Онтогенетические и трансгенерационные эффекты избытка доноров метильных групп в лабораторных линиях комнатной мухи
Авторы:
Название:
Онтогенетические и трансгенерационные эффекты избытка доноров метильных групп в лабораторных линиях комнатной мухи
Страницы:
141-147
Исследования эпигенетических механизмов трансгенерационных эффектов, проявляющихся при изменении диеты, удобно вести на модельных объектах, таких как комнатная муха с ее быстрым и синхронным развитием и сравнительно короткой продолжительностью жизни. Избыток в пище метионина, его производного – S-аденозил-метионина и участвующей в регенерации метионина фолиевой кислоты может вызвать целый ряд эффектов, в том числе и обусловленных усилением процессов метилирования различных макромолекул. Установленные в ходе наших экспериментов факты замедления развития на преимагинальной стадии, повышения плодовитости имаго и их продолжительности жизни позволяют предполагать возможность использования части избытка источников метильных групп в цикле метилирования фарнезоевой кислоты в процессе синтеза ювенильного гормона. Работа поддержана грантом РФФИ (№ 15-04-04801-a).
Введение
Качественные и количественные характеристики пищи оказывают определяющее влияние на приспособленность отдельных организмов, конкретных популяций и даже эволюционную судьбу соответствующих видов. Избыточное содержание в пище некоторых ее компонентов, так же как их недостаток, может оказать неблагоприятное воздействие и на сам организм, и на его потомство. В обоих случаях конечный результат является следствием регуляции генной активности, обусловленной присутствием или отсутствием определенных питательных веществ. К сожалению, исследования по влиянию избыточного содержания отдельных аминокислот, в частности метионина, в пище на жизнеспособность и плодовитость у насекомых, а также молекулярные механизмы регуляции по поддержанию его баланса в клетке, проведены на ограниченном числе объектов и носят противоречивый характер (Dadd, 1973; Lee et al., 2014; Obata, Miura, 2015). Его особая роль связана с тем, что метионин является первой аминокислотой для всех белков, и в то же время он способен отдавать метильную группу молекулам низко- и высокомолекулярных соединений. Если эффекты, вызванные недостатком в пище метионина и фолиевой кислоты, участвующей в его регенерации, изучены достаточно подробно, то результаты экспериментов с добавлением в пищу их избыточных количеств публикуются редко (Волкова и др., 2013; Zajitschek et al., 2013).
Уровень в организме SAM (S-аденозил-метионина), одного из метаболитов метионинового цикла, зависит от характеристик как метионинового, так и фолатного циклов (Птицина, 2010). Метаболическое «напряжение», вследствие поступления с пищей избытка доноров метильных групп, может реализоваться в направлении синтеза дополнительных количеств ювенильного гормона (ЮГ), одной из стадий синтеза которых является реакция трансметилирования фарнезоевой кислоты (Defelipe et al., 2011). С другой стороны, избыток адеметионина может стимулировать повышенную активность гистоновых и ДНК метилтрансфераз, регулирующих генную активность и эпигенетическое наследование (Caudill et al., 2001).
Одним из способов передачи эпигенетической информации, проявляющейся в форме трансгенерационных эффектов, является метилирование ДНК. Для комнатной мухи Musca domestica L., относящейся к тому же отряду Diptera, что и D. melanogaster, процессы метилирования, возможно, имеют большее значение, чем для плодовой мушки, в связи с использованием в природе пищевых субстратов, обогащенных незаменимыми аминокислотами и витаминами. Наши эксперименты преследовали цель выявить эффекты от присутствия в пище дополнительных источников метильных групп на прохождение отдельных стадий онтогенеза, продолжительность жизни и плодовитость имаго, также и возможное влияние на онтогенез потомства в лабораторных линиях комнатной мухи, различающихся по продолжительности жизни и срокам массового размножения
Материалы и методы
В качестве объекта исследований использовались личинки в возрасте 7 суток (III возраст) из лабораторных линий Sh gen с сокращенной продолжительностью жизни и L gen с увеличенной продолжительностью жизни имаго (Никоноров, Беньковская, 2013). В качестве дополнительных источников метильных групп в пище мы использовали метионин (М), S-аденозилметионин (адеметионин, SAM) в составе фармакологического препарата Гептрал©, и фолиевую кислоту (Ф) как кофактор трансформации метионина, в концентрациях, соответствующих физиологическим дозам для животных (12 мкг/мл молока для М и SAM, 1,2 мкг/мл для Ф) и в 10-кратных дозах (соответственно, 120 мкг/мл и 12 мкг/мл). Молочную смесь с добавками (1 мл) наносили на ватные диски диаметром 6 см в чашках Петри, затем рассаживали личинок комнатной мухи в 3х-кратной повторности по 15 особей в каждом варианте. В контрольном варианте использована молочная смесь без добавок.
Наблюдения проводились в течение всего онтогенеза и всего периода имагинальной жизни. Обработку статистических данных проводили с использованием программ Excell 2003 и SPSS Statistics Ver. 17. Достоверность различия средних значений оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Природа использованных нами в эксперименте соединений позволяет предполагать, что основная роль в утилизации их избытка ложится на действующие элементы метионинового и фолатного циклов.
В наших экспериментах используемое количество добавляемых в пищу соединений не повлияло негативно на выживаемость личинок. До стадии окукливания дожило 100% личинок во всех вариантах. Две очень важные стадии онтогенеза, личиночно-куколочная и куколочно-имагинальная трансформации, проходящие при резком изменении баланса ЮГ и экдизона, включают в себя периоды почти полной перестройки соматических тканей и органов и завершаются полной заменой на, соответственно, куколочные и имагинальные структуры. Реакции на избыток М, Ф и SAM при прохождении этих стадий у наших линий отличались. Во всех вариантах с донорами метильных групп количество образовавшихся пупариев в линии Sh gen уже через 3 суток превышало значения для контроля не менее чем двукратно, а при высоких дозах в 4-8 раз (табл. 1). В линии Lgen в те же сроки было заметно отставание в варианте с 10-кратной дозой SAM, а повышение скорости трансформации отмечено только для вариантов с М и Ф. Однако к 7 суткам от начала эксперимента именно для этой линии количество образовавшихся пупариев превышало контрольные значения в 1.5-2 раза. В обеих линиях к 7 суткам от начала эксперимента было количество пупариев существенно выше, чем в контроле – на 5-28% в линии Sh gen и на 43-100% в линии L gen.
Таблица 1.
Влияние дополнительных источников метильных групп на скорость личиночно-куколочной трансформации в линиях комнатной мухи (отношение количества образовавшихся пупариев в опытных группах к контролю, %)
Соединение, мкг/мл Sh gen L gen
3 суток 7 суток 3 суток 7 суток
Метионин, 12 203.03 ±49.31* 127.29 ± 12.03* 209.37 ± 47.76* 142.92 ±39.93*
Метионин, 120 403.03 ± 66.17* 118.28 ±7.69* 103.13 ±63.64 171.67 ±14.25*
Фолиевая к-та, 1.2 403.02 ± 24.81* 122.78 ± 6.67* 209.4 ±46.27* 157.51 ± 50.41*
Фолиевая к-та, 12 809.09 ± 12.36* 104.64 ± 4.30 209.3 ± 26.87* 200.43 ± 31.05*
М + Ф, 12 + 0.12 203.00± 47.76* 122.78 ± 5.22* 103.12 ± 66.67 185.84 ± 7.62*
М + Ф, 120 +1.2 303.02 ±58.00* 118.3 ± 4.49* 312.5 ± 2.11* 157.5 ± 18.26*
SAM, 12 606.06 ±5.8* 104.64 ± 3.9 103.1 ± 57.58 142.91 ± 27.12*
SAM, 120 506.06 ±60.48* 113.64 ± 3.72* 0 ± 0* 157.51 ± 6.51*
Примечание: * -достоверно отличие от контроля, р≤0.05
Таблица 2.
Влияние дополнительных (экзогенных) источников метильных групп в пище на продолжительность куколочной стадии развития в линиях комнатной мухи (сутки, среднее значение с ошибкой)
Линии Контроль М 10 М Ф 10 Ф М+Ф 10 М+Ф SAM 10 SAM
Sh gen 5.78 ±0.40 6.9*
±0.39 6.25
±0.35 6.5
±0.36 6.11
±0.35 7.0*
±0.29 6.12
±0.27 6.20
±0.44 6.33
±0.33
L gen 8.33
±0.51 9.0
±0.53 9.5*
±0.43 8.33
±0.51 8.75
±0.57 8.25
±0.56 9.0
±0.33 8.5
±0.24 7.5
±0.43
Общей продолжительности преимагинальной стадии в некоторых вариантах была свойственна тенденция к увеличению, причем наиболее достоверные изменения показаны для продолжительности стадии пупария (табл. 2). Метионин замедлял развитие на этой стадии в обеих линиях. Для особей из линии Sh gen наибольший эффект проявился в варианте М+Ф, а для линии L gen максимальные отличия (р≤0.05) от контроля - более чем на 1 сутки - были получены в варианте с 10-кратной дозой метионина.
Изменение массы пупариев в опытных вариантах имело более выраженный характер в линии Sh gen. В единственном варианте М+Ф средняя масса 1 пупария была достоверно ниже (на 18.7%, р≤0.05), чем в контроле, тогда как во всех остальных вариантах снижения не отмечено. Более того, М, Ф и обе дозировки SAM вызвали достоверное (р≤0.01) повышение массы пупариев на 29-47% по сравнению с контролем. В сочетании с эффектами некоторого замедления развития эти результаты, как мы полагаем, свидетельствуют о смещении баланса между ЮГ и экдизоном в пользу первого, чему может способствовать вовлечение дополнительных источников метильных групп в процесс трансметилирования фарнезоевой кислоты (Defelipe et al., 2011).
Остановка развития в стадии пупария, как показал анализ, может происходить на нескольких этапах: это период лизиса личиночных тканей (до 1 суток), этап формирования куколки (2-3 сутки) и этап завершения формирования имагинальных структур (4-6 сутки). Кроме того, воздействия, затрагивающие нейроэндокринную систему у Diptera, могут приводить к целому ряду морфогенетических нарушений, и в результате – к гибели имаго в момент выхода из пупария. Аналогичные эффекты для других представителей отряда наблюдались при действии экзогенного ЮГ или его синтетических аналогов (Singh, Kumar, 2015). В наших экспериментах мы наблюдали заметное смещение момента наибольшей смертности под влиянием всех соединений, однако направленность этих сдвигов в линиях отличалась (рис. 1).
Рисунок 1. Влияние экзогенных источников метильных групп в пище личинок комнатной мухи
на структуру смертности в стадии пупария. По оси ординат показана доля смертности на каждом
этапе развития пупария относительно общего числа неразвившихся пупариев
Таблица 3.
Влияние доноров метильных групп на успех куколочно-имагинальной трансформации
в линиях комнатной мухи
Соединение, мкг/мл Количество вышедших имаго, % от числа пупариев
Sh gen L gen
контроль 73.3 ± 20.82 55.57 ± 9.64
Метионин, 12 89.27 ± 11.12 72.23 ± 25.46
Метионин, 120 68.9 ± 10.17 78.33 ± 20.21
Фолиевая к-та, 1.2 81.86 ± 7.04 81.65 ±2.33*
Фолиевая к-та, 12 67.5 ± 20.46 86.67 ± 11.55*
М + Ф, 12 + 0.12 73.3 ± 15.27 76.67 ± 2.89*
М + Ф, 120 +1.2 70.0 ± 17.32 88.9 ± 19.23*
SAM, 12 60.77 ± 5.59 91.67 ± 14.43*
SAM, 120 73.3 ± 12.83 61.13 ± 9.64
* -достоверно отличие от контроля, р≤0.05.
Тем не менее, тенденцию к снижению числа вышедших имаго мы отметили только в нескольких вариантах для линии Sh gen, тогда как для линии L gen необходимо отметить проявление положительного эффекта на успешность прохождения последующей стадии – куколочно-имагинальной трансформации (Табл. 3).
Неоднозначные и противоречивые данные были получены при анализе плодовитости и продолжительности жизни имаго в экспериментальных линиях. Влияние исследуемых соединений ощущается и на этой стадии, хотя значительная часть их избытка, полученного личинками с пищей, уже должна была быть утилизирована в процессе метаболизма в предшествующий период жизни (Табл. 4 и 5).
Таблица 4.
Влияние доноров метильных групп на плодовитость имаго в линиях комнатной мухи
Соединение, мкг/мл Репродуктивный период, сутки Плодовитость, яиц/самку/сутки
Sh gen L gen Sh gen L gen
контроль 14 14 15.29± 3.5 25.0±5.2
Метионин, 12 17 18 33.14 ±3.1** 48.75 ± 4.6**
Метионин, 120 16 – 12.86 ± 2.2 0*
Фолиевая к-та, 1.2 22 12 19.64 ± 4.1 5.4 ± 0.44*
Фолиевая к-та, 12 28 18 21.0 ± 3.1** 8.57 ± 1.7*
М + Ф, 12 + 0.12 20 – 18.0 ± 2.3 0*
М + Ф, 120 +1.2 7 18 6.0 ± 1.1* 75.83 ± 4.9**
SAM, 12 20 18 11.67 ± 2.5 12.5 ± 3.7*
SAM, 120 20 18 19.0 ± 5.2 41.67 ± 5.4**
*-достоверно снижение относительно контроля (р≤0.01.)
** -достоверно повышение относительно контроля (р≤0.05.)
Практически только в одном из вариантов (М, 12 мкг/мл) была получена идентичная реакция у мух из линий Sh gen и L gen, на стадии личинки получавших с пищей его избыток. В обоих случаях налицо увеличение репродуктивного периода и повышение плодовитости при сохранении нормальной продолжительности жизни. В остальных вариантах проявилась различная реакция у мух из этих линий. Наиболее показательным в этом отношении является вариант с одновременным присутствием в пище избытка М и Ф в 10-кратной дозе. Если мухи из линии Sh gen имели в этом варианте самый короткий репродуктивный период, низкий показатель продуктивности и резкое сокращение продолжительности жизни, то линия L gen продемонстрировала увеличение периода репродукции, наивысший уровень плодовитости и нормальную продолжительность жизни.
Таблица 5.
Влияние доноров метильных групп на продолжительность жизни имаго в линиях
комнатной мухи
Соединение, мкг/мл продолжительность жизни имаго, сут
Sh gen L gen
контроль 17.00 ± 1.00 29.67 ± 1.53
Метионин, 12 19.00 ± 1.00 30.00 ± 1.58
Метионин, 120 22.00 ± 1.00* 10.5 ± 1.29*
Фолиевая к-та, 1.2 28.00 ± 1.00* 19.67 ±1.53*
Фолиевая к-та, 12 33.5 ± 1.29* 48.00 ± 1.00*
М + Ф, 12 + 0.12 26.00 ± 1.00* 8.00 ± 1.41*
М + Ф, 120 +1.2 13.00 ± 1.00* 32.00 ± 1.00
SAM, 12 25.00 ± 1.00* 31.33 ± 1.53
SAM, 120 26.00± 1.00* 32.00 ± 1.00
* -достоверно отличие от контроля (р≤0.05.)
В целом, как устойчивость репродуктивной системы, так и общая жизнеспособность имаго из линии L gen оказались более чувствительными к качеству пищи, полученной на более ранней стадии онтогенеза. Для линии Sh gen использованные в эксперименте дополнительные компоненты в пище обеспечили в данном поколении, в основном, положительный эффект увеличения репродуктивного периода, плодовитости и продолжительности жизни. Эффект от использованных соединений оказался на более поздних стадиях онтогенеза даже более выраженным, чем непосредственно сразу после обработки.
А вот судьба поколения F1 в тех вариантах, где были отложены яйца, подтверждает наличие отсроченного эффекта от добавления в пищу дополнительных количеств доноров метильных групп (табл.6).
Таблица 6.
Проявление эффектов избытка доноров метильных групп в онтогенезе потомства комнатной мухи
Соединение, мкг/мл % вышедших имаго F1 Продолжительность жизни имаго F1, сутки
Sh gen L gen Sh gen L gen
контроль 56.3 ± 10.43 48.8 ± 12.43 13 28
Метионин, 12 50.0 ± 4.6 71.4 ± 7.7 11 6*
Метионин, 120 63.9 ± 3.3 - 15 -
Фолиевая к-та, 1.2 95.1 ± 5.1* - 24* -
Фолиевая к-та, 12 0 0 - -
М + Ф, 12 + 0.12 70.63 ±6.3 - 23* -
М + Ф, 120 +1.2 91.3 ± 4.9* 94.0 ± 5.5* 18* 21
SAM, 12 70.9 ± 6.5 33.3 ± 6.5 19* 2*
SAM, 120 66.2 ± 7.8 57.33 ± 10.1 24* 14*
* -достоверно отличие от контроля
** -достоверно отличие от контроля (больше)
В варианте с высокой дозой Ф (12 мг/мл) в поколении F1 доживших до стадии имаго не было в обеих линиях, хотя в родительском поколении фолиевая кислота в данной концентрации способствовала повышению продолжительности жизни у имаго из линий и L gen и Sh gen. Во всех вариантах с добавками в поколении F1 линии L gen наблюдалось резкое снижение продолжительности жизни имаго. У имаго линии Sh gen, напротив, добавки (за исключением М) увеличили продолжительность жизни следующего поколения. Во многом противоположные результаты для линий Sh gen и L gen могут быть вызваны генетически определенными особенностями механизма регуляции баланса между ЮГ и экдистероидами. В пользу этого предположения указывают установленные в ходе наших экспериментов факты влияния на продолжительность развития на преимагинальной стадии и плодовитость имаго, поскольку наряду с основной функцией по регуляции онтогенетического развития, ЮГ и 20-Э играют у имаго насекомых гонадотропную роль. Для насекомых с полным превращением характерным является наличие многократных линек на стадии личинки и метаморфоза, сопровождающегося превращением личинки в куколку (пупарий), а затем и куколки в имаго. Регуляция процессов линьки и трансформации осуществляется, главным образом, под контролем гормона экдизона (20-ГЭ), биологическое действие которого в значительной мере зависит от баланса с ювенильными гормонами (Раушенбах, 1990). Экдизон, стероидный гормон, в форме α-экдизона и/или 20-гидроксиэкдизона (β-экдизона), стимулирует у насекомых линьку и метаморфоз. Ювенильный гормон определяет характер протекания линьки, инициированный у личинок насекомого экдизоном, и препятствует метаморфозу. При высоком титре ЮГ возможна только личиночная линька, а вот при резком его падении происходит метаморфоз, и при полном его отсутствии – имагинальная линька. Характерный эффект нарушения баланса между ЮГ и 20-Э в пользу первого проявляется на стадии личинки в виде увеличения временных интервалов между линьками, увеличения веса и размеров личинок, и появления дополнительных линек у насекомых с недетерминированным их числом (Грунтенко, 2008).
Упрощенно схема их взаимодействия выглядит следующим образом: 1) ЮГ стимулирует синтез желточных белков (ЖБ) и экдистероидов в яичниках; 2) экдистероиды, продуцируемые в основном фолликулярными клетками яичника, стимулируют синтез ЖБ в жировом теле; 3) оба гормона регулируют поглощение ЖБ развивающимися ооцитами (Simonet et al., 2004). Часть полученных с пищей SAM и М в организме личинок может быстро включиться в путь биосинтеза фарнезоевой кислоты и ювенильного гормона, а Ф стимулировать в какой-то мере этот процесс, что вызовет нарушение гормонального баланса и проявится в виде эффектов, зафиксированных и в нашем эксперименте.
Аномальная активность метионинового цикла, вследствие поступления избыточных количеств М, Ф и SAM с пищей, может иметь своим следствием и повышенную активность гистоновых и ДНК-метилтрансфераз, предопределяя возможность различных трансгенерационных эффектов в последующих поколениях. У насекомых существует несколько таксономических групп (в том числе и отряд Diptera), у которых системы метилирования ДНК сильно редуцированы, и их проявление ограничивается эмбриональной стадией или же связано с регуляцией активности отдельных фракций генома (Glactad et al., 2011). Мы провели определение уровня метилирования ДНК соматических клеток комнатной мухи в кодирующих областях некоторых генов методом количественной ПЦР. Нам удалось установить, что присутствие в пище избытка доноров метильных групп практически не отражается на уровне метилирования рДНК в соматических тканях имаго мух в родительском и последующем поколениях. По всей видимости, это определяется отсутствием в геноме комнатной мухи (по аналогии с дрозофилой) генов DNMT1 и 3, отвечающих за «поддерживающее» и de novo метилирование ДНК в CG-мотивах (Никоноров и др., 2016).
Заключение
Итак, мы предполагаем, что некоторая часть избыточных количеств доноров метильных групп в пище, предоставленной личинкам комнатной мухи, по всей вероятности, была использована в цикле синтеза ювенильного гормона. Это повлекло за собой нарушение гормонального баланса, что сказалось на нормальном прохождении последующих стадий онтогенеза в родительском поколении и проявлении отсроченных эффектов (в основном, отрицательно сказывающихся на плодовитости и продолжительности жизни) в следующем поколении. Результаты экспериментов с донорами метильных групп позволяют нам предположить, что в основе всех фенотипических различий между линиями лежит разница в балансе гормонов – ЮГ и 20Е. Полученные ранее данные показали, что для долгоживущих особей характерна низкая представленность копий мРНК гена рецептора 20Е – EcR, чему может соответствовать низкий уровень титра эндогенного 20Е (Никоноров и др., 2015). Наши результаты укладываются в следующую схему: баланс ЮГ-20Е в линии Sh gen поддерживается, и его смещение за счет повышенного уровня биосинтеза ЮГ при вовлечении в цикл экзогенного метионина либо других источников метильных групп становится заметным только в случае использования 10-кратных доз метионина, кофактора биосинтеза – фолиевой кислоты и их смеси, а также адеметионина. Именно эти дозы вызывали в наших экспериментах все негативные эффекты, характерные для избытка ЮГ (Грунтенко, 2008) – снижение жизнеспособности в онтогенезе, сокращение репродуктивного периода, снижение плодовитости и продолжительности жизни имаго. Трансгенерационные эффекты, характерные для избытка ЮГ, в этой линии проявлялись как снижение жизнеспособности потомства только при применении 10-кратной дозы фолиевой кислоты; метионин дал снижение продолжительности жизни имаго в первом поколении потомства.
В линии L gen, судя по многим признакам, в т.ч. высокой доле стерильных самцов, неоплодотворенных яиц в кладках смещение гормонального баланса – постоянное явление. Нам представляется, что существует какой-то генетически обусловленный дефект (либо эпигенетический супрессор), приводящий к дефициту 20Е и, соответственно, к снижению уровня экспрессии гена EcR. Титр ЮГ у особей этой линии может быть таким же, как у Sh gen, но сниженный титр 20Е создает дисбаланс гормонов, и этот дисбаланс усиливается даже под действием относительно невысоких доз экзогенных источников метионина.
Качественные и количественные характеристики пищи оказывают определяющее влияние на приспособленность отдельных организмов, конкретных популяций и даже эволюционную судьбу соответствующих видов. Избыточное содержание в пище некоторых ее компонентов, так же как их недостаток, может оказать неблагоприятное воздействие и на сам организм, и на его потомство. В обоих случаях конечный результат является следствием регуляции генной активности, обусловленной присутствием или отсутствием определенных питательных веществ. К сожалению, исследования по влиянию избыточного содержания отдельных аминокислот, в частности метионина, в пище на жизнеспособность и плодовитость у насекомых, а также молекулярные механизмы регуляции по поддержанию его баланса в клетке, проведены на ограниченном числе объектов и носят противоречивый характер (Dadd, 1973; Lee et al., 2014; Obata, Miura, 2015). Его особая роль связана с тем, что метионин является первой аминокислотой для всех белков, и в то же время он способен отдавать метильную группу молекулам низко- и высокомолекулярных соединений. Если эффекты, вызванные недостатком в пище метионина и фолиевой кислоты, участвующей в его регенерации, изучены достаточно подробно, то результаты экспериментов с добавлением в пищу их избыточных количеств публикуются редко (Волкова и др., 2013; Zajitschek et al., 2013).
Уровень в организме SAM (S-аденозил-метионина), одного из метаболитов метионинового цикла, зависит от характеристик как метионинового, так и фолатного циклов (Птицина, 2010). Метаболическое «напряжение», вследствие поступления с пищей избытка доноров метильных групп, может реализоваться в направлении синтеза дополнительных количеств ювенильного гормона (ЮГ), одной из стадий синтеза которых является реакция трансметилирования фарнезоевой кислоты (Defelipe et al., 2011). С другой стороны, избыток адеметионина может стимулировать повышенную активность гистоновых и ДНК метилтрансфераз, регулирующих генную активность и эпигенетическое наследование (Caudill et al., 2001).
Одним из способов передачи эпигенетической информации, проявляющейся в форме трансгенерационных эффектов, является метилирование ДНК. Для комнатной мухи Musca domestica L., относящейся к тому же отряду Diptera, что и D. melanogaster, процессы метилирования, возможно, имеют большее значение, чем для плодовой мушки, в связи с использованием в природе пищевых субстратов, обогащенных незаменимыми аминокислотами и витаминами. Наши эксперименты преследовали цель выявить эффекты от присутствия в пище дополнительных источников метильных групп на прохождение отдельных стадий онтогенеза, продолжительность жизни и плодовитость имаго, также и возможное влияние на онтогенез потомства в лабораторных линиях комнатной мухи, различающихся по продолжительности жизни и срокам массового размножения
Материалы и методы
В качестве объекта исследований использовались личинки в возрасте 7 суток (III возраст) из лабораторных линий Sh gen с сокращенной продолжительностью жизни и L gen с увеличенной продолжительностью жизни имаго (Никоноров, Беньковская, 2013). В качестве дополнительных источников метильных групп в пище мы использовали метионин (М), S-аденозилметионин (адеметионин, SAM) в составе фармакологического препарата Гептрал©, и фолиевую кислоту (Ф) как кофактор трансформации метионина, в концентрациях, соответствующих физиологическим дозам для животных (12 мкг/мл молока для М и SAM, 1,2 мкг/мл для Ф) и в 10-кратных дозах (соответственно, 120 мкг/мл и 12 мкг/мл). Молочную смесь с добавками (1 мл) наносили на ватные диски диаметром 6 см в чашках Петри, затем рассаживали личинок комнатной мухи в 3х-кратной повторности по 15 особей в каждом варианте. В контрольном варианте использована молочная смесь без добавок.
Наблюдения проводились в течение всего онтогенеза и всего периода имагинальной жизни. Обработку статистических данных проводили с использованием программ Excell 2003 и SPSS Statistics Ver. 17. Достоверность различия средних значений оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Природа использованных нами в эксперименте соединений позволяет предполагать, что основная роль в утилизации их избытка ложится на действующие элементы метионинового и фолатного циклов.
В наших экспериментах используемое количество добавляемых в пищу соединений не повлияло негативно на выживаемость личинок. До стадии окукливания дожило 100% личинок во всех вариантах. Две очень важные стадии онтогенеза, личиночно-куколочная и куколочно-имагинальная трансформации, проходящие при резком изменении баланса ЮГ и экдизона, включают в себя периоды почти полной перестройки соматических тканей и органов и завершаются полной заменой на, соответственно, куколочные и имагинальные структуры. Реакции на избыток М, Ф и SAM при прохождении этих стадий у наших линий отличались. Во всех вариантах с донорами метильных групп количество образовавшихся пупариев в линии Sh gen уже через 3 суток превышало значения для контроля не менее чем двукратно, а при высоких дозах в 4-8 раз (табл. 1). В линии Lgen в те же сроки было заметно отставание в варианте с 10-кратной дозой SAM, а повышение скорости трансформации отмечено только для вариантов с М и Ф. Однако к 7 суткам от начала эксперимента именно для этой линии количество образовавшихся пупариев превышало контрольные значения в 1.5-2 раза. В обеих линиях к 7 суткам от начала эксперимента было количество пупариев существенно выше, чем в контроле – на 5-28% в линии Sh gen и на 43-100% в линии L gen.
Таблица 1.
Влияние дополнительных источников метильных групп на скорость личиночно-куколочной трансформации в линиях комнатной мухи (отношение количества образовавшихся пупариев в опытных группах к контролю, %)
Соединение, мкг/мл Sh gen L gen
3 суток 7 суток 3 суток 7 суток
Метионин, 12 203.03 ±49.31* 127.29 ± 12.03* 209.37 ± 47.76* 142.92 ±39.93*
Метионин, 120 403.03 ± 66.17* 118.28 ±7.69* 103.13 ±63.64 171.67 ±14.25*
Фолиевая к-та, 1.2 403.02 ± 24.81* 122.78 ± 6.67* 209.4 ±46.27* 157.51 ± 50.41*
Фолиевая к-та, 12 809.09 ± 12.36* 104.64 ± 4.30 209.3 ± 26.87* 200.43 ± 31.05*
М + Ф, 12 + 0.12 203.00± 47.76* 122.78 ± 5.22* 103.12 ± 66.67 185.84 ± 7.62*
М + Ф, 120 +1.2 303.02 ±58.00* 118.3 ± 4.49* 312.5 ± 2.11* 157.5 ± 18.26*
SAM, 12 606.06 ±5.8* 104.64 ± 3.9 103.1 ± 57.58 142.91 ± 27.12*
SAM, 120 506.06 ±60.48* 113.64 ± 3.72* 0 ± 0* 157.51 ± 6.51*
Примечание: * -достоверно отличие от контроля, р≤0.05
Таблица 2.
Влияние дополнительных (экзогенных) источников метильных групп в пище на продолжительность куколочной стадии развития в линиях комнатной мухи (сутки, среднее значение с ошибкой)
Линии Контроль М 10 М Ф 10 Ф М+Ф 10 М+Ф SAM 10 SAM
Sh gen 5.78 ±0.40 6.9*
±0.39 6.25
±0.35 6.5
±0.36 6.11
±0.35 7.0*
±0.29 6.12
±0.27 6.20
±0.44 6.33
±0.33
L gen 8.33
±0.51 9.0
±0.53 9.5*
±0.43 8.33
±0.51 8.75
±0.57 8.25
±0.56 9.0
±0.33 8.5
±0.24 7.5
±0.43
Общей продолжительности преимагинальной стадии в некоторых вариантах была свойственна тенденция к увеличению, причем наиболее достоверные изменения показаны для продолжительности стадии пупария (табл. 2). Метионин замедлял развитие на этой стадии в обеих линиях. Для особей из линии Sh gen наибольший эффект проявился в варианте М+Ф, а для линии L gen максимальные отличия (р≤0.05) от контроля - более чем на 1 сутки - были получены в варианте с 10-кратной дозой метионина.
Изменение массы пупариев в опытных вариантах имело более выраженный характер в линии Sh gen. В единственном варианте М+Ф средняя масса 1 пупария была достоверно ниже (на 18.7%, р≤0.05), чем в контроле, тогда как во всех остальных вариантах снижения не отмечено. Более того, М, Ф и обе дозировки SAM вызвали достоверное (р≤0.01) повышение массы пупариев на 29-47% по сравнению с контролем. В сочетании с эффектами некоторого замедления развития эти результаты, как мы полагаем, свидетельствуют о смещении баланса между ЮГ и экдизоном в пользу первого, чему может способствовать вовлечение дополнительных источников метильных групп в процесс трансметилирования фарнезоевой кислоты (Defelipe et al., 2011).
Остановка развития в стадии пупария, как показал анализ, может происходить на нескольких этапах: это период лизиса личиночных тканей (до 1 суток), этап формирования куколки (2-3 сутки) и этап завершения формирования имагинальных структур (4-6 сутки). Кроме того, воздействия, затрагивающие нейроэндокринную систему у Diptera, могут приводить к целому ряду морфогенетических нарушений, и в результате – к гибели имаго в момент выхода из пупария. Аналогичные эффекты для других представителей отряда наблюдались при действии экзогенного ЮГ или его синтетических аналогов (Singh, Kumar, 2015). В наших экспериментах мы наблюдали заметное смещение момента наибольшей смертности под влиянием всех соединений, однако направленность этих сдвигов в линиях отличалась (рис. 1).
Рисунок 1. Влияние экзогенных источников метильных групп в пище личинок комнатной мухи
на структуру смертности в стадии пупария. По оси ординат показана доля смертности на каждом
этапе развития пупария относительно общего числа неразвившихся пупариев
Таблица 3.
Влияние доноров метильных групп на успех куколочно-имагинальной трансформации
в линиях комнатной мухи
Соединение, мкг/мл Количество вышедших имаго, % от числа пупариев
Sh gen L gen
контроль 73.3 ± 20.82 55.57 ± 9.64
Метионин, 12 89.27 ± 11.12 72.23 ± 25.46
Метионин, 120 68.9 ± 10.17 78.33 ± 20.21
Фолиевая к-та, 1.2 81.86 ± 7.04 81.65 ±2.33*
Фолиевая к-та, 12 67.5 ± 20.46 86.67 ± 11.55*
М + Ф, 12 + 0.12 73.3 ± 15.27 76.67 ± 2.89*
М + Ф, 120 +1.2 70.0 ± 17.32 88.9 ± 19.23*
SAM, 12 60.77 ± 5.59 91.67 ± 14.43*
SAM, 120 73.3 ± 12.83 61.13 ± 9.64
* -достоверно отличие от контроля, р≤0.05.
Тем не менее, тенденцию к снижению числа вышедших имаго мы отметили только в нескольких вариантах для линии Sh gen, тогда как для линии L gen необходимо отметить проявление положительного эффекта на успешность прохождения последующей стадии – куколочно-имагинальной трансформации (Табл. 3).
Неоднозначные и противоречивые данные были получены при анализе плодовитости и продолжительности жизни имаго в экспериментальных линиях. Влияние исследуемых соединений ощущается и на этой стадии, хотя значительная часть их избытка, полученного личинками с пищей, уже должна была быть утилизирована в процессе метаболизма в предшествующий период жизни (Табл. 4 и 5).
Таблица 4.
Влияние доноров метильных групп на плодовитость имаго в линиях комнатной мухи
Соединение, мкг/мл Репродуктивный период, сутки Плодовитость, яиц/самку/сутки
Sh gen L gen Sh gen L gen
контроль 14 14 15.29± 3.5 25.0±5.2
Метионин, 12 17 18 33.14 ±3.1** 48.75 ± 4.6**
Метионин, 120 16 – 12.86 ± 2.2 0*
Фолиевая к-та, 1.2 22 12 19.64 ± 4.1 5.4 ± 0.44*
Фолиевая к-та, 12 28 18 21.0 ± 3.1** 8.57 ± 1.7*
М + Ф, 12 + 0.12 20 – 18.0 ± 2.3 0*
М + Ф, 120 +1.2 7 18 6.0 ± 1.1* 75.83 ± 4.9**
SAM, 12 20 18 11.67 ± 2.5 12.5 ± 3.7*
SAM, 120 20 18 19.0 ± 5.2 41.67 ± 5.4**
*-достоверно снижение относительно контроля (р≤0.01.)
** -достоверно повышение относительно контроля (р≤0.05.)
Практически только в одном из вариантов (М, 12 мкг/мл) была получена идентичная реакция у мух из линий Sh gen и L gen, на стадии личинки получавших с пищей его избыток. В обоих случаях налицо увеличение репродуктивного периода и повышение плодовитости при сохранении нормальной продолжительности жизни. В остальных вариантах проявилась различная реакция у мух из этих линий. Наиболее показательным в этом отношении является вариант с одновременным присутствием в пище избытка М и Ф в 10-кратной дозе. Если мухи из линии Sh gen имели в этом варианте самый короткий репродуктивный период, низкий показатель продуктивности и резкое сокращение продолжительности жизни, то линия L gen продемонстрировала увеличение периода репродукции, наивысший уровень плодовитости и нормальную продолжительность жизни.
Таблица 5.
Влияние доноров метильных групп на продолжительность жизни имаго в линиях
комнатной мухи
Соединение, мкг/мл продолжительность жизни имаго, сут
Sh gen L gen
контроль 17.00 ± 1.00 29.67 ± 1.53
Метионин, 12 19.00 ± 1.00 30.00 ± 1.58
Метионин, 120 22.00 ± 1.00* 10.5 ± 1.29*
Фолиевая к-та, 1.2 28.00 ± 1.00* 19.67 ±1.53*
Фолиевая к-та, 12 33.5 ± 1.29* 48.00 ± 1.00*
М + Ф, 12 + 0.12 26.00 ± 1.00* 8.00 ± 1.41*
М + Ф, 120 +1.2 13.00 ± 1.00* 32.00 ± 1.00
SAM, 12 25.00 ± 1.00* 31.33 ± 1.53
SAM, 120 26.00± 1.00* 32.00 ± 1.00
* -достоверно отличие от контроля (р≤0.05.)
В целом, как устойчивость репродуктивной системы, так и общая жизнеспособность имаго из линии L gen оказались более чувствительными к качеству пищи, полученной на более ранней стадии онтогенеза. Для линии Sh gen использованные в эксперименте дополнительные компоненты в пище обеспечили в данном поколении, в основном, положительный эффект увеличения репродуктивного периода, плодовитости и продолжительности жизни. Эффект от использованных соединений оказался на более поздних стадиях онтогенеза даже более выраженным, чем непосредственно сразу после обработки.
А вот судьба поколения F1 в тех вариантах, где были отложены яйца, подтверждает наличие отсроченного эффекта от добавления в пищу дополнительных количеств доноров метильных групп (табл.6).
Таблица 6.
Проявление эффектов избытка доноров метильных групп в онтогенезе потомства комнатной мухи
Соединение, мкг/мл % вышедших имаго F1 Продолжительность жизни имаго F1, сутки
Sh gen L gen Sh gen L gen
контроль 56.3 ± 10.43 48.8 ± 12.43 13 28
Метионин, 12 50.0 ± 4.6 71.4 ± 7.7 11 6*
Метионин, 120 63.9 ± 3.3 - 15 -
Фолиевая к-та, 1.2 95.1 ± 5.1* - 24* -
Фолиевая к-та, 12 0 0 - -
М + Ф, 12 + 0.12 70.63 ±6.3 - 23* -
М + Ф, 120 +1.2 91.3 ± 4.9* 94.0 ± 5.5* 18* 21
SAM, 12 70.9 ± 6.5 33.3 ± 6.5 19* 2*
SAM, 120 66.2 ± 7.8 57.33 ± 10.1 24* 14*
* -достоверно отличие от контроля
** -достоверно отличие от контроля (больше)
В варианте с высокой дозой Ф (12 мг/мл) в поколении F1 доживших до стадии имаго не было в обеих линиях, хотя в родительском поколении фолиевая кислота в данной концентрации способствовала повышению продолжительности жизни у имаго из линий и L gen и Sh gen. Во всех вариантах с добавками в поколении F1 линии L gen наблюдалось резкое снижение продолжительности жизни имаго. У имаго линии Sh gen, напротив, добавки (за исключением М) увеличили продолжительность жизни следующего поколения. Во многом противоположные результаты для линий Sh gen и L gen могут быть вызваны генетически определенными особенностями механизма регуляции баланса между ЮГ и экдистероидами. В пользу этого предположения указывают установленные в ходе наших экспериментов факты влияния на продолжительность развития на преимагинальной стадии и плодовитость имаго, поскольку наряду с основной функцией по регуляции онтогенетического развития, ЮГ и 20-Э играют у имаго насекомых гонадотропную роль. Для насекомых с полным превращением характерным является наличие многократных линек на стадии личинки и метаморфоза, сопровождающегося превращением личинки в куколку (пупарий), а затем и куколки в имаго. Регуляция процессов линьки и трансформации осуществляется, главным образом, под контролем гормона экдизона (20-ГЭ), биологическое действие которого в значительной мере зависит от баланса с ювенильными гормонами (Раушенбах, 1990). Экдизон, стероидный гормон, в форме α-экдизона и/или 20-гидроксиэкдизона (β-экдизона), стимулирует у насекомых линьку и метаморфоз. Ювенильный гормон определяет характер протекания линьки, инициированный у личинок насекомого экдизоном, и препятствует метаморфозу. При высоком титре ЮГ возможна только личиночная линька, а вот при резком его падении происходит метаморфоз, и при полном его отсутствии – имагинальная линька. Характерный эффект нарушения баланса между ЮГ и 20-Э в пользу первого проявляется на стадии личинки в виде увеличения временных интервалов между линьками, увеличения веса и размеров личинок, и появления дополнительных линек у насекомых с недетерминированным их числом (Грунтенко, 2008).
Упрощенно схема их взаимодействия выглядит следующим образом: 1) ЮГ стимулирует синтез желточных белков (ЖБ) и экдистероидов в яичниках; 2) экдистероиды, продуцируемые в основном фолликулярными клетками яичника, стимулируют синтез ЖБ в жировом теле; 3) оба гормона регулируют поглощение ЖБ развивающимися ооцитами (Simonet et al., 2004). Часть полученных с пищей SAM и М в организме личинок может быстро включиться в путь биосинтеза фарнезоевой кислоты и ювенильного гормона, а Ф стимулировать в какой-то мере этот процесс, что вызовет нарушение гормонального баланса и проявится в виде эффектов, зафиксированных и в нашем эксперименте.
Аномальная активность метионинового цикла, вследствие поступления избыточных количеств М, Ф и SAM с пищей, может иметь своим следствием и повышенную активность гистоновых и ДНК-метилтрансфераз, предопределяя возможность различных трансгенерационных эффектов в последующих поколениях. У насекомых существует несколько таксономических групп (в том числе и отряд Diptera), у которых системы метилирования ДНК сильно редуцированы, и их проявление ограничивается эмбриональной стадией или же связано с регуляцией активности отдельных фракций генома (Glactad et al., 2011). Мы провели определение уровня метилирования ДНК соматических клеток комнатной мухи в кодирующих областях некоторых генов методом количественной ПЦР. Нам удалось установить, что присутствие в пище избытка доноров метильных групп практически не отражается на уровне метилирования рДНК в соматических тканях имаго мух в родительском и последующем поколениях. По всей видимости, это определяется отсутствием в геноме комнатной мухи (по аналогии с дрозофилой) генов DNMT1 и 3, отвечающих за «поддерживающее» и de novo метилирование ДНК в CG-мотивах (Никоноров и др., 2016).
Заключение
Итак, мы предполагаем, что некоторая часть избыточных количеств доноров метильных групп в пище, предоставленной личинкам комнатной мухи, по всей вероятности, была использована в цикле синтеза ювенильного гормона. Это повлекло за собой нарушение гормонального баланса, что сказалось на нормальном прохождении последующих стадий онтогенеза в родительском поколении и проявлении отсроченных эффектов (в основном, отрицательно сказывающихся на плодовитости и продолжительности жизни) в следующем поколении. Результаты экспериментов с донорами метильных групп позволяют нам предположить, что в основе всех фенотипических различий между линиями лежит разница в балансе гормонов – ЮГ и 20Е. Полученные ранее данные показали, что для долгоживущих особей характерна низкая представленность копий мРНК гена рецептора 20Е – EcR, чему может соответствовать низкий уровень титра эндогенного 20Е (Никоноров и др., 2015). Наши результаты укладываются в следующую схему: баланс ЮГ-20Е в линии Sh gen поддерживается, и его смещение за счет повышенного уровня биосинтеза ЮГ при вовлечении в цикл экзогенного метионина либо других источников метильных групп становится заметным только в случае использования 10-кратных доз метионина, кофактора биосинтеза – фолиевой кислоты и их смеси, а также адеметионина. Именно эти дозы вызывали в наших экспериментах все негативные эффекты, характерные для избытка ЮГ (Грунтенко, 2008) – снижение жизнеспособности в онтогенезе, сокращение репродуктивного периода, снижение плодовитости и продолжительности жизни имаго. Трансгенерационные эффекты, характерные для избытка ЮГ, в этой линии проявлялись как снижение жизнеспособности потомства только при применении 10-кратной дозы фолиевой кислоты; метионин дал снижение продолжительности жизни имаго в первом поколении потомства.
В линии L gen, судя по многим признакам, в т.ч. высокой доле стерильных самцов, неоплодотворенных яиц в кладках смещение гормонального баланса – постоянное явление. Нам представляется, что существует какой-то генетически обусловленный дефект (либо эпигенетический супрессор), приводящий к дефициту 20Е и, соответственно, к снижению уровня экспрессии гена EcR. Титр ЮГ у особей этой линии может быть таким же, как у Sh gen, но сниженный титр 20Е создает дисбаланс гормонов, и этот дисбаланс усиливается даже под действием относительно невысоких доз экзогенных источников метионина.
- Волкова Н.Е.,Филипоненко Н.С., Красовская В.В. и др. Влияние фолиевой кислоты и метионина на приспособленность Drosophila melanogaster // Вестник Харьковского нац. Ун-та им. В.Н. Каразина. Сер. Биология. 2013. Т.17. № 1056. С. 69-83.
- Грунтенко Н.Е. Стресс и размножение насекомых: гормональный контроль // Евразиатский энтомологический журнал. 2008. Т.7. Приложение 1. С.3-46.
- Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В. Механизмы поддержания полиморфизма по продолжительности жизни в лабораторных линиях комнатной мухи // Успехи геронтологии. 2013. Т. 26. С. 594–600.
- Птицина С.Н. Уникальная роль адеметионина в метаболизме клетки и его фармакологический потенциал // Фарматека. М.: Бионика Медиа, 2010. №20. С.26-34.
- http://www.pharmateca.ru/ru/archive/article/8007.
- Раушенбах И.Ю. Нейроэндокринная регуляция развития насекомых в условиях стресса. Новосибирск: Наука. 1990. 159 с.
- Caudill M., Wang J., Melnyk S. et al. Intracellular S-adenosylhomocysteine concentracions predict global DNA hypomethylation in tissues of methyl-deficient cystathionine β-synthase heterozygous mice // J. Nutr. 2001. V. 131. P.2811-2818.
- Dadd R.H. Insect nutrition: current development and metabolic implications // Annu. Rev. Entomol. 1973. V.18. P. 381-420.
- Defelipe L.A., Dolghih E., Roitberg A.E., Nouzova M., Mayoral J.G., Noriega F.G. and Turjanski A.G. Juvenile Hormone Synthesis: “esterify then epoxidize” or “epoxidize then esterify”? Insights from the Structural Characterization of Juvenile Hormone Acid Methyltransferase // Insect Biochem Mol Biol. 2011. V.41. P. 228–235.
- Glastad K.M., Hunt B.G., Yi S.V. and Goodisman M.A.D. DNA methylation in insects: on the brink of the epigenomic era // Insect Mol. Biol. 2011. Vol. 13. P. 117–123.
- Lee B.C., Kaya A., Ma S. et al. Methionine restriction extends lifespan of Drosophila melanogaster under conditions of low amino acid status // Nat. Commun. 2014. V.5. P. 3592-3614. doi:10.1038/ncomms 4592.
- Obata F., Miura M. Enhancing S-adenosyl-methionine catabolism extends Drosophila lifespan // Nat. Commun. 2015. V.6. P. 8332-8341. doi:10.1038/ncomms 9332.
- Simonet G., Poels J., Clayes I., Van LoyT., Franssens V., De Loof A., Vanden Broeck J., Neuroendocrinological and molecular aspects of Insect reproduction // J. Neuroendocrinol. 2004. V. 16. P. 649-659.
- Zajitschek F., ZajitschekS.R.K., Friberg U., Maklakov A.A. Interactive effects of sex, social environment, dietary restriction, and methionine on survival and reproduction in fruit flies // Age. 2013. V. 35. P.1193-1204. doi:10.1007/s11357-012-9445-3.