с последующим ферментативным проявлением результатов гибридизации и их оцифровкой [Molhuizen et al., 1998; Botelho et al., 2015; Mokrousov, Rastogi, 2015].
Сполиготипирование штаммов (преимущественно патогенных микроорганизмов) используется на протяжении многих лет и востребовано в настоящее время [Goguet de la Salmonière et al., 1997; Goyal et al., 1997; Kamerbeek et al., 1997; Sola et al., 1998; Driscoll, 2009; Mokrousov, Rastogi, 2015; Sola, 2015; Suzana et al., 2017], считаясь даже «золотым стандартом» генотипирования для туберкулезных палочек M.tuberculosis [Shariat, Dudley, 2014]. Были проведены исследования на предмет глобального распространения конкретных штаммов туберкулезной палочки на разных континентах различными исследовательскими группами из многих стран, включая Россию [Filliol et al., 2002; 2003]. Выработаны соответствующие рекомендации, созданы специализированные базы данных по сполиготипированию штаммов M.tuberculosis, разработаны разнообразные программные продукты [Dale et al., 2001; Sebban et al., 2002; Brudey et al., 2006; Grissa et al., 2008; Tang et al., 2008; Demay et al., 2012]. Также предложены различные модификации сполиготипирования [Cowan et al., 2004; Honisch et al., 2010; Zhang et al., 2010; Ruettger et al., 2012; Bespyatykh et al., 2014; Tu et al., 2016], в том числе объединенного с выявлением мутаций в рифампициновом гене, что получило название «spoligoriftyping» [Gomgnimbou et al., 2012].
В одной из статей [Mokrousov, Rastogi, 2015] упоминается, что при поиске в базе данных PubMed терминов «spoligotyping» и «spoligotype» с булевым оператором OR по состоянию на 3 апреля 2015 г. таких статей оказывается 1117. Проведенный нами спустя два с половиною года аналогичный поиск показал цифру в 1261 опубликованную статью, начиная с 1996 г. При этом мы проследили выход публикаций с такими терминами по годам, из которого видно начавшееся в этом столетие нарастание, достигшее пика в 110 статей в 2012 г., и затем некоторый наметившийся спад таких публикаций. Причем, как отмечают те же авторы [Mokrousov, Rastogi, 2015] в последние годы сполиготипирование используется для идентификации штаммов практически только туберкулезной палочки, хотя некоторое время назад полиморфизм CRISPR-кассет применялся и для других патогенных бактерий, вызывающих, например, тиф, дифтерию [Pourcel et al., 2005; Mokrousov et al., 2007; 2009; Cui et al., 2008], что тоже могло сказаться на снижении числа статей с этими терминами. Хотя в некоторых обзорных статьях говорится о применении полиморфизма CRISPR-кассет для генотипирования и других микроорганизмов, в том числе и патогенных [Grissa et al., 2009; Barrangou, Dudley, 2015], тем более, что благодаря полногеномному секвенированию с помощью биоинформатического подхода CRISPR-локусы стало относительно легко находить. При этом сполиготипирование все же не может служить универсальным методом для всех бактерий, поскольку используемые на этапе молекулярной гибридизации спейсеры являются по сути уникальными для каждой группы микроорганизмов, да и не все микроорганизмы такие локусы содержат. Компьютерным программам для поиска in silico CRISPR-кассет в секвенированных последовательностях микроорганизмов и базам данным по таковым посвящена специальная статья [Баймиев и др., 2017].

Исследование функционирования генов
с помощью CRISPR/dCas систем
Кроме внесения наследуемых изменений в редактируемые геномы различных организмов с помощью CRISPR/Cas технологии , с использованием модифицированной системы CRISPR/dCas можно также исследовать функционирование отдельных генов путем временной (обратимой) репрессии или активации их транскрипции, изменением их эпигенетического статуса, а также маркировать отдельные участки генома in vivo. Это открывает небывалые перспективы для изучения работы всего генетического аппарата, и переводит подобные исследования фактически на новый методологический уровень, недостижимый ранее. Такое расширение спектра возможностей CRISPR/Cas систем позволило одному из известных специалистов, стоявших у истоков нынешнего геномного редактирования G.Church и его соавторам сравнить CRISPR/Cas технологию со знаменитым швейцарским армейским ножом, имеющим, как известно, не только простое лезвие [Vora et al., 2016].
Так, вскоре после того как была разработана CRISPR/Cas9 технология редактирования геномов организмов различных уровней генетической сложности, был предложен метод временного блокирования, репрессии работы отдельных генов или их нокдауна, получивший название CRISPR interference (CRISPRi) на примере бактерий и культуры клеток человека [Qi et al., 2013]. Ключевым моментом в таких исследованиях явилось использование ферментативно неактивного белка dCas9 (dead Cas9), у которого произведены инактивирующие мутации в обоих каталитических доменах . Было продемонстрировано, что комплекс из такой нуклеазы с гидРНК, нацеленной благодаря гомологии ее нуклеотидной последовательности на конкретный участок какого-либо гена, включая его промоторную область, мешает работе РНК-полимеразы и таким образом соответствующая мРНК не образуется. Причем, в цитируемой работе на культуре клеток человека было показано, что можно одновременно проводить мультитаргетный нокдаун различных генов без видимых off-target эффектов. В своей следующей работе этой группе авторов удалось заметно повысить эффективность нокдауна генов у дрожжевых клеток и клеток человека [Gilbert et al., 2013].
В случае необходимости вызвать активацию работы конкретного гена (CRISPRa) в нужное место (в промоторную область) требуется доставить соответствующий белок-активатор транскрипции, «пришив» его к dCas9 нуклеазе и направив ее в виде комплекса с гидРНК к выбранному месту в геноме, зная последовательность этого участка. Так, было показано, что нокдаун генов человека в культуре клеток может достигнуть 90 - 99%-ной эффективности, а совместное действие репрессии/активации (CRISPRi/a) способно обеспечить тысячекратную модуляцию генной экспрессии [Gilbert et al., 2014]. Собственно, с помощью специально подобранной гидРНК можно доставить dCas9 белок, сшитый с каким-либо подходящим белковым доменом практически в любое место генома in vivo и наблюдать результат такого воздействия. Так, например, к dCas9 нуклеазе были добавлены каталитические домены некоторых ДНК метилтрансфераз, что позволило наблюдать метилирование CpG сайтов в промоторных областях ряда генов, с которыми связались гидРНК [Liu et al., 2016; Vojta et al., 2016; Xu et al., 2016].
Помимо того, что с dCas9 нуклеазой можно получать различные fusion-белки, присоединяя соответствующие домены на NH2- или COOH-концы белковой молекулы, в одной из работ было показано, что за счет того, что так называемые тетрапетля и петля 2 гидРНК при образовании комплекса с Cas9 нуклеазами не принимает участия в РНК/белок взаимодействии, то в эти места можно добавить экстрапоследовательности РНК в виде неких аптамерных молекул, связывающих какие-либо другие белки, что расширило возможности использования подобных комплексов для исследования функционирования генов [Konermann et al., 2015].
К сожалению, пока работ по различным модификациям геномов (CRISPRi, CRISPRa) с растительными объектами крайне мало, тем не менее, таковые уже есть. Так, например, блокируя с помощью CRISPR интерференции транскрипцию некоторых генов мевалонатного пути биосинтеза терпеноидов, удалось повысить выход изопрена – мономера натурального каучука [Kim et al., 2016]. На арабидопсисе было показано, что с помощью нескольких гидРНК в комплексе с dCas9 белком можно проводить мультиплексное ингибирование транскрипции [Lowder et al., 2015]. Однако все же в некоторых случаях, когда требуется инактивировать работу сразу ряда генов с помощью CRISPRi подхода, одной нуклеазы dCas9 может оказаться недостаточно, и поэтому было предложено использовать две разных нуклеазы (точнее то чего от них осталось), поскольку каталитическими свойствами такие белки обладать не должны. Так, недавно описано применение комплекса из гидРНК и мутантного белка ddCpf1 (DNase-dead) вместе с dCas9 со «своей» гидРНК для одновременного блокирования работы двух разных генов [Zhang et al., 2017]. Более чем 10-кратное блокирование транскрипции miR159b с помощью ddCpf1 продемонстрировано на арабидопсисе [Tang et al., 2017].
В одной из работ на примере комплексов dCas9 белка со 155 гидРНК, мишенями для которых служил 41 ген, было показано, что эффективность CRISPRi подхода сильно зависит от дизайна гидРНК и мест их таргетирования, которые желательно, чтобы приходились на сайт инициации транскрипции генов, работу которых требуется заблокировать [Radzisheuskaya et al., 2016]. Для оптимального дизайна гидРНК для CRISPRi и CRISPRa вариантов написаны две компьютерные программы CRISPR-ERA и SSC, рассмотренные в плане их применения для геномного редактирования в другой нашей статье [Чемерис и др., 2017].
Так, с помощью программы CRISPR-ERA (http://crispr-era.stanford.edu) [Liu et al., 2015] можно осуществлять дизайн гидРНК не только для геномного редактирования в виде нокаутирования отдельных генов (Editing), но и для изучения процессов репрессии (Repression) и активации (Activation) транскрипции интересующих исследователя генов. При работе с этой программой после выбора типа манипуляции с геномом (в рамках темы данной статьи – это может быть репрессия или активация гена), появляется возможность выбрать организм из небольшого списка (Human, Mouse, Rat, Zebrafish, D.melanogaster, C.elegans, S.cerevisiae, E.coli, B.subtilis; для CRISPRa – только эукариоты), затем указать конкретный ген и координаты мест для подбора гидРНК (от  1500 до +1500 нуклеотидов относительно сайта инициации транскрипции (СИТ) для CRISPRi и от  1500 до 0 нуклеотидов также относительно СИТ для CRISPRa и запустить процесс поиска. Программа выдаст результаты поиска гидРНК, которым будет присвоены оценки E (эффективность) и C (специфичность), а также сумма E+C.
Web-ресурс SSC (Sequence Scan for CRISPR) [Xu et al., 2015], находящийся по адресу http://cistrome.org/SSC/, позволяет осуществлять дизайн гидРНК не только для геномного редактирования, но и для проведения экспериментов по ингибированию и активации (CRISPRi/a) генных систем. Было обнаружено, что в отличие от нокаутирования подбор гидРНК для CRISPRi/a экспериментов имеет свои особенности и некоторые предпочтения. В частности, при анализе большого числа удачных гидРНК для CRISPRi/a экспериментов не наблюдается преимущественного нахождения цитозина в положении  3 относительно PAM, что характерно для нокаутных экспериментов, видимо потому что в CRISPRi/a исследованиях не требуется внесения разрывов в цепи ДНК. Для осуществления экспериментов по ингибированию и активации генов для подбора гидРНК с помощью программы SSC необходимо ввести через буфер обмена интересующую экспериментатора последовательность ДНК (не более 10 тысяч нуклеотидов), выбрать длину спейсера из 19 или 20 нуклеотидов и запустить процесс поиска подходящих участков, в результате которого наиболее эффективные гидРНК будут вверху списка и выданные программой SSC данные могут быть сохранены в разных форматах.
Такой метод как FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) является мощным инструментом при изучении хромосомной организации генетического материала, но его главным недостатком служит использование фиксированных цитологических препаратов. Предложенный вариант этого метода в виде CASFISH, основанный на использовании dCas9 белка, несущего подходящие флуорохромы, позволяет на нативных препаратах ядер в формате 3D регистрировать свечение красителей в местах, определяемых гидРНК, причем за этим процессом можно следить в динамике [Deng et al., 2015].
Недавно также in situ было продемонстрировано, что биотинилированный dCas9 белок в комплексе с соответствующей гидРНК способен узнавать участки хроматина и с помощью биотин-стрептавидиновой системы таковые изолировать [Liu et al., 2017], что может оказаться весьма востребованным, поскольку, таким образом, после предварительной фрагментации тем или иным способом геномной ДНК (хроматина) становится возможным провести изоляцию или обогащение интересующих экспериментатора участков генов в их природном состоянии в ощутимых количествах, а не работать с их амплифицированными копиями. Сходная работа по выделению целевых участков хроматина с помощью dCas9 нуклеазы и иммунопреципитации была выполнена ранее [Fujita, Fujii, 2013]. Используется для визуализации геномных последовательностей в живых клетках в качестве маркера и зеленый флуоресцентный белок, который для этого сшивается с инактивированной dCas9 нуклеазой [Chen, Huang, 2014].
Различным аспектам использования CRISPR/dCas систем в последнее время посвящено немало обзорных статей [Dominguez et al., 2015; La Russa, Qi, 2015; Ceasar et al., 2016; Enríquez, 2016; Miles et al., 2016; Wang, Qi, 2016; Canver et al., 2017; Donohoue et al., 2017; Marchisio, Huang, 2017; Plummer et al., 2017], в том числе с акцентом на растительную тематику [Puchta, 2016; Noman et al., 2016; Dreissig et al., 2017; Liu et al., 2017a; Seth, Harrish, 2017], однако ввиду нехватки информации авторы в них вынуждены значительное внимание уделять животным и бактериальным системам.
Прежде чем перейти к рассмотрению в следующем разделе нуклеазы Cas13a, разрушающей молекулы РНК и используемой для выявления специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, необходимо остановиться на недавно предложенном применении аналогичной нуклеазы Cas13b [Cox et al., 2017]. Так, показано, что специально созданная каталитически неактивная форма нуклеазы dCas13b из микроорганизма Prevotella sp., будучи объединенной с аденозиндеаминазой, способна в специфичных местах РНК транскриптов превращать аденозины в инозины (воспринимаемые системой трансляции как гуанозины) и таким образом исправлять нежелательные мутации на посттранскрипционном уровне. Созданная система получила удачное название REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement), прямо соответствующее выполняемому процессу. Также сообщено, что система REPAIRv2 характеризуется почти тысячекратным увеличением специфичности своего действия.

Изотермическая амплификация и CRISPR-Dx детекция специфичных последовательностей нуклеиновых кислот
Недавно был разработан новый высокочувствительный способ детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот, получивший броское название SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), также обозначаемый как CRISPR Dx [Gootenberg et al., 2017]. Одним из ключевых ферментов, обеспечивающих как раз детекцию нарабатываемых ампликонов, служит нуклеаза Cas13a (ранее известная как C2c2), относящаяся к VI A типу CRISPR/Cas систем, мишенью для которых служат молекулы РНК. Но прежде чем приступить к описанию такого способа детекции фрагментов РНК как SHERLOCK, необходимо уделить некоторое внимание начальному этапу этой CRISPR Dx диагностической системы в виде пока относительно малоизвестной РПА - Рекомбиназной Полимеразной Амплификации (RPA – Recombinase Polymerase Amplification), разработанной еще в 2006 г. [Piepenburg et al., 2006], но только в последние годы, набирающей популярность, как ее коммерциализацией вплотную занялась английская фирма TwistDx Ltd (https://www.twistdx.co.uk) . Так, в настоящее время этой фирмой выпускается несколько TwistAmp® наборов общего применения, рассчитанных на детекцию интересующих экспериментатора  специфичных фрагментов ДНК или РНК как в реальном времени, так и по конечной точке гель-электрофорезом, регистрацией флуоресценции, либо иммунодетекцией с помощью специальных полосок. Также еще производятся три специальных TwistAmp® набора с готовыми праймерами для обнаружения некоторых патогенных бактерий. Причем, благодаря изотермичности РПА, протекающей в диапазоне от 37 до 42оС, и отсутствию потерь времени на переходы от одной температуре к другой (что имеет место во время ПЦР) амплификация нужных фрагментов с фемтомолярной и даже аттомолярной чувствительностью завершается обычно за 3-20 мин в зависимости от используемого протокола.
Пожалуй, стоит отметить, что кроме детекции различных вирусов и микроорганизмов, в том числе в цельной крови [Euler et al., 2012; 2013; Clancy et al., 2015; Ma et al., 2017; Moore, Jaykus, 2017; Wang et al., 2017; Wu et al., 2017 и др.], в литературе имеются публикации об использовании РПА в исследованиях по растительной тематике. Так, сообщается об успешной с высокой чувствительностью и за короткое время детекции ГМ-ингредиентов в кукурузе, рисе, сое, хлопчатнике [Xu et al., 2014; Chandu et al., 2016], выявлении возбудителя фитофторы при анализе почти 30 видов растений [Miles et al., 2015], обнаружении Agrobacterium tumefaciens в корончатых галлах табака [Fuller et al., 2017].
Важной особенностью РПА, проистекающей, в том числе, из ее изотермичности, является возможность детекции ДНК или РНК в полевых условиях с помощью простых электрических приборов, или даже пользуясь теплом тела человека, поскольку для РПА не требуется даже предварительного этапа денатурации ДНК [Crannel et al., 2014; Liljander et al., 2015; Mondal et al., 2016]. К тому же TwistAmp® наборы продаются как в жидком, так и в лиофилизированном виде, допускающем хранение не на холоде. Было продемонстрировано, что после хранения набора при 25оС в течение 12 недель или 3 недель при 45оС чувствительность детекции оставалась прежней и позволяла выявлять 10 копий вируса иммунодефицита человека [Lillis et al., 2016]. Итак, что же за система ферментов обеспечивает такие необычные условия амплификации специфичных фрагментов ДНК или РНК?
Надо сказать, что используемый ферментный комплекс в РПА до некоторой степени имитирует происходящие в клетках природные процессы. Основными компонентами этой реакции являются: фермент рекомбиназа (T4 uvsX); белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSB или T4 gp32); ДНК полимераза с вытесняющей цепь ДНК-активностью (например, Bsu из Bacillus subtilis) [Piepenburg et al., 2006]. Для достижения лучших результатов в реакционной смеси присутствует вспомогательный белок T4 uvsY и ряд других компонентов, помимо обязательных дНТФ, праймеров и матричной ДНК. Процесс начинается с формирования филаментов из рекомбиназы и праймеров, которые для этого должны иметь длину 30-35 нуклеотидов , после чего данный комплекс «сканирует» двуцепочечную ДНК, ища гомологичные участки, и в таких местах происходит образование D-петель, а вытесненную цепь ДНК, чтобы она не конкурировала со спарившимся праймером, связывает SSB-белок. Поскольку места расположения праймеров, как и в ПЦР, подбирают на противоположных цепях, недалеко друг от друга и с таким расчетом, чтобы вновь синтезируемые цепи ДНК их перекрывали, то после элонгации праймеров и построения новых цепей ДНК с помощью фермента со смещающей цепь ДНК-активностью, вновь образуются двуцепочечные структуры, и новые порции праймеров в комплексе с рекомбиназой, гомологичные соответствующим участкам таких ампликонов, вытесняют одну из цепей, тем самым обеспечивая цикличность процесса. Это несколько упрощенное описание происходящего в ходе РПА, тем не менее, оно дает общее представление об этапах данной реакции и для цели рассмотрения процесса SHERLOCK его вполне достаточно. Желающие ознакомиться с РПА более подробно могут обратиться для этого к соответствующим обзорным статьям [James, Macdonald, 2015; Daher et al., 2016] и к литературе, представленной на сайте фирмы-производителя.
И именно РПА была выбрана в качестве предварительного этапа новой реакции детекции специфичных фрагментов ДНК SHERLOCK, хотя на пригодность для этой же цели испытывалась и такая реакция как NASBA  [Compton, 1991], но она не удовлетворила авторов метода SHERLOCK [Gootenberg et al., 2017], поскольку не позволила повысить чувствительность детекции. И это не удивительно и легко объяснимо, так как накапливающимися (и периодически исчезающими) ампликонами в NASBA являются молекулы РНК, а после РПА таковые надо еще генерировать, дополнительно увеличивая количество детектируемых молекул. Но, чтобы задействовать нуклеазу Cas13a, нацеленную на разрушение молекул РНК, эти самые молекулы в реакционной смеси после завершения РПА должны откуда то взяться. Для этого к одному из используемых в РПА праймеров достаточно на 5’ конец добавить последовательность промотора бактериофага Т7, в ходе амплификации становящуюся двуцепочечной и способной управлять работой Т7 РНК полимеразы, которую надо также дополнительно добавлять в реакционную смесь вместе с рибонуклеотидтрифосфатами, что в итоге приводит к наработке значительного количества молекул РНК, комплементарных части ДНК-ампликона (без Т7 промотора), обеспечивая детекцию даже единичных исходных копий (имеется в виду до РПА) [Gootenberg et al., 2017]. Причем авторы совершенно справедливо замечают, что первой стадией SHERLOCK может быть практически любая реакция амплификации, в которой возможно использование одного из праймеров, содержащих промотор фага Т7 или аналогичный ему. Но с учетом многих факторов их выбор все же пал на РПА. Таким образом CRISPR-Dx диагностика на платформе SHERLOCK по сути является комбинацией метода амплификации РПА с последующей транскрипцией ампликонов с помощью Т7 РНК полимеразы и разрушением репортерных молекул РНК Cas13a нуклеазой, которая активируется ампликонами РПА, содержащими участок крРНК данного фермента. Образно говоря, нуклеаза Cas13a после активации фермента специфичной РНК «входит в раж» и расщепляет уже неспецифически все присутствующие в реакционной смеси молекулы РНК, а так как специально добавленные репортерные молекулы РНК несут флуорохром и гаситель, то после физического разобщения последних вследствие разрушения всех подряд молекул РНК флуоресцентный краситель начинает светиться, что и детектируется с помощью соответствующих устройств.
Детальное изучение особенностей функционирования CRISPR/Cas13a систем, выполненные почти одновременно учеными с восточного и западного побережий США  [Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016], являющимися признанными лидерами в CRISPR/Cas технологиях, показали, что нуклеаза Cas13a имеет две РНКазные активности, как катализирующую созревание крРНК, так и отвечающую за программируемую смерть инфицированной бактериофагом клетки, вызванную деградацией остальной РНК. В другой своей статье, полученной редакцией 21 февраля 2017 и опубликованной в мае 2017 г., J.A.Doudna с соавторами [East-Seletsky et al., 2017] только отметили возможное использование нуклеазы Cas13a для целей диагностики, тогда как 6 февраля 2017 г. редакцией другого журнала была получена рукопись статьи, вышедшей в апреле 2017 г., где как раз была предложена система SHERLOCK [Gootenberg et al., 2017]. «Запад» же недавно «ответил» публикацией, в которой описывается кристаллическая структура Cas13a нуклеазы из Lachnospiraceae bacterium в комплексе с крРНК, объясняющей почему работа каталитического домена этой нуклеазы блокируется до тех пор пока фермент не свяжется с целевой мишенью [Knott et al., 2017]. Проявление неспецифической рибонуклеазной активности нуклеазы Cas13a происходит только после ее активации специфической крРНК, что показано в предыдущей работе этих авторов [East-Seletsky et al., 2016].
В качестве Cas13a нуклеазы в системе детекции SHERLOCK был использован фермент бактерии Leptotrichia wadei вместо ранее лучше изученного из L.shahii ввиду более мощной РНКазной активности первого. С помощью цифровой монокапельной ПЦР в качестве контроля было показано, что на платформе SHERLOCK можно детектировать единичные мишени. Было отмечено, что лиофилизированная Т7 РНК полимераза сохраняет свою активность, лишь незначительно ее теряя при хранении при комнатной температуре, что является дополнительным аргументом в пользу выбора РПА как реакции, обеспечивающей предварительную наработку целевых ампликонов, поскольку такая Т7 РНК полимераза оказывается удобным дополнительным компонентом лиофилизированных наборов для РПА. Чтобы убедиться в эффективности и чувствительности новой диагностической системы CRISPR-Dx на платформе SHERLOCK в цитируемой работе [Gootenberg et al., 2017] были проведены различные эксперименты по успешной детекции вирусов Зика и Денге (в том числе в «походном» варианте в виде тест полосок), по распознаванию однонуклеотидных замен в человеческой ДНК, а также искусственно формируя мишени с неспаривающимися нуклеотидами в крРНК, что подтвердило высокую специфичность данной реакции.

Заключение
Данная статья завершает посвященную CRISPR/Cas системам серию публикаций, составивших отдельный тематический номер журнала Биомика. Безусловно, не все аспекты применения CRISPR-локусов оказались в них рассмотренными, в том числе и в этой статье. Тем не менее, мы сконцентрировали здесь внимание на трех совершенно разных направлениях использования CRISPR/Cas систем. Исторически первой является уже много лет применяющаяся технология генотипирования штаммов разных бактерий, преимущественно патогенных, называемая сполиготипированием, где микроорганизмы идентифицируются на основе присутствия у них определенных «следов» в виде CRISPR-кассет, оставленных атаками бактериофагов, являющаяся пока «золотым стандартом» для обнаружения и идентификации такого опасного патогена как туберкулезная палочка. Очень перспективным представляется использование каталитически неактивных Cas белков для фундаментальных исследований функционирования генов и геномов, позволяя in vivo оказывать определенные воздействия на гены в виде их активации, репрессии, изменения эпигенетического статуса, визуализации конкретных генов или прочих участков ДНК также in vivo, что еще не так давно было просто технологически не доступно. Не было обойдено вниманием и совсем новое направление использования CRISPR/Cas систем для целей ДНК/РНК диагностики в виде технологии CRISPR-Dx на платформе SHERLOCK, которой еще только предстоит «доказывать» свое право на широкое применение.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз