Новый подход к оценке генетического потенциала семей темной лесной пчелы на основе полиморфизма микросателлитных локусов

Авторы:
Ильясов Р.А. , Косарев М.Н. , Поскряков А.В. , Шарипов А.Я. , Николенко А.Г.
Название:
Новый подход к оценке генетического потенциала семей темной лесной пчелы на основе полиморфизма микросателлитных локусов
Страницы:
138-152
скачано
23 раз(а)


В России и странах Западной и Северной Европы темная лесная пчела Apis mellifera mellifera была признана наиболее эффективной для коммерческого разведения. Ранее пчеловоды северных стран были другого мнения и ставили массовые эксперименты по интродукции и разведению подвидов из Южной и Восточной Европы на своих пасеках. Такое развитие событий привело к массовой интрогрессии генов южных пчел в популяции темной лесной пчелы и стало результатом потери чистоты аборигенного генофонда. Для восстановления генофонда темной лесной пчелы в пределах исторического ареала необходимо проводить селекцию пчелиных семей на основе генетической стандартизации в сохранившихся изолятах A.m.mellifera . По результатам анализа уровня интрогрессии южных генов и оценки уровня средней гетерозиготности по данным полиморфизма 9 микросателлитных локусов мы показали возможность идентификации пчелиных семей с оптимальным генетическим потенциалом. Мы обнаружили, что генетический потенциал пчелиных семей, обитающих в естественных и искусственных дуплах (бортях и колодах) в условиях дикой природы, поддерживается эффективнее по сравнению с семьями, разводимыми в ульях на пасеках.
ВВЕДЕНИЕ Деятельность человека оказывает существенное влияние на распространение медоносной пчелы Apis mellifera. Из 30 известных подвидов пчел, распространенных на всей территории Старого Света, 24 аллопатрических подвида населяют Европу [Ruttner 1988; Hepburn, Radloff, 1998; Engel, 1999; Sheppard, Meixner, 2003; Meixner et al., 2011; Ильясов и др., 2015б]. Из всех европейских пчел только темная лесная пчела Apis mellifera mellifera приспособлена к обитанию в условиях резко-континентального климата Северной Европы с длительными морозными зимами [Ильясов и др., 2012]. Межрегиональные транспортировки пчел привели к фрагментации, сокращению численности аборигенных популяций пчел и смешению подвидов [Ruttner 1988; Garnery et al., 1998; Franck et al., 2001; De la Rua et al., 2002; Schneider et al., 2004; Jensen et al., 2005]. За последние 100 лет в результате массовых транспортировок подвидов пчел, таких как A.m.ligustica, A.m.carnica, A.m.carpatica, A.m.caucasica, A.m.cecropia, относящихся к эволюционной ветви С, из Восточной и Южной Европы в Северную и Западную, генофонд популяции темной лесной пчелы был практически полностью уничтожен [Bouga et al., 2005; Uzunov et al., 2009; Stevanovic et al., 2010; Uzunov et al., 2014]. Темная лесная пчела A.m.mellifera, представитель эволюционной ветви М [Jensen et al., 2005; Whitfield et al., 2006; Soland-Reckeweg et al., 2009; Oleksa et al., 2011; Pinto et al., 2014; Wallberg et al., 2014], на сегодняшний день признана подвидом, находящимся под угрозой вымирания в результате массовой интрогрессии генофонда подвидов пчел эволюционной ветви С [Jensen et al., 2005; Muñoz et al., 2009; Soland-Reckeweg et al., 2009; Oleksa et al., 2011; Nedić et al., 2014; Pinto et al., 2014; Uzunov et al., 2014]. Исследования последних лет показали, что в Европе сохранились небольшие изоляты темной лесной пчелы с той или иной степенью интрогрессии южных генов. A. Oleksa et al. (2011) на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов A7, A24, A28, A88, A113, Ap43, Ap55, Ap66, Ap81 показали до 30% интрогрессии аллелей южных подвидов в популяциях темной лесной пчелы A.m.mellifera в Восточной Польше. A.B. Jensen et al. (2005) на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов A7, A8, A24, A28, A43, A88, A113, Ap36, Ap43, B124, A79 обнаружили в популяциях северного экотипа «Brown» темной лесной пчелы в Скандинавских странах до 10% интрогрессии аллелей южных подвидов. G. Soland-Reckeweg et al. (2009) на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов A007, A28, A43, Ac306, Ap33, Ap273, Ap226, Ap289, B24, A29, A76, Ap1 показали до 70% интрогрессии аллелей южных подвидов в популяциях альпийского экотипа «Nigra» темной лесной пчелы. J.P. Strange et al. (2008) на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов A7, A24, A28, A88, A113, B124, Ap43, Ap55, Ap66, Ap81 показали до 20% интрогрессии аллелей южных подвидов в популяциях экотипа «Landes» темной лесной пчелы во Франции. А.Г. Николенко, А.В. Поскряков (2002) и Р.А. Ильясов с соавт. (2007) на основе анализа полиморфизма локуса COI-COII мтДНК показали до 2% интрогрессии в популяции «Бурзянского» экотипа темной лесной пчелы в Республике Башкортостан. Оценка уровня интрогрессии южных генов в популяции «Бурзянского» экотипа темной лесной пчелы по ядерному геному ранее не проводилась. Таким образом, все сохранившиеся изоляты темной лесной пчелы в Европе содержат следы интрогрессии южных подвидов эволюционной ветви С. Риск загрязнения аборигенного генофонда темной лесной пчелы постоянно растет как в России, так и в Европе по причине интенсификации сельского хозяйства и отсутствия эффективного законодательного регулирования пчеловодства. В результате бесконтрольных перемещений пчел из южных регионов на северные территории аборигенного обитания темной лесной пчелы происходит интрогрессия генов завезенных пчел в аборигенный генофонд темной лесной пчелы в результате миграции трутней. В итоге аборигенная популяция темной лесной пчелы постепенно теряет адаптированность к местным условиям среды, которая была сформирована в течение длительной эволюции [Jensen et al., 2005; Soland-Reckeweg et al., 2009; Rortais et al., 2011; De la Rua et al., 2013; Ильясов и др., 2015в]. Риску генетического загрязнения подвержена и популяция «Бурзянского» экотипа темной лесной пчелы, генетическая изоляция и эффективная численность которой поддерживается небольшим количеством людей в условиях дефицита финансового обеспечения [Николенко, Поскряков, 2002; Ильясов и др., 2007; Ильясов и др., 2015а]. Для успешного сохранения популяции темной лесной пчелы необходимо проводить генетическую стандартизацию с целью идентификации пчелиных семей с минимальным уровнем интрогрессии генов южных подвидов и оптимальным генетическим разнообразием. Генетическое разнообразие в популяции пчел является материалом для естественного отбора и генетического дрейфа и служит основой для протекания микроэволюционных процессов [Jensen et al., 2005; Soland-Reckeweg et al., 2009; Oleksa et al., 2011; Muñoz et al., 2012; Ilyasov et al., 2015]. Генетическое разнообразие пчелиных семей является основой экологической пластичности, которая характеризует приспособленность популяции пчел к изменяющимся условиям окружающей среды [De la Rúa et al., 2009; Dietemann et al., 2009; Meixner et al., 2010; Ильясов и др., 2015б]. Оценка генетического разнообразия имеет важное значение при разработке стратегий сохранения и рационального использования генофонда медоносной пчелы [van Engelsdorp, Meixner, 2010; Harpur et al., 2012; De la Rúa et al., 2013; Harpur et al., 2013; Pinto et al., 2014]. В 1995 году в Европе был запущен международный проект по оценке и поддержанию генетического разнообразия домашних животных MoDAD (the Maintenance of Domestic Animal Genetic Diversity). Проект предусматривал количественную оценку генетического разнообразия популяций домашних животных на основе микросателлитных локусов [Weigend et al., 2002]. В 2014 году в Европе был запущен международный проект SmartBees по оценке и сохранению генетического разнообразия в популяциях темной лесной пчелы A.m.mellifera в Европе. Уральская популяция темной лесной пчелы до сих пор остается неизученной ни одним из европейских и российских проектов, поэтому стратегия сохранения генетического разнообразия этой популяции еще не разработана. Основу генетического разнообразия составляет гетерозиготность, поэтому оценка величины средней гетерозиготности по всем локусам будет характеризовать уровень генетического разнообразия популяции. Поскольку адаптированность всей пчелиной семьи обеспечивается деятельностью нескольких тысяч рабочих особей, то оценка средней гетерозиготности и величины интрогрессии южных генов для выборки рабочих пчел будет характеризовать генетический потенциал всей пчелиной семьи. Оценка генетических характеристик темной лесной пчелы и генетическая стандартизация на уровне отдельно взятой семьи ранее нигде не проводилась. Цель наших исследований - генетическая стандартизация пчелиных семей темной лесной пчелы и идентификация пчелиных семей с лучшим генетическим потенциалом на основе полиморфизма локуса COI-COII мтДНК и 9 микросателлитных локусов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании были использованы рабочие особи пчелиных семей подвидов A.m.mellifera и A.m.caucasica, собранные в 2015 году. Отобранные из каждой семьи живые рабочие пчелы фиксировались в 96% этаноле и хранились до выделения ДНК при минус 100С. Для анализа генетического разнообразия и уровня интрогрессии южных генов анализировалось по 4 пчелы из каждой семьи. Для исследования были отобраны 12 семей темной лесной пчелы (A.m.mellifera) из Бурзянского района Республики Башкортостан (рис. 1), а также из 3 семей серой горной кавказской пчелы (A.m.caucasica) из Сочинского района Краснодарского края, которые были использованы в качестве материала для сравнения. Всего нами было исследовано 60 образцов рабочих пчел из 15 семей (таб. 1). Таблица 1 Объем выборки и локализация пчелиных семей, использованных в генетических исследованиях № Пасека (локализация) Подвид Семья Выборка особей Рабочие названия семей 1 Борти (заповедник «Шульган-Таш») A.m.mellifera 1 4 Борть 1 2 2 4 Борть 2 3 3 4 Борть 3 4 Пасека «Куш-Елга-Баш» (заповедник «Шульган-Таш») A.m.mellifera 7 4 Куш-Елга-Баш 7 5 25 4 Куш-Елга-Баш 25 6 29 4 Куш-Елга-Баш 29 7 Пасека «Капова Пещера» (заповедник «Шульган-Таш») A.m.mellifera 15 4 Капова Пещера 15 8 24 4 Капова Пещера 24 9 31 4 Капова Пещера 31 10 Пасека «Байсалян» (заповедник «Шульган-Таш») A.m.mellifera 1 4 Байсалян 1 11 13 4 Байсалян 13 12 14 4 Байсалян 14 13 Пасека «Красная Поляна» (Краснополянская опытная станция пчеловодства) A.m.caucasica 1 4 Красная Поляна 1 14 2 4 Красная Поляна 2 15 3 4 Красная Поляна 3 Всего 60 Выделение ДНК из мышц торакса рабочих особей пчел проводили набором ДНК-ЭКСТРАН-2 по протоколу СИНТОЛ (Москва) (www.syntol.ru). Качество и количество выделенной ДНК анализировали на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo, США). Полимеразная цепная реакция была выполнена в термоциклере BIO-RAD T100 (США) в 15 мкл общего объема смеси по протоколу СИЛЕКС (Москва) (www.sileks.com/ru/) при температуре отжига 550С для 9 микросателлитных локусов (ap243, 4a110, a24, a8, a43, a113, a88, ap049, a28) [Estoup et al., 1995; Haberl, Tautz, 1999; Solignac et al., 2003] и 480С - для локуса COI-COII мтДНК [Garnery et al., 1993]. Фрагментарный анализ продуктов ПЦР был выполнен на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems (США). В проанализированных семьях пчел по микросателлитным локусам наблюдались следующие аллели: по локусу ap243 3 аллеля - 254 п.н., 257 п.н. и 260 п.н.; по локусу 4a110 - 3 аллеля: 160 п.н., 163 п.н. и 168 п.н.; по локусу a24 - 3 аллеля: 98 п.н., 106 п.н. и 108 п.н.; по локусу a8 - 5 аллелей: 154 п.н., 156 п.н., 158 п.н., 164 п.н. и 173 п.н.; по локусу a43 - 4 аллеля: 128 п.н., 134 п.н., 140 п.н., и 142 п.н.; по локусу a113 - 6 аллелей: 216 п.н., 218 п.н., 220 п.н., 222 п.н., 228 п.н. и 234 п.н.; по локусу a88 - 5 аллелей: 143 п.н., 146 п.н., 148 п.н., 152 п.н. и 155 п.н.; по локусу ap049 - 4 аллеля: 123 п.н., 129 п.н., 130 п.н. и 142 п.н.; по локусу a28 - 3 аллеля: 134 п.н., 140 п.н. и 144 п.н. По межгенному локусу COI-COII мтДНК в проанализированных семьях пчел детектировались фрагменты следующих размеров: фрагменты PQQ - 825 п.н., характеризующие пчел, происходящих от A.m.mellifera по материнской линии (эволюционная ветвь М) и фрагенты Q - 644 п.н., характеризующие пчел, происходящих от A.m.caucasica, A.m.carnica, A.m.carpatica, A.m.ligustica по материнской линии (эволюционная ветвь С) [Garnery et al., 1993]. Продукты амплификации разделялись в 8% ПААГ при силе тока 40мА, окрашивались бромистым этидием и фотографировались в гель-документирующей системе DocPrint Vilber Lourmat (Франция). Статистический анализ полученных результатов проводился с использованием программ FSTAT 2.9.3.2, GENEPOP 4.2.2, POPULATIONS 1.2.28, STRUCTURE 2.3.4, STATISTICA 8.0, MICROSOFT EXCEL 2010. Рисунок 1. Географическая локализация изученных семей темной лесной пчелы на территории заповедника «Шульган-Таш». РЕЗУЛЬТАТЫ Первый этап наших исследований был направлен на получение данных полиморфизма локусов ядерной и митохондриальной ДНК. В 60 рабочих особях выбранных пчелиных семей был проанализирован полиморфизм локуса COI-COII мтДНК и 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 (таб. 1). Второй этап исследований базировался на анализе полученных данных полиморфизма локусов с помощью статистических методов и интерпретации результатов. Нами была проанализирована встречаемость вариантов Q и PQQ межгенного локуса COI-COII мтДНК в выбранных пчелиных семьях. Известно, что присутствие варианта Q локуса COI-COII является показателем южного происхождения семей от подвидов A.m.caucasica, A.m.carnica, A.m.carpatica, A.m.ligustica, а PQQ - северного происхождения семей от темной лесной пчелы A.m.mellifera по материанской линии. Так, в бурзянской популяции все особи пчелиных семей являлись носителями варианта PQQ, что указывает на их происхождение по материнской линии от маток темной лесной пчелы A.m.mellifera. Все взятые для сравнения пчелиные семьи из Сочинского района Краснодарского края имели происхождение по материнской линии от серой горной кавказской пчелы A.m.caucasica и характеризовались вариантом Q локуса COI-COII мтДНК (таб. 2). Таблица 2 Частоты аллелей локуса COI-COII мтДНК и 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 в отобранных пчелиных семьях Локус Аллель Борть 1 Борть 2 Борть 3 Куш-Елга-Баш 7 Куш-Елга-Баш 25 Куш-Елга-Баш 29 Капова Пещера 15 Капова Пещера 24 Капова Пещера 31 Выборка, N 4 4 4 4 4 4 4 4 4 COI-COII Q 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 PQQ 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 ap243 Аллель 1 1,00 1,00 0,50 0,50 0,75 1,00 1,00 0,50 0,50 Аллель 2 0,00 0,00 0,50 0,50 0,25 0,00 0,00 0,50 0,50 4a110 Аллель 1 0,88 0,50 0,50 0,50 0,50 0,75 0,25 0,50 0,75 Аллель 2 0,13 0,25 0,50 0,25 0,00 0,25 0,75 0,50 0,25 Аллель 3 0,00 0,25 0,00 0,25 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 A24 Аллель 1 1,00 1,00 0,50 1,00 1,00 0,50 0,75 1,00 1,00 Аллель 2 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,50 0,25 0,00 0,00 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 A8 Аллель 1 0,75 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,75 1,00 0,75 Аллель 2 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,25 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 A43 Аллель 1 0,75 1,00 1,00 0,75 1,00 1,00 1,00 0,75 0,75 Аллель 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 3 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,25 0,25 A113 Аллель 1 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,25 Аллель 2 0,75 1,00 1,00 1,00 0,50 0,75 1,00 0,75 0,75 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 A88 Аллель 1 0,75 0,75 1,00 0,75 1,00 1,00 0,75 1,00 1,00 Аллель 2 0,25 0,25 0,00 0,25 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Ap049 Аллель 1 1,00 0,50 1,00 0,50 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Аллель 3 0,00 0,50 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 A28 Аллель 1 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,75 1,00 0,75 Аллель 2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,25 Таблица 2 Продолжение Локус Аллель Байсалян 1 Байсалян 13 Байсалян 14 Красная Поляна 1 Красная Поляна 2 Красная Поляна 3 Среднее Выборка, N 4 4 4 4 4 4 COI-COII Q 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 1,00 0,20 PQQ 1,00 1,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,80 ap243 Аллель 1 0,75 0,00 0,25 1,00 1,00 1,00 0,72 Аллель 2 0,25 1,00 0,75 0,00 0,00 0,00 0,28 4a110 Аллель 1 1,00 0,50 0,75 1,00 1,00 0,88 0,68 Аллель 2 0,00 0,50 0,25 0,00 0,00 0,00 0,24 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,08 A24 Аллель 1 1,00 1,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,72 Аллель 2 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 0,88 0,28 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,01 A8 Аллель 1 1,00 0,88 0,63 0,00 0,00 0,00 0,72 Аллель 2 0,00 0,13 0,25 0,00 0,00 0,00 0,04 Аллель 3 0,00 0,00 0,13 1,00 1,00 0,88 0,23 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,01 A43 Аллель 1 1,00 0,88 0,50 0,00 0,00 0,00 0,69 Аллель 2 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 1,00 0,20 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 Аллель 4 0,00 0,13 0,50 0,00 0,00 0,00 0,09 A113 Аллель 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,00 0,07 Аллель 2 1,00 1,00 0,88 0,13 0,00 0,25 0,72 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00 0,04 Аллель 4 0,00 0,00 0,13 0,50 0,38 0,13 0,09 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,25 0,03 Аллель 6 0,00 0,00 0,00 0,13 0,38 0,38 0,06 A88 Аллель 1 0,50 1,00 1,00 0,88 0,50 0,63 0,83 Аллель 2 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,01 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,01 Аллель 5 0,00 0,00 0,00 0,13 0,50 0,13 0,05 Ap049 Аллель 1 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,93 Аллель 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 Аллель 4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 A28 Аллель 1 0,75 1,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,75 Аллель 2 0,25 0,00 0,00 1,00 1,00 1,00 0,25 Для получения генетических характеристик и оценки генетического потенциала пчелиных семей необходимо анализировать полиморфизм локусов ядерной ДНК. Известно, что матка оплодотворяется 15-20 неродственными трутнями, которые вносят генетическое разнообразие в популяцию рабочих особей пчелиной семьи [Baudry et al., 1998; Oxley et al., 2010; Harpur et al., 2012]. Отсюда, в популяции рабочих особей в одной семье может присутствовать потомство от разных трутней одновременно. Данное явление должно проявляться в виде значительного генетического разнообразия среди рабочих особей пчелиной семьи. На основе результатов анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 ядерной ДНК нами была рассчитана средняя гетерозиготность пчелиных семей (таб. 3). Таблица 3 Средняя гетерозиготность и уровень интрогрессии генов подвидов эволюционных ветвей М и С в семьях пчел, рассчитанные на основе анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28. Семья пчел Выборка особей Ветвь М, % Ветвь С, % Средняя гетерозиготность Борть 1 4 100 0 0,23 Борть 2 4 100 0 0,25 Борть 3 4 100 0 0,21 Куш-Елга-Баш 7 4 100 0 0,40 Куш-Елга-Баш 25* 4 99,5 0,5 0,25 Куш-Елга-Баш 29* 4 99 1 0,21 Капова Пещера 15* 4 99 1 0,25 Капова Пещера 24 4 100 0 0,21 Капова Пещера 31* 4 98 2 0,35 Байсалян 1 4 100 0 0,20 Байсалян 13 4 100 0 0,12 Байсалян 14* 4 99,5 0,5 0,30 Красная Поляна 1 4 0 100 0,11 Красная Поляна 2 4 0 100 0,15 Красная Поляна 3 4 0 100 0,23 * - отмечены пчелиные семьи, содержащие незначительный уровень интрогрессии генов пчел южного происхождения. Для популяции пчел характерен собственный оптимальный уровень гентического разнообразия. Дефицит генетического разнообразия приводит к потере экологической пластичности и адаптированности к окружающей среде, а избыток - к потере сбалансированности генома. Уровень средней гетерозиготности среди семей бурзянской популяции темной лесной пчелы A.m.mellifera варьировал от 0,12 до 0,40, а среди семей сочинской популяции серой горной кавказской пчелы A.m.caucasica - от 0,11 до 0,23. К сожалению, в литературе нет исследований по оценке уровня средней гетерозиготности на уровне пчелиной семьи, которые можно было бы использовать для сравнения. Все исследования гетерозиготности пчел проводились на уровне популяций. Так, средняя гетерозиготность, рассчитанная на основе полиморфизма микросателлитных локусов B124, A113, A7, A24, A28, A8 в популяциях A.m.iberiensis в Испании варьировала от 0,43 до 0,47 [De la Rúa et al., 2004]; в популяциях A.m.ligustica в Португалии по данным полиморфизма микросателлитных локусов B124, A113, A7, A24, A28, A8 - от 0,22 до 0,29 [De la Rúa et al., 2006]; в популяциях A.m.carnica в Швейцарии по данным полиморфизма микросателлитных локусов A007, A28, A43, Ac306, Ap33, Ap273, Ap226, Ap289, B24 - от 0,34 до 0,57, а в популяциях A.m.mellifera в Швейцарии, Норвегии и Франции - от 0,37 до 0,58 [Soland-Reckeweg et al., 2009]; в популяциях A.m.mellifera в Польше по данным полиморфизма микросателлитных локусов A7, A24, A28, A88, A113, Ap43, Ap55, Ap66, Ap81 - от 0,49 до 0,64 [Oleksa et al., 2011]; в популяциях A.m.mellifera в районах Республики Башкортостан по данным полиморфизма микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 - от 0,32 до 0,41 [Ильясов и др., 2015б]. Таким образом, исходя из сравнения средних показателей гетерозиготности семей темной лесной пчелы бурзянского района и других популяций A.m.mellifera и A.m.iberiensis (эволюционная ветвь М), а также A.m.caucasica, A.m.ligustica и A.m.carnica (эволюционная ветвь С) мы можем констатировать, что в пчелиных семьях уровень гетерозиготности примерно сходен с гетерозиготностью на уровне популяций. В отдельных семьях наблюдается более низкий уровень средней гетерозиготности. Так, наибольшей средней гетерозиготностью характеризуются: 7 и 25 семьи с пасеки Куш-Елга-Баш (0,40 и 0,25), 15 и 31 семьи с пасеки Капова Пещера (0,35 и 0,25), 14 семья с пасеки Байсалян (0,3), 2 семья бортевых пчел (0,25). Наименьшей средней гетерозиготностью характеризуются: 1 и 2 семьи с пасеки Красная поляна (0,11 и 0,15), 1 и 13 семьи с пасеки Байсалян (0,20 и 0,12). Средние значения гетерозиготности отмечены в 1 и 3 семьях бортевых пчел (0,23 и 0,21), в 29 семье с пасеки Куш-Елга-Баш (0,21), в 24 семье с пасеки Капова Пещера (0,21), в 3 семье с пасеки Красная поляна (0,23). Вероятно, что средний уровень гетерозиготности семьи темной лесной пчелы от 0,21 до 0,23 можно будет принять за оптимальный уровень для популяций пчел Урала и Поволжья. Возможно, что величина средней гетерозиготности зависит от уровня интрогрессии южных генов в семьях пчел бурзянской популяции. Тогда семьи пчел со следами интрогрессии южных генов будут характеризоватья высоким уровнем гетерозиготности. ОБСУЖДЕНИЕ С целью оценки генетических взаимоотношений пчелиных семей нами были рассчитаны генетические дистанции М. Nei (1978) между всеми 15 семьями пчел на основе данных полиморфизма микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 (таб. 4). По полученным значениям генетических дистанций нами была построена дендрограмма методом кластеризации ближайшего соседа (Neighbour joining) (NJ), отражающая генетические взаимоотношения всех отобранных нами пчелиных семей (рис. 2). На дендрограмме можно наблюдать разделение всех семей на два крупных кластера, которые делят пчелиные семьи южного (сочинская популяция) и северного происхождения (бурзянская популяция). Таблица 4 Генетические дистанции M. Nei (1978) между пчелиными семьями Семья Борть 1 Борть 2 Борть 3 Куш-Елга-Баш 7 Куш-Елга-Баш 25 Куш-Елга-Баш 29 Капова Пещера 15 Борть 1 0,00 0,07 0,11 0,10 0,08 0,06 0,09 Борть 2 0,07 0,00 0,11 0,05 0,08 0,08 0,08 Борть 3 0,11 0,11 0,00 0,08 0,10 0,04 0,07 Куш-Елга-Баш 7 0,10 0,05 0,08 0,00 0,09 0,12 0,12 Куш-Елга-Баш 25 0,08 0,08 0,10 0,09 0,00 0,08 0,13 Куш-Елга-Баш 29 0,06 0,08 0,04 0,12 0,08 0,00 0,07 Капова Пещера 15 0,09 0,08 0,07 0,12 0,13 0,07 0,00 Капова Пещера 24 0,07 0,09 0,05 0,05 0,07 0,08 0,09 Капова Пещера 31 0,07 0,11 0,07 0,07 0,08 0,09 0,10 Байсалян 1 0,05 0,08 0,11 0,08 0,10 0,09 0,10 Байсалян 13 0,17 0,17 0,06 0,07 0,13 0,17 0,16 Байсалян 14 0,12 0,17 0,09 0,07 0,13 0,15 0,18 Красная Поляна 1 0,87 1,15 0,92 1,29 1,00 0,72 0,82 Красная Поляна 2 0,95 1,29 1,06 1,47 1,16 0,83 0,92 Красная Поляна 3 0,87 1,13 0,93 1,27 1,02 0,76 0,80 Внутри кластера темной лесной пчелы бурзянской популяции наблюдается дифференциация на подгруппы, которая характеризует генетическую подразделенность популяции. В первую подгруппу объединились все семьи бортевых пчел, а также 7 семья с пасеки Куш-Елга-Баш и 1 и 13 семьи с пасеки Байсалян. Возможно, что семьи на этих пасеках имели происхождение от бортевых пчелиных семей в недавнем прошлом, или же эти пчелиные семьи сформировались под влиянием потока генов через трутней бортевых пчел. Во вторую подгруппу вошли 25 и 29 семьи пчел с пасеки Куш-Елга-Баш, 24 семья с пасеки Капова Пещера и 14 семья с пасеки Байсалян. В третью подгруппу вошли 15 и 31 семьи пчел с пасеки Капова Пещера. Возможно, что такая кластеризация семей пчел бурзянской популяции на подгруппы сформирована под влиянием наличия следов интрогрессии южных генов в некоторых семьях, где сближаются между собой пчелиные семьи со сходными уровнями интрогрессии. Таблица 4 Продолжение Семья Капова Пещера 24 Капова Пещера 31 Бай-салян 1 Бай-салян 13 Бай-салян 14 Красная Поляна 1 Красная Поляна 2 Красная Поляна 3 Борть 1 0,07 0,07 0,05 0,17 0,12 0,87 0,95 0,87 Борть 2 0,09 0,11 0,08 0,17 0,17 1,15 1,29 1,13 Борть 3 0,05 0,07 0,11 0,06 0,09 0,92 1,06 0,93 Куш-Елга-Баш 7 0,05 0,07 0,08 0,07 0,07 1,29 1,47 1,27 Куш-Елга-Баш 25 0,07 0,08 0,10 0,13 0,13 1,00 1,16 1,02 Куш-Елга-Баш 29 0,08 0,09 0,09 0,17 0,15 0,72 0,83 0,76 Капова Пещера 15 0,09 0,10 0,10 0,16 0,18 0,82 0,92 0,80 Капова Пещера 24 0,00 0,02 0,09 0,04 0,04 1,07 1,20 1,09 Капова Пещера 31 0,02 0,00 0,07 0,06 0,04 0,81 0,91 0,82 Байсалян 1 0,09 0,07 0,00 0,14 0,13 0,92 1,00 0,89 Байсалян 13 0,04 0,06 0,14 0,00 0,04 1,29 1,50 1,31 Байсалян 14 0,04 0,04 0,13 0,04 0,00 0,99 1,15 1,03 Красная Поляна 1 1,07 0,81 0,92 1,29 0,99 0,00 0,03 0,02 Красная Поляна 2 1,20 0,91 1,00 1,50 1,15 0,03 0,00 0,03 Красная Поляна 3 1,09 0,82 0,89 1,31 1,03 0,02 0,03 0,00 Рисунок 2. Дендрограмма генетических взаимоотношений пчелиных семей, построенная методом ближайшего соседа по генетическим расстояниям М. Nei (1978) по результатам анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28. Самой важной и интересной оценкой при генотипировании семей пчел является оценка уровня интрогрессии южных генов в геноме темной лесной пчелы, поскольку результаты этого анализа позволяют принимать решение о направленности селекции. Понятие гибридизация и интрогрессия хоть и сходны между собой, но все же отличаются. При гибридизации происходит просто объединение отцовского и материнского генома разных подвидов в одном генотипе гибридного потомства, то есть гомологичные хромосомы будут от разных родителей. В случае интрогрессии смешивание генома происходит на более глубоком уровне и в геном темной лесной пчелы гены интегрируются не в виде гомологичных хромосом, а в виде вставок участков хромосом в результате обмена участками при кроссинговере (рис. 3). Рисунок 3. Гибридизация и интрогрессия генов южных подвидов в ядерный геном темной лесной пчелы (236 млн. п.н.) (Темным цветом указаны фрагменты генома темной лесной пчелы, а светлым - южных подвидов). Поэтому интрогрессия представляет для генома темной лесной пчелы большую опасность, поскольку избавиться от таких внедрившихся во все хромосомы чужеродных фрагментов ДНК практически невозможно. Следует отметить, что интрогрессия происходит только на уровне ядерного генома, в то время как митохондриальный геном (16 тыс. п.н.) наследуется потомством в чистом виде по материнской линии. Потому митохондриальный геном в анализе уровня интрогрессии является неинформативным. Редким исключением является гетероплазмия - когда зигота может сформироваться при участии материнского и отцовского митохондриального геномов, иногда передающихся сперматозоидами от трутней [Никоноров и др., 1998]. Оценку уровня интрогрессии южных генов в семьях пчел бурзянской популяции мы выполнили на основе данных по полиморфизму 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 с использованием программы STRUCTURE 2.3.4 [Pritchard et al., 2000]. На основе Баейсовского анализа (Bayesian analysis) с применением метода кластеризации Монте-Карло с цепями Маркова (Monte Carlo Markov Chain) (MCMC) [Pritchard et al., 2000] при заданом числе кластеров K=2 с использованием модели смешивания (Admixture model) и повторности MCMC (iteration) 5000 были рассчитаны процентные значения интрогрессии генов эволюционной ветви C (A.m.caucasica) в семьях пчел эволюционной ветви M (A.m.mellifera) (таб. 3). На основе полученных значений нами был построен график в виде гистограммы (plot), отражающий уровень интрогрессии для каждой особи из каждой отобранной семьи пчел (рис. 4). Рисунок 4. График, отражающий уровень интрогрессии южных генов рабочих особей семей темной лесной пчелы, построенный на основе данных полиморфизма 9 микросателлитных локусов ap243, 4a110, A24, A8, A43, A113, A88, Ap049, A28 с применением Баейсовcкого анализа методом кластеризации Монте-Карло с цепями Маркова [Pritchard et al., 2000] в программе STRUCTURE 2.3.4 с чиcлом кластеров K=2. Мы можем отметить, что в 25 и 29 семьях пчел с пасеки Куш-Елга-Баш, 15 и 31 семьях с пасеки Капова Пещера, 14 семье с пасеки Байсалян наблюдались следы интрогрессии южных генов от 0,5 до 2%. Пчелиные семьи Сочинского района подвида A.m.caucasica, взятые для сравнения, были отмечены отсутствием интрогрессии северных генов и охарактеризованы как 100% серые горные кавказские пчелы. Таким образом, по митохондриальному геному по полиморфизму локуса COI-COII семьи пчел бурзянской популяции охарактеризованы как 100% A.m.mellifera, а семьи пчел сочинской популяции - как 100% A.m.caucasica. По ядерному геному нет такого однозначного 100% разделения на A.m.mellifera и A.m.caucasica. Конечно интрогрессией 2% можно пренебречь и охарактеризовать эти пчелиные семьи как A.m.mellifera, округлив 98% до 100%. Однако, в селекции так поступать не следует, поскольку при отсутствии селекционного контроля содержание южных генов будет расти и накапливаться. При встрече двух геномов со следами интрогрессии южных генов их потомство может содержать суммарный уровень интрогрессии родительских геномов. Факт наличия следов интрогрессии говорит о том, что в бурзянской популяции темной лесной пчелы изоляция не идеальная и поток генов извне все же происходит. Вероятно, что поток генов происходит в результате залета чужих трутней, что и приводит к появлению следов интрогрессии южных генов только у части рабочих особей. Мы отметили, что в 5 семьях пчел от 1 до 2 пчел из 4 несут следы интрогрессии южных генов, что составляет от 25 до 50% рабочих особей пчелиной семьи на данный период. Соотношение рабочих особей, несущих следы интрогрессии южных генов и с ее отсутствием в пчелиной семье может незначительно варьировать из года в год. Эти временные изменения соотношения рабочих особей в пчелиной семье будут очень незначительными, поскольку матка равномерно выводит потомство от 15-20 трутней. Поэтому вполне достаточно выполнить оценку уровня интрогрессии южных генов в пчелиной семье однократно. Вероятно, что на дендрограмме 2 и 3 подгруппы были сформированы пчелиными семьями со следами интрогрессии южных генов. Во 2 группу попала 24 семья с пасеки Капова Пещера, которая не содержала следы интрогрессии и состояла в генетической близости с 14 семьей с пасеки Байсалян, содержащей 0,5% интрогрессии южных генов. Это можно объяснить тем, что данные пчелиные семьи являются потомками преимущественно близкородственных трутней. Кластерный анализ на основе генетических дистанций не смог дифференцировать 14 семью с пасеки Байсалян со следами интрогрессии от 24 семьи с пасеки Капова Пещера с отсутствием интрогрессии. Возможно, что величина интрогрессии южных генов в 0,5% столь мала, что практически не оказала влияния на оценку генетической дистанции. Почти все семьи с наибольшим значением средней гетерозиготности от 0,25 до 0,40 характеризовались следами интрогрессии южных генов. Исключением являлись 7 семья с пасеки Куш-Елга-Баш [0,40] и 2 семья бортевых пчел [0,25], которые не содержали интрогрессии. Практически все семьи со средним значением гетерозиготности от 0,21 до 0,23 не содержали интрогрессии южных генов. Исключение составляла 29 семья с пасеки Куш-Елга-Баш, которая содержала 1% интрогрессии южных генов. Все пчелиные семьи с наименьшим уровнем средней гетерозиготности от 0,11 до 0,20 не содержали интрогрессии чужеродных генов. Так, из всех проанализированных семей темной лесной пчелы оптимальным генетическим потенциалом обладали семьи со средним и наибольшим уровнями средней гетерозиготности и отсутствием интрогрессии южных генов. В данном случае, оптимальными для селекции являются 7 семья с пасеки Куш-Елга-Баш, 24 семья с пасеки Капова Пещера и все 3 семьи бортевых пчел. Вероятно, что обитание пчел в условиях дикой природы в бортях создает благоприятные условия для сохранения пчелиных семей A.m.mellifera с оптимальным генетическим потенциалом. Поэтому чрезвычайно важно сохранение бурзянской популяции темной лесной пчелы, обитающей в условиях дикой природы на территориях Государственного природного биосферного заповедника «Шульган-Таш», регионального природного заказника «Алтын Солок» и национального парка «Башкирия». B.A.Harpur et al. (2012; 2013) на основе сравнительного анализа нуклеотидной последовательности ядерной ДНК размером 16.5 Kb, включающий 20 генов и 358 сайтов SNP у пчел из 96 семей африканской, европейской и североамериканской популяций экспериментально доказали, что в диких популяциях медоносной пчелы уровень генетического разнообразия выше по сравнению с пчелиными семьями на пасеках. Они предполагают, что при пасечном разведении пчел под давлением искусственного отбора происходит постоянное снижение генетического разнообразия семей пчел. Таким образом, сохранение генетического разнообразия пчелиных семей может самостоятельно происходить в популяциях бортевых пчел в условиях дикой природы. A. Oleksa et al. (2013) на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов A113, A24, A7, A88, Ap28, Ap43, Ap55, Ap66, A025, Ac011, Ap090, Ap103, Ap226, Ap238, Ap243, Ap249, Ap256 показали, что в Восточной Польше матки темной лесной пчелы без интрогрессии южных генов преимущественно скрещиваются с трутнями темной лесной пчелы без интрогрессии. Они пришли к выводу, что темная лесная пчелв A.m.mellifera обладает свойством частичной репродуктивной изоляции от других подвидов. Этот факт дает надежду на вероятность сохранения чистоты генофонда популяции темной лесной пчелы на территории Бурзянского района в условиях окружения популяций гибридного происхождения. Наша Лаборатория биохимии адаптивности насекомых ИБГ УНЦ РАН совместно с региональной общественной организацией «Пчеловоды Башкирии» пришли к соглашению о создании ассоциации «Российская ассоциация Apis mellifera mellifera» (Russian association of Apis mellifera mellifera» РААММ (RAAMM), деятельность которой будет способствовать интеграции пчеловодов и сохранению генофонда темной лесной пчелы A.m.mellifera в регионах России. На данный момент РААММ проходит этап государственной регистрации некоммерческой общественной организации. Мы надеемся, что деятельность РААММ позволит перевести пчеловодство и селекцию темной лесной пчелы на уровень молекулярной генетики, который позволит прогнозировать и сохранить чистоту генофонда и генетического разнообразия популяции A.m.mellifera на десятки поколений вперед.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз