Иммунолокализация зеатина и его рибозида в кончиках корней растений пшеницы при введении протонофора карбонилцианид-м-хлорфенилгидразона (КЦХФ)

Авторы:
Ахиярова Г.Р. , Коробова А.В. , Кудоярова Г.Р. , Веселов С.Ю.
Название:
Иммунолокализация зеатина и его рибозида в кончиках корней растений пшеницы при введении протонофора карбонилцианид-м-хлорфенилгидразона (КЦХФ)
Страницы:
157-160
скачано
19 раз(а)


С помощью модифицированного метода связывания цитокининов, позволяющего раздельно с помощью антител к рибозиду зеатина выявлять на срезах присутствие свободных азотистых оснований и их рибозилированных форм, проведено сравнительное изучение локализации в клетках кончика корней зеатина и его рибозида. Показано интенсивное окрашивание кончиков корней как на зеатин, так и его рибозид, ослабевающее в области коры по мере перехода клеток к растяжению. Особенность иммуногистохимического выявления рибозида зеатина заключалась в присутствии рядов интенсивно меченных клеток в области центрального цилиндра. Окрашивание на зеатин резко снижалось под влиянием ингибирования вторично активного трансмембранного переноса, в то время как окрашивание на рибозид зеатина под воздействием протонофора изменялось незначительно.
Введение Мобильными формами гормонов цитокининов являются свободные основания и их рибозиды. Поскольку клеточные мембраны проницаемы для этих соединений цитокинины способны покидать клетки, где они синтезированы, и выполнять функции сигналов, передаваемых на расстояние [Glover et al., 2008]. Обнаружение в клеточных мембранах переносчиков, способных обеспечивать трансмембранный перенос цитокининов против градиента их концентрации, свидетельствует об их возможном участии в транспорте цитокининов [Burkle et al., 2003; Hirose et al., 2005]. В опытах с суспензионной культурой корней арабидопсиса было показано, что вторично активное поглощение клетками цитокининов в форме свободного основания зависит от энергии трансмембранного электрохимического градиента протонов водорода, и нарушение его формирования под влиянием протонофора снижает способность клеток поглощать эти соединения [Cedzich et al., 2008]. Зависимость поглощения рибозилированных форм цитокининов от градиента водорода изучена в меньшей степени, а имеющиеся данные противоречивы [Hirose et al., 2005]. С помощью метода иммуноанализа и иммуногистохимической локализации нами был выявлен более высокий уровень накопления цитокининов в клетках корней, обработанных экзогенным зеатином, по сравнению с корнями, в которые вводили рибозид зеатина [Коробова и др., 2013]. Ингибирование вторично активного трансмембранного переноса с помощью протонофора карбонилцианид-м-хлорфенилгидразона (КЦХФ) резко снижало накопление цитокининов у растений при введении в них свободного зеатина [Kudoyarova et al., 2014]. Влияние КЦХФ на накопление экзогенного рибозида зеатина было выражено в меньшей степени [Коробова и др., 2015]. Представляло интерес выяснить, как обработка растений протонофором влияет на содержание в клетках эндогенных цитокининов. С этой целью мы провели иммуногистохимическую локализацию этих гормонов в кончиках корней, где, по данным литературы, высок уровень эндогенных цитокининов [Aloni et al., 2005]. Материалы и методы Исследования проводили на проростках твердой яровой пшеницы (Triticum durum Desf., сорта Безенчукская 139). Семена проращивали в темноте в течение трех суток, затем проростки пересаживали на 10%-ную среду Хогланда-Арнона и выращивали при освещенности 400 μмоль м-2 с-1 и 14-часовой продолжительности светового дня. Температура воздуха в течение светового периода была в пределах 22-25оС. Шестисуточные растения рассаживали по 10 штук в сосуды со 100 мл 100%-го питательного раствора Хогланда-Арнона для адаптации. В возрасте 7 суток проводили обработку растений протонофором карбонилцианид-м-хлорфенилгидразоном (КЦХФ) до конечной концентрации 10-5 М. Фиксацию кончиков корней (5 мм) для иммунолокализации цитокининов производили через 1 ч после введения КЦХФ в среду. Распределение цитокининов в тканях растений оценивали с помощью иммуногистохимического подхода, используя специфические антитела к рибозиду зеатина [Веселов и др., 1999; Kudoyarova et al., 2014], с помощью модификации, позволяющей раздельно выявлять присутствие в клетках или зеатина или его рибозилированной формы [Веселов, Вальке, 2000]. Модификация основана на конъюгации рибозилированных форм с помощью периодата натрия, а свободных оснований - с помощью смеси альдегидов, растворенных в фосфатном буфере (рН 7.2). Подавление конъюгирования с белком оснований в присутствии смеси альдегидов достигалось путем повышения рН до 9.6 с помощью карбонатно/бикарбонатного буфера, что было показано в модельных опытах [Веселов, Вальке, 2000]. Результаты и обсуждение Для апексов корней было характерно интенсивное окрашивание клеток как на зеатин, так и на его рибозид (рис. 1а,б). Эти данные соответствуют результатам оценки уровня цитокининов в кончиках корней трансгенных растений арабидопсиса, трансформированных с помощью чувствительной к цитокининам репортерной ARR5::GUS конструкции. При этом высокая активность глюкуронизады, кодируемой ARR5::GUS, также была выявлена в кончиках корней [Aloni et al., 2005]. Накопление цитокининов в кончиках корней очевидно обусловлено повышенной экспрессией в них IPT1 гена, кодирующего фермент изопентенилтрансферазу, которая катализирует ключевой этап синтеза цитокининов [Miyawaki et al., 2004]. Рис. 1. Иммуногистохимическая локализация зеатина (а, в) и его рибозида (б, г) в апикальной зоне корней семисуточных контрольных (а, б) растений пшеницы и через 1 ч после введения протонофора КЦХФ в питательный раствор (в, г). По мере удаления от кончика корней, с увеличением размера клеток, свидетельствующем о начале растяжения, уменьшалось окрашивание на цитокинины (как на зеатин, так и на его рибозид), наиболее заметное в области коры. При окрашивании на рибозид зеатина, в центральном цилиндре заметны ряды интенсивно меченых клеток (рис. 1б, отмечены стрелками). Их локализация по краям центрального цилиндра соответствует расположению формирующихся сосудов, где у трансгенных растений с помощью репортерной конструкции выявлена повышенная экспрессия IPT5-гена [Miyawaki et al., 2004]. Значение этих результатов в том, что рибозид зеатина является основной транспортной формой цитокининов, присутствие которой в области сосудов соответствует их предполагаемой транспортной функции. Инкубация корней растений пшеницы в растворе протонофора КЦХФ резко снижала окрашивание на зеатин (рис. 1в). Таким образом, ингибирование вторично активного транспорта не только снижало поглощение экзогенного зеатина клетками [Kudoyarova et al., 2014], но и уменьшало содержание в клетках эндогенных цитокининов. Содержание зеатина в тех или иных клетках корней определяется балансом между процессами, обеспечивающими их накопление (синтез непосредственно в самих клетках и поглощением зеатина, синтезируемого другими клетками) и утечкой зеатина из клеток, в частности, за счет простой диффузии. Поскольку зеатин является относительно гидрофобным веществом, он может пассивно диффундировать через мембрану, и удерживанию зеатина внутри клеток, очевидно, способствует их вторично активное поглощение обратно в клетки. Таким образом, поддержание присутствия зеатина внутри клеток кончика корней зависит от генерации градиента водорода, чья энергия противостоит диффузии зеатина из клеток. Ингибирование вторично активного трансмембранного переноса с помощью протонофора также несколько уменьшало окрашивание на рибозид зеатина (рис. 1г), хотя степень снижения была меньше, чем в случае окрашивания на зеатин. Эти результаты подтверждают меньшую зависимость накопления рибозида зеатина в клетках от вторично активного транспорта по сравнению с зеатином. Меньшая зависимость удержания рибозида зеатина в клетках от вторично активного трансмембранного переноса может объясняться тем, что присутствие остатка рибозы повышает гидрофильность этого вещества и, соответственно, снижает проницаемость для него мембран и возможность утечки из клеток, которой противостоит процесс вторично активного поглощения. Снижение окрашивания на рибозид зеатина под влиянием протонофора заметно в области коры и корневого чехлика, а в центральном цилиндре интенсивность окрашивания на рибозид зеатина у корней, обработанных КЦХФ, была не ниже чем в контроле (необработанные КЦХФ корни). Наряду с рассмотренном выше механизмом, этот феномен может объясняться тем, что в этой области происходит синтез цитокининов [Miyawaki et al., 2004], превращение которых в более гидрофильные формы может обеспечивать их удержание в клетках на фоне ингибирования вторично активного переноса. Альтернативное объяснение может заключаться в том, что открытые недавно транспортеры переносят транспортную форму цитокининов, т.е. рибозилированные формы из клеток наружу, что обеспечивает загрузку этих гормонов в ксилему [Ko et al., 2014]. Снижение энергии электрохимического градиента может уменьшать выход рибозида зеатина из клеток. Необходимы дальнейшие исследования для проверки этого предположения.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз