Исследование конъюгативной активности клубеньковых бактерий с помощью маркирования штаммов флуоресцентными белками

Авторы:
Гуменко Р.С. , Владимирова А.А. , Саргалиева Г.M. , Симахина А.C. , Зайнуллина Л.Ф. , Баймиев Ан.Х. , Баймиев Ал.Х.
Название:
Исследование конъюгативной активности клубеньковых бактерий с помощью маркирования штаммов флуоресцентными белками
Страницы:
55-59
скачано
32 раз(а)


Клубеньковые бактерии (ризобии) - генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Для данных микроорганизмов характерна высокая пластичность генома, связанная в значительной мере с горизонтальным переносом генов, в основном путем конъюгации. В данной работе предложен способ выявления конъюгативного взаимодействия между штаммами клубеньковых бактерий, основанный на их трансформации генно-инженерными конструкциями на основе мобилизируемых плазмид, несущих маркерные гены флуоресцентных белков.
Введение Клубеньковые бактерии (ризобии) - обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями с образованием специализированных структур на корнях, называемых клубеньками [Баймиев и др., 2013]. Проявляемый исследователями интерес к этим бактериям обусловлен с одной стороны, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азотфиксации и необходимостью разработки генетических методов селекции и конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, инокуляция которыми позволит получить высокие урожаи бобовых культур без использования дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений (Симаров, 1990; Борисов и др., 2007), а с другой - использованием клубеньковых бактерий как модельного объекта для изучения биологии взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, генетического контроля и эволюции симбиотических систем (Онищук, 1995; Проворов, 2000; Parniske, 2008). Известно, что для большинства видов ризобий характерно наличие составного генома, что впрочем, является типичным для α-группы протеобактерий (Jumas-Bilak et al., 1998) и подразделение генома на несколько крупных репликонов является общей чертой бактерий семейства Rhizobiaceae, кроме Bradyrhizobium. В архитектуре геномов ризобий отражается высокая рекомбинативная активность данных бактерий, приводящая к их высокому генетическому разнообразию. Сравнительные анализы геномов ризобий показали мозаичность их структуры: области, имеющие высокую степень сохранности синтении разделены другими последовательностями (Guo et al., 2003; Krol et al., 2007), что является доказательством динамичной структуры генома, где часто происходят рекомбинационные события, приводящие к образованию новых версий отдельных репликонов (Brom et al., 1991; Guo et al., 2003). Геномная пластичность клубеньковых бактерий связана в значительной мере с горизонтальным переносом генов (ГПГ). В.Хейманом (Heumann, 1979) было выявлено в культуре ризобий люпина («Rhizobium lupine») образование многочисленных «звездчатых» клеточных комплексов и он связал это с высокоэффективной конъюгацией, приводящей к формированию нестабильных меродиплоидов или полных диплоидов, способных к сегрегации широкого круга новых морфологических типов (Heumann, 1984). Позднее было установлено, что перенос плазмид между разными штаммами ризобий может приводить к геномным перестройкам, проявляющимся в формировании нестабильных коинтегратов и повышающим у реципиентов частоту рекомбинации, которая наиболее активна при скрещивании генетически близких штаммов. Основным путем ГПГ у клубеньковых бактерий является конъюгация. Известно, что в плазмидах и хромосомах ризобий часто обнаруживаются сайты oriT, способные обеспечить высокочастотный конъюгативный перенос сцепленных с ними генов (Herrera-Carvera et al. 1998). Хотя клубеньковые бактерии обладают также системами для генетической трансформации и трансдукции (Pretorius-Guth et al. 1990), однако эффективность их невелика. Исследование конъюгации между дикими штаммами ризобий связана с большими трудностями в связи с отсутствием удобных маркеров для отслеживания данного процесса. Нередко для этих целей используются различные генетические модификации исследуемых штаммов. Например для целей изучения переноса плазмид ризобий были использованы специально разработанные гетерологичные векторные системы, например Tn5-mob + pRP4-4 (Simon et al., 1983). Нами в данной работе исследован новый подход для выявления конъюгативной активности штаммов клубеньковых бактерий с использованием генноинженерных конструкций, несущих гены флуоресцентных белков. Материалы и методы В работе использовали штаммы клубеньковых бактерий, принадлежащих к родам Rhizobium, выделенные из клубеньков горошка лесного (Vicia sylvatica L.) Gl3 и Gl9. Клубеньковые бактерии культивировали на среде JM (1% маннит, 0.05% K2HPO4, 0.02% MgSO4, 0.01% NaCl, 0.1% дрожжевой экстракт) при 28°С. В качестве селективных антибиотиков при трансформации использовали ампициллин (100 мг/мл) и гентамицин (50 мг/мл). Для маркирования штаммов флуоресцентными белками были использованы генно-инженерные конструкции pJNTurboGFP и pJNTurboRFP (Баймиев и др., 2011). Клетки трансформировали векторными конструкциями путем электропорации на приборе MicroPulser (“Bio-Rad Laboratories”, США), с помощью предустановленной программы и протокола для трансформации агробактерий в 0.1 см электропорационной кювете. Электрокомпетентные клетки готовили согласно (Lin, 1995). Меченые бактерии наблюдали на флуоресцентном микроскопе Axio Imager M1 (“Carl Zeiss”, Германия). Для детекции GFP использовали набор светофильтров №10 (полоса возбуждения BP 450-490, испускания BP 515-565), для детекции RFP -- набор светофильтров №15 (возбуждение BP 546/12, испускание LP 590). Для определения мобилизации маркерных плазмид штаммы клубеньковых бактерий трансформировали векторами, несущими гены разных флуоресцентных белков, и выращивали вместе в течение 2 нед на твердой питательной среде при температуре 28°С. Долю клеток клубеньковых бактерий, содержащих только GFP, только RFP, либо оба маркирующих белка одновременно, определяли на проточном цитофлуориметре NovoCyte 2060 (ACEA Biosciences, Inc., США). С этой целью клетки дважды промывали, а затем суспендировали в 500 мкл фосфатного буфера. Популяцию клеток разделяли по параметром прямого (FS) и бокового (SS) светорассеивания. Флуоресценцию регистрировали на канале FITC для детекции GFP и на канале PE для RFP. Параметры напряжения и компенсации выставляли по контрольным немеченым, меченным GFP и меченным RFP клеткам E.coli. Данные обрабатывали в программе NovoExpress v.1.0. Проводили по три независимых опыта для каждого вида трансформации. Результаты и обсуждение Конъюгация у бактерий - форма обмена генетическим материалом между микроорганизмами при их клеточном контакте. Она была обнаружена в 1946 г. Ледербергом (J. Lederberg) и Тейтемом (E. L. Tatum) при исследовании штаммов двойных и тройных ауксотрофных мутантов Е. coli К12. Частота проявления таких бактерий была равна 1 на каждые 107 высеянных родительских клеток. Дальнейшее изучение показало, что они являются генетическими рекомбинантами, то есть клетками, несущими комбинацию генов родительских клеток. В последующих экспериментах, включая электронно-микроскопические наблюдения, было установлено, что обязательным условием для формирования таких рекомбинантов является непосредственный контакт между двумя генетически различающимися бактериями (рис. 1). Рис. 1 Электронограмма конъюгирующих бактерий: 1-клетка-донор, находящаяся в стадии деления (место деления отмечено стрелками); 2-клетка-реципиент; 3-конъюгационный мостик, через который передается генетический материал донора реципиенту; 4- бактериальные жгутики. Конъюгативные плазмиды содержат tra-опероны, ответственные за перенос генетического материала. Ряд генов tra-оперонов определяет синтез половых пилей, другие отвечают за перенос самой плазмиды или мобилизацию переноса хромосомной ДНК из клетки в клетку. Образование F-пилей контролируется генами от traA до traG tra-оперона. От донора к реципиенту переносится только одна нить плазмидной ДНК. Началом переноса является сайт oriT, где с помощью продуктов генов traY и traZ образуется однонитчатый разрыв. Затем с участием гена traD происходит разделение нитей ДНК и образование кольцевых структур плазмидных ДНК. Экспрессия tra-генов регулируется на генетическом уровне. Транскрипция tra-оперона инициируется продуктом гена traJ. Его экспрессия репрессируется совместным действием продуктов генов finO и finP. Гены traS и traT отвечают за явление поверхностного исключения. Проблема переноса неконъюгативных плазмид, не обладающих набором tra генов, решается посредством процесса мобилизации. Неконъюгативные плазмиды - это, как правило, небольшие плазмиды, обладающие собственным началом переноса oriT и кодирующие релаксазу. Для переноса генов от донора к реципиенту таким плазмидам необходимы коньюгативные плазмиды (Pansegrau, Lanka, 1996; Zechner, et al., 2000). Процесс передачи от одной бактериальной клетки другой неконъюгативных плазмид либо хромосомных генов с участием конъюгативных плазмид по типу плазмидной помощи называется мобилизацией. Суть «плазмидной помощи» заключается в перемещении неконъюгативных плазмид из клетки-донора в клетку-реципиент благодаря их взаимодействию с конъюгативной плазмидой. Перемещаемые плазмиды называются мобилизируемыми. Известны два основных механизма мобилизации неконъюгативных плазмид: • перенос неконъюгативной плазмиды за счет продуктов tra-генов конъюгативной. В процессе участвует oriT-сайт неконъюгативной плазмиды и ее гены mob; • перенос неконъюгативной плазмиды в составе коинтегратов с конъюгативными плазмидами. Образование коинтегратов происходит при объединении двух и более репликонов за счет реципрокной рекомбинации по участкам гомологии между репликонами. Такие участки могут создаваться Is- и Tn-элементами. При этом плазмиды со строгим контролем репликации подчиняются репликативному аппарату бактериальной хромосомы и могут существовать в ее составе неопределенно долго. Такие плазмиды с двойным образом жизни получили название эписом. Плазмида содержит генетический район, участвующий в мобилизации - mob. Белки, требуемые для мобилизации, в большинстве случаев кодируются кластером трех генов mobABC, которые транскрибируются в разных направлениях от промоторов, смежных с начальной точкой начала переноса (orfY) (Zhang, Meyer, 1995). Передача плазмиды или хромосомы начинается с однонитевого разрыва в области оriT плазмиды, которая называется точкой начала передачи. Большой практический интерес представляют экспериментальные данные о передаче при внутривидовых, межвидовых и межродовых скрещиваниях различных бактерий конъюгативных плазмид. Нами в данной работе для исследования конъюгативной активности различных штаммов клубеньковых бактерий предполагалось использовать мобилизируемые плазмиды, несущие маркерные гены флуоресцентных белков. Сами по себе данные конструкции в ГПГ участвовать не могут, но если клетка реципиент является конъюгативно активной, т.е. содержит tra-гены, то такие плазмиды становятся способными к горизонтальному переносу между штаммами. В качестве таких плазмид нами были использованы pJNTurboGFP и pJNTurboRFP, несущие гены зеленого и красного флуоресцентных белков соответственно. Поскольку данные конструкции содержат mob участок плазмиды pBBR1 и являлись мобилизируемыми плазмидами, не исключалась возможность их участия в ГПГ в присутствии коньюгативных плазмид. Для этого два штамма бактерии Rhizobium leguminosarum GL3 и GL9 были трансформированы плазмидными конструкциями pJNTurboGFP и pJNTurboRFP, соответственно. После их совместного культивирования на твердой питательной среде, клетки были проанализированы на проточном цитофлуориметре. Рис.2. Фотография совместной культуры клеток штаммов GL3 (GFP) и GL9 (RFP) Rhizobium leguminosarum (микроскоп Axio Imager M1). При анализе на самом деле был обнаружен переход mob содержащих маркирующих плазмид между штаммами клубеньковых бактерий. Так, выявлено образование штаммов имеющих как зеленое, так и красное свечение, т.е., были обнаружены клетки имеющие в своем составе как GFP так и RFP (рис. 3). По-видимому, можно предположить, что один из испытываемых штаммов имел в своем составе плазмиду, способную к мобилизации данных конструкций. Рис.3. Разделение популяций клеток ризобий методом проточной цитометрии. Нижний левый квадрант - дебрис, мертвые нефлуоресцирующие клетки, верхний левый квадрант - клетки штамма GL9 R.leguminosarum, содержащие RFP, нижний правый квадрант - клетки штамма GL3 R.leguminosarum, содержащие GFP, верхний правый квадрант - пул клеток, содержащий оба маркирующих белка. Таким образом, предложенный нами метод исследования конъюгативной активности между штаммами клубеньковых бактерий является работоспособным и дает возможность констатировать факт конъюгативного взаимодействия между ними.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз