Разнообразие методов молекулярного клонирования продуктов полимеразной цепной реакции

Авторы:
Чемерис А.В. , Чемерис Д.А. , Никоноров Ю.М. , Гималов Ф.Р. , Вахитов В.А.
Название:
Разнообразие методов молекулярного клонирования продуктов полимеразной цепной реакции
Страницы:
167-189
скачано
127 раз(а)


Описаны различные методы клонирования продуктов полимеразной цепной реакции, включаядовольно экзотические. Проведен обзор большого числа экспериментальных работ методического плана, посвященных клонированию ампликонов в фаговых и плазмидных векторах. Все существующие методы клонирования ампликонов можно подразделить на несколько групп в виде клонирования по тупым и липким (выступающим) концам, А/Т-лигирования, рекомбинации. Причем каждый такой подход реализуется множеством способов, отличающихся использованием или неиспользованием ДНК-лигазы, направленным и ненаправленным расположением вставки, а также другими особенностями. Кратко рассмотрены преимущества и недостатки основных методов.
Введение Если до появления в середине 80-х годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Saiki et al., 1985] клонирование каких-либо генов или иных фрагментов ДНК представляло собой довольно продолжительный и весьма трудоемкий процесс в виде создания плазмидных или фаговых клонотек с дальнейшим выявлением в них искомых клонов путем молекулярной гибридизации с радиоактивно-меченным зондом, либо как-то иначе, то уже через несколько часов экспериментатор, благодаря специфичной амплификации фрагментов нуклеиновых кислот с помощью ПЦР после электрофоретического разделения продуктов реакции, мог воочию видеть именно тот фрагмент ДНК, который ему необходимо клонировать в подходящем векторе. Причем, представленный чуть ли не триллионом одинаковых молекул. Однако клонировать хотя бы единичную молекулу из этого триллиона оказалось не так просто как поначалу казалось. Причина этого стала ясна чуть позже, когда было обнаружено, что ставшая широко использоваться в ПЦР к тому времени [Saiki et al., 1988] термостабильная Taq полимераза обладает нематричной активностью и на 3’-концы достраиваемых цепей добавляет по дополнительному нуклеотиду [Clark, 1988; Mole et al., 1989]. Учитывая данное обстоятельство, для клонирования образующихся ампликонов было предложено большое количество методов, среди которых есть как весьма популярные, так и практически неиспользуемые. Данный обзор посвящен рассмотрению только одного из этапов молекулярного клонирования, а именно процесса помещения в подходящую векторную молекулу амплифицированного участка ДНК, называемого здесь «клонированием», практически не касаясь особенностей предварительного проведения самой ПЦР и последующего поиска рекомбинантных конструкций среди образующихся клонов, включая описание различных специальных векторов, нацеленных на позитивную селекцию рекомбинантов после этапа трансформации компетентных клеток E.coli, поскольку эти вопросы заслуживают отдельного внимания. Методические приемы по клонированию множественных вставок при конструировании синтетических генов также затронуты очень кратко. Все существующие методы клонирования ампликонов можно подразделить на безлигазные и с использованием ДНК-лигазы, которые, в свою очередь, делятся на несколько групп в виде клонирования как по тупым, так и по липким концам, рекомбинацией. Причем для каждого такого подхода предложено немало разнообразных вариантов, отличающихся направленным и ненаправленным расположением вставки, бесшовным клонированием и пр. В литературе встречается ряд аббревиатур, обозначающих различные варианты клонирования ампликонов - A/T1-клонирование, UDG2-клонирование, LIC3- клонирование, TOPO4-клонирование и др., каждый из которых может быть реализован отличающимися способами. Не желая вдаваться в различные технические детали процесса клонирования типа фенол-хлороформных депротеинизаций или им подобных процедур, все же напомним, что для образования фосфодиэфирных связей необходимо наличие на концах объединяемых фрагментов ДНК гидроксильной и фосфатной групп. При этом в ходе изложения данного материала для каждого конкретного случая упоминать об этом считаем излишним. Когда же наличие/создание данных функциональных групп определяют ход молекулярного клонирования, о них будет говориться особо. При этом фосфорилирование 5’-концов продуктов ПЦР может быть осуществлено разными способами в виде обработки полинуклеотидкиназой фага Т4 в присутствии АТФ или самих ампликонов или праймеров для их амплификации, которые могут быть также фосфорилированы во время химического синтеза. При написании данной статьи было проанализировано большое число экспериментальных и обзорных работ, однако при цитировании отдавалось предпочтение оригинальным пионерным материалам. Ферментативные особенности некоторых ДНК-полимераз При проведении ПЦР с целью последующего клонирования ампликонов важным моментом является тип используемой термостабильной ДНК-полимеразы. Как известно, большинство ДНК-полимераз являются матрице- зависимыми ферментами, то есть синтезирующими вторую комплементарную цепь ДНК по уже существующей, используя затравочную молекулу. При этом ДНК-полимеразы фактически являются ферментами двойного действия, поскольку наряду с полимеризующей активностью, выражающейся в последовательном присоединении нуклеотидов к растущей цепи ДНК в направлении 5'3', они катализируют еще реакции деполимеризации. К A/T - Adenine/Thymine UDG - Uracil DNA Glycosylase LIC - Ligase Independent Cloning TOPO - Topoisomerase таковым следует отнести пирофосфоролиз, а также проявление экзонуклеазной активности. 3'5'-экзонуклеазная активность выражается в удалении присоединенных нуклеотидов и выполняет редактирующие функции. Некоторые ДНК-полимеразы обладают 5'3'-экзонуклеазной активностью, призванной осуществлять в клетке репарирующие функции уже существующей цепи ДНК. Довольно многие ДНК-полимеразы имеют активность, смещающую одну цепь ДНК, заключающуюся в том, что, строя новую цепь ДНК и встретив на своем пути двухцепочечный участок, такие ферменты, продолжая строить начатую цепь по прежней матричной цепи, вытесняют комплементарную ей на дальнейшем протяжении в направлении 5'3'. ДНК-полимеразы в структурном отношении в целом состоят из трех доменов, два их которых ответственны за экзонуклеазные активности, тогда как третий домен выполняет полимеразные функции, хотя эволюция распорядилась так, что у некоторых ферментов отсутствуют или тот или другой либо даже оба экзонуклеазных домена. Примером матрице-независимой ДНК- полимеразы может служить терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТдТ), осуществляющая синтез одноцепочечной ДНК произвольной длины со случайной последовательностью путем последовательного присоединения нуклеотидов к тупому или выступающему 3'-концу. Однако подобная ограниченная нематричная активность показана и для ряда других ДНК-полимераз, присоединяющих по лишнему нуклеотиду к 3'-концу, причем из смеси всех четырех дНТФ в качестве нематричного нуклеотида такие ДНК-полимеразы оказывают значительное «предпочтение» дАТФ, благодаря большему сродству к нему [Clark et al., 1987; Clark, 1988]. Оставив без внимания прочие ДНК- полимеразы, исследованные в цитированных работах, остановимся подробнее только на ферментах (Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I E.coli, Taq полимераза), используемых, как в раннем варианте ПЦР [Saiki et al., 1985], так и в последовавших и в нынешних подходах к проведению ПЦР соответственно [Saiki et al., 1988]. Ранее у ДНК-полимеразы I E.coil с помощью частичного протеолиза субтилизином была убрана 5'3'-экзонуклеазная активность [Klenow et al., 1971] и ее большой фрагмент, названный Кленовским потерял репарирующие функции, сохранив редактирующие. И хотя этот фермент часто используют для достройки 3’-утопленных концов до тупых, тем не менее ему все же присуща небольшая нематричная активность, которая усиливается для мутантной формы Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I экзо-, лишенной и 5'3'-экзонуклеазной активности [Clark et al., 1987]. У термостабильной Taq полимеразы изначально отсутствует 3'5'-экзонуклеазный домен, вследствие чего данный фермент также характеризуется значительной нематричной активностью [Clark, 1988]. Фактически за общее правило можно принять то, что различные термостабильные ДНК- полимеразы, не обладающие редактирующей активностью, в ходе ПЦР будут приводить к наработке продуктов с наличием нематричного нуклеотида (преимущественно аденина) на 3’концах, которые можно условно обозначить как А-ампликоны. Если быть точнее, то после завершения ПЦР в реакционной смеси может присутствовать смесь фрагментов ДНК, состоящая из ампликонов с обоими тупыми концами, с обоими концами с «навешенными» различными нематричными нуклеотидами, так и с промежуточным состоянием таких концов, когда на одном будет присутствовать нематричный нуклеотид, а на другом - нет. С учетом обеих комплементарных цепей ДНК таких вариантов ампликонов может 25. При этом, как показано в ряде работ [Hu, 1993; Smith et al., 1995; Brownstein et al., 1996; Magnuson et al., 1996], данный процесс носит неслучайный характер, поскольку прилегающие к 3’-концу несколько нуклеотидов оказывают заметное влияние на тип нематричного нуклеотида. Что касается некоторых других термостабильных ДНК-полимераз, используемых в ПЦР, то при наличии у них редактирующей экзонуклеазной активности (например, Pfu полимераза, Pwo полимераза и др.) образующиеся с помощью таких ферментов ампликоны тупоконечны, поскольку не имеют выступающих на 3’-концах нематричных нуклеотидов. Таким образом, исходя из типа используемой в ПЦР термостабильной ДНК- полимеразы (или определенной смеси ферментов с разными свойствами), необходимо выбирать ту или иную стратегию клонирования ПЦР-продуктов. Другим важным моментом при выборе стратегии клонирования ампликонов являются задачи, стоящие перед исследователями в виде дальнейшего обращения с клонированными фрагментами ДНК, поскольку, например, может требоваться направленная ориентация вставки в векторе, причем такие задачи часто предопределяют и тип используемых ДНК-полимераз. Клонирование ампликонов по тупым концам Одним из довольно простых способов клонирования ампликонов в выбранном векторе является объединение вставки и вектора по тупым концам. При этом векторные молекулы предварительно расщепляются подходящими рестрикционными эндонуклеазами, чьи сайты узнавания расположены в так называемом полилинкере или участке множественного клонирования. Чаще всего таким ферментом служит EcoRV (GAT▼ATC)5 или его изошизомер Eco32I [Koester, von Knebel Doeberitz, 2002]. Однако эффективность лигирования по тупым концам довольно низка и при этом существует преимущественная вероятность закольцовывания вектора без вставки. Увеличить выход лигированных продуктов можно за счет повышения концентрации ДНК-лигазы и продолжительности процесса лигирования, а также путем искусственного повышения концентрации реагирующих молекул, достигаемого добавлением в реакционную смесь 10% полиэтиленгликоля 6000. Чтобы снизить вероятность самолигирования рекомендуется дефосфорилировать 5’-концы линеаризованного вектора или в процессе лигирования добавлять рестрикционную эндонуклеазу, по сайту которой происходит встраивание ампликона для исключения образования целостного вектора [Liu, Schwartz, 1992; Bolchi et al., 2005]. Чтобы при этом свести к минимуму вероятность расщепления самой вставки в полилинкер вектора M13mtvh на основе фага М13 был добавлен сайт октануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы SrfI (GCCC▼GGGC) по которому предлагалось вести клонирование [Schlötterer, Wolff, 1996]. Вместо дефосфорилирования линериазованного вектора щелочной фосфатазой предлагается нарабатывать вектор целиком с помощью ПЦР с нефосфорилированными праймерами [Lan et al., 2011]. Другой способ исключить самолигирование векторной молекулы заключается в удалении OH-групп на 3’-концах, достигаемого замещением обычных дНМФ их дидезокси аналогами с помощью ДНК-полимеразы фага Т4 [Ukai et al., 2002]. В одной из работ повысить выход рекомбинантных молекул из вектора с тупоконечными ампликонами предлагается за счет использования летального ccdB гена путем размещения в нем множественных сайтов клонирования, в которые если произойдет вставка, то токсичный для ДНК-гиразы белковый продукт нарабатываться не будет [Hu et al., 2010]. Разработанный тайваньскими авторами Символ ▼ в сайтах узнавания рестрикционных эндонуклеаз здесь и далее означает место расщепления. способ клонирования ампликонов по тупым концам наоборот рассчитан на самолигирование, но уже вектора вместе со вставкой в виде единой линейной молекулы [Su, Hsu, 2004]. Его суть заключается в амплификации целевого продукта с помощью Pfu полимеразы и пары праймеров, один из которых несет участок, комплементарный вектору для клонирования, а добавление векторной молекулы во втором раунде ПЦР приводит к наработке единого ампликона, состоящего из вектора и вставки, самолигирование которого ведет к формированию рекомбинатных клонов. Для образования тупых концов у ампликонов они должны или сразу амплифицироваться с использованием ДНК- полимераз с редактирующей активностью [Lohff, Cease, 1992] или готовиться различными способами уже после завершения ПЦР. Несмотря на то, что Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I обладает некоторой нематричной активностью, его все же используют для удаления нематричных нуклеотидов и затупления или «полирования» концов ампликонов [Hemsley et al., 1989; Lorens, 1991]. Другими используемыми для этой цели ферментами служат Т4 ДНК-полимераза [Skryabin, Vassilacopoulou, 1993; Wang, 1997] или Pfu полимераза [Costa et al., 1994; Costa, Weiner, 1994]. При этом в литературе имеются наблюдения, что если в ПЦР с Taq полимеразой не использовать заключительный этап длительной элонгации, используемый для максимальной достройки ампликонов, то тогда становится возможно непосредственно лигировать продукты ПЦР с вектором по тупым концам [Haqqi, 1992]. Несколько повысить эффективность клонирования ампликонов по тупым концам взялись канадские авторы [Parent et al., 1994]. Ими было предложено после этапа лигирования вектора со вставкой проводить второй раунд ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих вставку, с таким расчетом, чтобы увеличить количество пролигированных целевых ампликонов. Сообщается о пользе киназной обработки продуктов ПЦР, причем фосфорилирование рекомендуется проводить до этапа полировки концов [Kanungo, Pandey, 1993]. Еще одним недостатком тупоконечного лигирования ампликонов является для подавляющего большинства случаев невозможность вырезания клонированного ПЦР-фрагмента той же рестрикционной эндонуклеазой и применение соседних ферментов из полилинкера, добавляя тем самым к ампликону лишние нуклеотиды, что для ряда задач неприемлемо. Хотя во многих обзорных статьях подчеркивается, что лигирование ампликонов по тупым концам исключает возможность направленного клонирования, на самом деле такое все же возможно. Так, предложен способ направленного клонирования при лигировании ампликона с вектором по тупым концам, заключающийся в использовании дефосфорилированного по одному из концов в результате двойного расщепления соответствующими рестрикционными эндонуклеазами линеаризованного вектора и обычного олигонуклеотидного праймера, не несущего на 5’-конце фосфатной группы, тогда как другой праймер напротив фосфорилирован, что позволяет происходить только единственному варианту лигирования, приводящему к формированию двух ников на противоположных цепях ДНК, репарация которых происходит после трансформации уже в бактерии [Weiner, 1993]. Другой способ направленного лигирования ампликона с вектором по тупым концам рассчитан на наличие в 5’-области прямого и обратного праймеров сайтов узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRV, расщепление ампликонов которой приводит к формированию тупых концов. Оригинальность данного подхода заключается еще и в том, что обычно в праймерах размещают сайты узнавания ферментов, генерирующих липкие концы, которые к тому же могут быть различны и позволяют вести направленное клонирование. В данном случае при наличии в одном из праймеров еще и сайта узнавания фермента SmaI (CCC▼GGG) в результате расщепления вектора обоими этими ферментами появляется возможность направленного клонирования, достигаемого путем расщепления лигазной смеси этими рестрикционными эндонуклезазами перед трансформацией, так как в одном из вариантов сайты восстановятся [Liu et al., 2000]. В другой работе наличие в одном из праймеров на 5’-конце только части (CGGG) сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы SmaI позволило авторам при лигировании ампликона специально восстановить только один из сайтов данного фермента, что дает возможность дальнейшего клонирования в это место новых фрагментов ДНК [Tachibana et al., 2007]. Целую линейку векторов для тупоконечного лигирования продуктов ПЦР предложили китайские авторы [Wu et al., 2010]. Особенностью этих векторных молекул служит то, что, помимо маркерных генов и некоторых других особенностей, для формирования тупых концов используется рестрикционная эндонуклеаза IIS-типа SchI (GAGTCNNNNN▼), расщепляющая обе цепи ДНК в стороне от значащих нуклеотидов, что позволяет вести так называемое бесшовное лигирование. Клонирование ампликонов по липким (выступающим) концам Эффективность лигирования липких концов ДНК с подходящей друг к другу комбинацией нуклеотидов значительно эффективнее объединения фрагментов ДНК с тупыми концами, что определяется формированием водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями, удерживающими концы молекул, еще до самого лигирования (образования фосфодиэфирных связей). Создание у вектора и ампликона более протяженных подходящих друг другу выступающих концов позволяет при клонировании обходиться без этапа лигирования, но в этих случаях часто требуется создание специализированных векторов, а также включение дополнительных последовательностей нуклеотидов на 5’-концы праймеров. Образование у ампликонов липких (выступающих) концов возможно не только за счет действия рестрикционных эндонуклеаз, но и иными способами. Так, разработана масса разнообразных вариантов генерирования пригодных для клонирования концов с выступающими комплементарными нуклеотидами, которые можно подразделить на несколько групп, в том числе по типу используемых ферментов. Клонирование ампликонов с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из самых простых решений для клонирования ампликонов по липким концам является включение в 5’-область праймера сайта узнавания подходящей гексануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы, генерирующей выступающие концы [Mullis et al., 1986; Scharf et al., 1986; Welsh et al., 1990]. Причем было показано, что обработка реакционной смеси протеиназой К перед рестриктазным расщеплением заметно повышает выход рекомбинантных клонов [Crowe et al., 1991]. Пролонгированное время расщепления и увеличенное количество фермента(ов) способствует эффективности расщепления ампликонов. Протокол клонирования ампликонов с помощью рестрикционных эндонуклеаз, содержится в статье, посвященной детальному описанию всего процесса [Delidow, 1997]. Расщепление сорбированного через стрептавидин/биотиновую систему на твердой фазе ампликона поочередно разными рестрикционными эндонуклеазами для формирования липких концов, сайты узнавания которых содержались в прямом и обратном праймерах, облегчило подготовку препарата к рестрикции и повысило эффективность данного процесса [Roeder, 2000]. Клонирование ампликона по липким концам полилинкерных рестрикционных эндонуклеаз позволило резко повысить выход рекомбинантов, поскольку между сайтами клонирования в вектора находились еще как минимум два сайта узнавания других ферментов, примененных после стадии лигирования, практически полностью расщепивших холостой вектор [Zeng et al., 1997]. В ранних работах, когда синтез олигонуклеотидов был недешев, подчеркивалась несколько большая стоимость праймеров с сайтами рестрикционных эндонуклеаз из-за их увеличенной длины. В настоящее время это не столь неактуально. Однако наличие палиндромных последовательностей, принадлежащих сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз, в таких праймерах способствует возникновению нежелательных праймерных димеров, в определенной степени исключающих их участие в виде затравочных молекул. Наконец, весьма существенным недостатком размещения сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз на краю праймеров является плохая эффективность расщепления цепей ДНК этими ферментами. Некоторым решением данной проблемы служит добавление большего числа нуклеотидов на 5’-конец праймера за сайтом рестрикционной эндонуклеазы, причем разные ферменты требуют разного количества таких «экстра»-нуклеотидов [Kaufman, Evans, 1990; Zimmermann et al., 1998]. Минимальное увеличение длины подобных праймеров достигается выявлением так называемых криптических сайтов узнавания подходящих рестрикционных эндонуклеаз в амплифицируемых участках. Например, если в среднем сайт гексануклеотидной рестрикционной эндонуклеазы встречается через каждые 4096 пар нуклеотидов, то вероятность нахождения даже пяти конкретных нуклеотидов на любых местах такой шестерки азотистых оснований можно ожидать всего через 170 нуклеотидов. Таким образом, использование криптических сайтов за счет образования на первой стадии отжига в праймере 1-2 неспаривающихся с исходной матрицей нуклеотидов позволяет без удлинения праймера получать возможность расщеплять итоговый ампликон такой рестриктазой. Однако эффективность отжига на первых этапах амплификации может быть несколько хуже и требовать снижения температуры. При этом у экспериментатора появляются те же проблемы в виде возможного образования праймерных димеров. Недостатком такого способа служит также и то, что сайт(ы) используемых ферментов, локализованные в праймерных последовательностях, должны отсутствовать в самом ампликоне, что бывает известно экспериментатору не всегда. Облегчить задачи по дизайну сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз в праймерных последовательностях была призвана специальная компьютерная программа [Hou, 2002]. Другое решение повышения эффективности расщепления в праймерных последовательностях сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз заключается в превращении последних из концевых во внутренние за счет конкатемеризации по тупым концам (подготовленным одним из выше описанных способов) ампликонов [Jung et al., 1990; 1993]. Причем, возможно даже размещение на концах праймеров полусайтов узнавания подходящих рестрикционных эндонуклеаз с таким расчетом, что в процессе образования конкатемеров будут (могут) возникать полноценные сайты расщепления этих ферментов. Одновременно проводимые полировка концов, их фосфорилирование и лигирование с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-лигазы фага Т4 позволило сэкономить время на клонирование ампликонов [Lorens, 1991]. Использование рестрикционной эндонуклеазы Eam1104I с непалиндромным сайтом узнавания и расщепляющим цепи ДНК вне значимых последовательностей CTCTTC(N▼/NNNN▼) позволяет при клонировании ампликонов по липким концам вести бесшовное лигирование, что бывает важно при конструировании экспрессируемых клонов [Padgett, Sorge, 1996]. Для этого сайты узнавания данного фермента были помещены в праймеры для амплификации как целевого продукта, так и векторной последовательности. После завершения ПЦР пригодные для лигирования концы генерировались с помощью рестрикционной эндонуклеазы Eam1104I. Авторы отмечают, что во избежание непредсказуемого расщепления ампликона его наработка может вестись в присутствии метилированного дЦТФ вместо обычного дЦТФ. Некоторое время литовская фирма Fermentas (ныне входящая в состав международного концерна Thermo Scientific) выпускала набор для клонирования ПЦР-продуктов Dovetail PCR Product Cloning Kit, в котором липкие концы у ампликонов, пригодные для клонирования в стандартные полилинкерные сайты векторов, генерировались с помощью аналогичной рестрикционной эндонуклеазы IIS типа Eco31I, расщепляющей цепи ДНК вне значимых последовательностей GGTCTC(N▼/NNNN▼), что позволяло при помещении в праймеры дистально по отношению к 5’-концу части сайтов гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз (например HindIII и BamHI) и проксимально сайт Eco31I получать по четверке выступающих нуклеотидов, комплементарных этим полилинкерным ферментам. При клонировании продуктов ПЦР описано сочетание первичного тупоконечного лигирования, когда к ампликонам с затупленными концами присоединяли линкер, содержащий сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы BamHI, и вторичного лигирования по липким концам с векторами, расщепленными этим же ферментом [Bhat et al., 1991; Kanungo, Pandey, 1993]. Использование адапторов позволяет вести направленное клонирование без расщепления ампликона рестрикционными эндонуклеазами [Lorens, 1991]. Клонирование ампликонов, амплифицированных с использованием практически одинаковых праймеров, но имеющих разную длину Один из простых способов генерации выступающих концов при ПЦР заключается в параллельном проведении двух таких реакций с разными парами праймеров, отличающихся наличием на 5’-концах у прямого и у обратного праймеров дополнительных нуклеотидов. Т.е. в первой реакции удлиненным является прямой праймер, а во второй реакции удлинен уже обратный. Этот принцип эксплуатируется во множестве методических работ, отличающихся некоторыми деталями [Liu, 1996; Ailenberg, Silverman, 1996; Zeng, 1998; Tillett, Neilan, 1999; Walker et al., 2008; Tachibana et al., 2009; Yamabhai, 2009; Pan et al., 2010; Algire, 2013]. По завершению ПЦР продукты двух реакций смешиваются, денатурируются и между образовавшимися цепями проводится молекулярная гибридизация, приводящая к тому, что в смеси в приблизительно равной пропорции будут присутствовать 4 типа молекул в виде: полностью лишенных дополнительных нуклеотидов; несущих на обеих цепях дополнительные нуклеотиды; представляющих собой промежуточные варианты, когда ампликоны несут дополнительные нуклеотиды на той или иной цепи. Последние два типа как раз представляют собой продукты ПЦР с выступающими концами, которые могут быть как одинаковыми, так и разными, что предполагает возможность их направленного клонирования. Некоторое обогащение нужными цепями, несущими липкие концы для лигирования, было осуществлено путем параллельного проведения ассиметричной ПЦР, накапливающей преимущественно по одной цепи в каждой из реакций [Wang et al., 2009]. Что касается векторных молекул, используемых в таком варианте клонирования ампликонов, то они могут нести комплементарные участки или за счет лигированных адапторов [Liu, 1996] или быть расщеплены подходящей(ими) рестрикционной(ыми) эндонуклеазой(ами) [Ailenberg, Silverman, 1996; Zeng, 1998; Walker et al., 2008; Pan et al., 2010]. Другим способом подготовки вектора для лигирования с ним ампликона является аналогичная амплификация плазмидной последовательности, позволяющая исключить зависимость от сайтов рестрикции в полилинкере вектора [Tillett, Neilan, 1999]. Клонирование ампликонов, амплифицированных с использованием праймеров, несущих различные модификации Получение ПЦР-продуктов с одноцепочечным участком на 5’-конце, пригодным для лигирования, возможно также благодаря использованию праймеров, содержащих «непроходимые» для ДНК-полимеразы участки. Так, в одной из работ в праймер был помещен названный авторами 2-дезоксинафтозином модифицированный нуклеотид, препятствующий достраиванию цепи ДНК [Newton et al., 1993]. Другими авторами вместо азотистого основания в праймер включался 1,3-пропандиол, также оставляющий одноцепочечный участок в амплифицируемой ДНК [Gade et al., 2003], пригодный для безлигазного клонирования ампликонов [Kaluz, Flint, 1994]. Венгерскими авторами было предложено размещать в праймерах тетрагидрофуран, предотвращающий продвижение ДНК-полимеразы и тем самым генерирующий липкие концы, пригодные для клонирования по сайтам соответствующих рестрикционных эндонуклеаз [Gal et al., 1999; 2000]. Целый цикл работ японских авторов посвящен клонированию ампликонов путем формирования выступающих одноцепочечных участков в ПЦР с праймерами, несущими вблизи их 5’-конца светочувствительное производное тимина, останавливающего рост комплементарной цепи [Tanaka et al., 2008; 2008a; Kuzuya et al., 2009; 2009a; 2012]. После кратковременной обработки УФ-светом блокирующая группа удалялась и образовывался полноценный (для лигирования) 3’-конец с гидроксильной группой. Описан способ лигазо- независимого клонирования ампликонов путем образования одноцепочечных участков в векторе и вставке за счет использования праймеров, несущих на 5’-концах множественные фосфоротиоатные связи, которые после завершения ПЦР удаляются спиртовым раствором йода [Blanusa et al., 2010]. Аналогом таких подходов стало проведение ПЦР с химерными праймерами, включающими по одному или по несколько рибонуклеотидных остатков. В случае использования ДНК-полимеразы, не преодолевающей данный барьер, сразу в ходе ПЦР образуются ампликоны с выступающими 5’-концами [Coljee et al., 2000; Donahue et al., 2002]. Описан вариант образования выступающих концов, когда уже по завершению амплификации с ДНК- полимеразой, способной строить цепь ДНК по матрице РНК, проводится обработка ампликонов щелочью для удаления рибонуклеотидов [Coljee et al., 2000]. Для улучшения этого процесса при клонировании ПЦР-продуктов другие авторы предложили использовать РНКазу Н, разрушающую цепь РНК в ДНК/РНК-гетеродуплексах [Li, Gao, 2007]. Для генерации выступающих концов, пригодных для лигирования предложено удаление единичных рибонуклеотидных остатков в ампликонах (в праймерных участках) с помощью обработки солями редкоземельных металлов лантана La3+ или лютеция Lu3+ [Chen et al., 2002]. Включение в праймерные последовательности остатков инозина, например, в третье положение с 5’-конца обеспечивает достройку растущих цепей ДНК, но по завершению амплификации с помощью фермента эндонуклеазы V возможно выщепление таких неприродных азотистых оснований и образование выступающих концов, пригодных для лигирования в расщепленном соответствующими рестрикционными эндонуклеазами векторе [Baumann et al., 2013]. UDG-клонирование ампликонов Довольно значительное число работ посвящено разработке разнообразных вариантов клонирования ампликонов с использованием праймеров, содержащих остатки уридина, выщепляемых затем урацил ДНК-гликозилазой. Так, при использовании праймеров, несущих остатки дУМФ, удаляемых после амплификации с помощью урацил ДНК-гликозилазы, последующий разрыв цепи ДНК происходил под действием эндонуклеазы V [Watson, Bennett, 1997]. В литературе описан и более простой способ разрыва фосфодиэфирных связей после выщепления дУМФ из праймерной последовательности обработкой слабой щелочью [Smith et al., 1993]. Принцип формирования выступающих концов, благодаря присутствию в праймерах остатков дУМФ, разработанный в начале 90-х гг., лег в основу коммерческого набора USER (Uracil-Specific Excision Reagent) фирмы New England Biolabs, производимого с 2003 г. Он представляет собой комплекс ферментов из урацил ДНК-гликозилазы и гликозилазы-лиазы Endo VIII. Предложено немало усовершенствований данной технологии безлигазного клонирования ампликонов за счет генерации протяженных одноцепоченых участков ДНК [Nour-Eldin et al., 2006; Bitinaite et al., 2007; Geu-Flores et al., 2007]. Вместо гликозилазы-лиазы Endo VIII в дополнении к урацил ДНК-гликозилазе при клонировании продуктов ПЦР предлагается также использовать фермент эндонуклеазу IV [Hou et al., 2008]. Учитывая популярность подхода и необходимость выбора в состав праймеров нуклеотидных последовательностей для лигирования, разработаны компьютерные программы по дизайну таких олигонуклеотидов [Olsen et al., 2011; Salomonsen et al., 2014]. Если в цитированных выше статьях в праймерные последовательности для клонирования ампликонов вводили по одному остатку дУМФ, то в целой серии работ другой группы авторов, разработавших и усовершенствовавших метод UDG- клонирования, таких остатков уридина было несколько [Nisson et al., 1991; Rashtchian et al., 1992; Booth et al., 1994; Rashtchian, 1995]. За счет этого после обработки ампликонов урацил ДНК- гликозилазой среди 10-11 концевых нуклеотидов возникало 3-4 безнуклеотидных места, что заметно ослабляло в этом участке двойную спираль. Подготовленный аналогичным образом с помощью амплификации вектор без участия ДНК-лигазы объединялся со вставкой и осуществлялась трансформация компетентных клеток. Такой подход позволил за счет разных последовательностей нуклеотидов на 5’-концах праймеров сразу осуществлять множественное сращивание ампликонов [Booth et al., 1994]. Желая несколько упростить процедуру UDG-клонирования ампликонов, было предложено не амплифицировать векторную молекулу целиком, а пришивать к ней готовые адапторы с пригодными для отжига на них праймерных участков ампликонов с ослабленной за счет безнуклеотидных мест двойной спиралью [Andersson et al., 1994]. Завершая рассмотрение способов клонирования ампликонов с использованием праймеров с дУМФ, необходимо заметить, что ДНК-полимеразы с редактирующими активностями не способны вести амплификацию таких матриц [Sakaguchi et al., 1996]. Однако не так давно сообщено о мутантной форме Pfu полимеразы, пригодной для проведения ПЦР с уридин- содержащими праймерами [Norholm, 2010]. Клонирование ампликонов, подвергнувшихся после завершения ПЦР действию различных ферментов Формирование липких концов у ампликонов, пригодных для их лигирования с расщепленными подходящими рестрикционными эндонуклеазами векторами, может быть достигнуто за счет экзонуклеазной активности ДНКполимеразы фага Т4 [Stoker, 1990; Yang et al., 1993], в присутствии определенных дНТФ удаляющей с 3’-конца прочие нуклеотиды и «останавливающейся» на имеющемся в смеси, поскольку полимеразная активность данного фермента многократно превышает редактирующую. Экзонуклеазное удаление нескольких нуклеотидов под действием Т4 ДНК-полимеразы в присутствии одного дНТФ у ампликона и частичное заполнение 3’-утопленных концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I в присутствии также одного (другого) дНТФ в расщепленном векторе позволило вести клонирование продуктов ПЦР по липким концам, исключающим самолигирование вектора [Dietmaier et a., 1993]. Варианты безлигазного клонирования ампликонов требуют более протяженных выступающих комплементарных концов вектора и вставки, чем это может обеспечить рестриктазное расщепление. Проведенное специальное исследование, посвященное определению минимального количества спаривающихся нуклеотидов для трансформации такой конструкцией компетентных клеток E.coli, показало, что 8 нуклеотидов недостаточно, 10 нуклеотидов уже хватает, но при этом 12 отжигающихся друг на друге нуклеотидов обеспечивают четырехкратное увеличение выхода рекомбинантных клонов [Aslandis et al., 1994]. Еще целый ряд работ методического плана посвящены способам безлигазного клонирования ампликонов за счет использования экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы фага Т4, причем длины генерируемых одноцепочечных участков для отжига варьировали от 10-12 до 20 и даже до 40 нуклеотидов [Aslanidis, de Jong, 1990; Haun et al., 1992; Kuijper et al., 1992; Li, Elledge, 2007; Thieme et al., 2011; Hill, Eaton-Rye, 2014; Schmid-Burgk et al., 2014; Thieme, Marillonnet, 2014]. При этом имеются указания, что добавление RecA-белка способствует улучшенному клонированию ампликонов, подвергнутых обработке Т4 ДНК-полимеразой [Li, Elledge, 2007; Hill, Eaton-Rye, 2014]. Предложен интересный вариант двуступенчатого удлинения одноцепочечных участков у вектора и ампликона, достигаемого за счет смены присутствующих дНТФ в реакционной смеси [Tachibana et al., 2009]. Так, на первом этапе Т4 ДНК-полимераза за счет своей экзонуклеазной активности удаляла несколько азотистых оснований до места, где появлялась возможность включения присутствующего в растворе дНТФ. Затем реакция останавливалась и находящийся в растворе дНТФ разрушался под действием термолабильной щелочной фосфатазы, после чего этот фермент инактивировался высокотемпературной обработкой и добавлялась новая порция Т4 ДНК-полимеразы вместе с другим дНТФ, расположенным дальше «вглубь» цепи ДНК. Результатом такого двухэтапного процесса становилось образование более протяженных комплементарных одноцепочечных участков, отжиг которых приводил к образованию устойчивой конструкции, без этапа лигирования пригодной для трансформации компетентных клеток. Если экзонуклеазной активностью Т4 ДНК- полимеразы можно управлять главным образом добавлением в реакционную смесь определенных дНТФ, то ферментативную активность экзонуклеазы III, деградирующей цепь ДНК в 3’→5’-направлении, можно контролировать только временем, при этом известно, что данный фермент работает почти «как часы», удаляя около 25 нуклеотидов за мин [Henikoff, 1987]. Для клонирования ампликонов с использованием экзонуклеазы III и рестрикционных эндонуклеаз с 5’-выступающими концами подходящий вектор расщеплялся такими ферментами, а ампликон, наработанный с помощью праймеров, несущих на самом 5’-конце остатки сайтов узнавания выбранных рестрикционных эндонуклеаз, подвергался кратковременному воздействию экзонуклеазы III, приводящему к образованию одноцепочечных участков, несущих сайты рестрикционных эндонуклеаз, пригодных для лигирования с остающимися небольшими брешами, репарируемыми уже в системе in vivo [Kaluz et al., 1992]. Сходное применение экзонуклеазы III для клонирования ампликонов описано в работах других авторов [Hsiao, 1993; Li, Evans, 1997]. Отличия заключались в конструировании специального вектора и соответствующем дизайне праймеров, приводящих под действием экзонуклеазы III к образованию более протяженных одоцепочечных участков, комплементарных друг другу, что позволяло, не прибегая к лигированию, трансформировать данными генетическими конструкциями компетентные клетки E.coli, в которых происходила репарация как брешей, так и вырезания торчащих нуклеотидов. Для образования выступающих концов для безлигазного клонирования ампликонов предлагалось использовать и другие ферменты, среди которых экзонуклеаза фага лямбда [Tseng, 1999] и экзонуклеаза шестого гена фага Т7 [Zhou, Hatahet, 1995]. Использование рестрикционной эндонуклеазы и никазы для создания протяженных одноцепочечных участков описано китайскими авторами [Yang et al., 2010]. Ими был создан специальный вектор, несущий на разных цепях (по 2 на цепь) 4 сайта никазы Nt.BbvCI (CC▼TCAGC), расщепляющей только одну цепь ДНК, и сайт обычной рестрикционной эндонуклеазы между ними (в их работе это был фермент BamHI). В результате расщепления вектора этими ферментами и прогрева при 80оС происходило выщепление фрагментов ДНК с их диссоциацией, что приводило к формированию одноцепочечных участков. При амплификации в праймерные последовательности на 5’-концы добавлялись комплементарные последовательности, несущие сайты этой же никазы, что позволяло вести безлигазное клонирование ампликона. Другими авторами этот подход был несколько упрощен за счет расположения двух внутренних сайтов узнавания (расщепления) данной никазы на расстоянии двух нуклеотидов друг от друга в результате чего происходило расхождение цепей ДНК без использования дополнительной рестрикционной эндонуклеазы [Hansen et al., 2014]. Клонирование ампликонов мегапраймированием с использованием рестрикционной эндонуклеазы DpnI Один из способов клонирования ампликонов без использования ДНК-лигазы был назван еще и безрестриктазным и описан с некоторыми вариациями во многих статьях [Chen et al., 2000; Geiser et al., 2001; van den Ent, Lowe, 2006; Li et al., 2011; Bond, Naus, 2012; Bryksin, Matsumura, 2013; Erijman et al., 2011; 2014; Ulrich et al., 2012; Peleg, Unger, 2014]. Но на самом деле именно применение рестрикционной эндонуклеазы DpnI является одним из ключевых моментов данного метода, который заключается в проведении двустадийной ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы, где на первой стадии вектор и ампликон амплифицируются по отдельности, причем праймер(ы) для амплификации вставки несут на 5’-концах участки гомологичные векторной последовательности. Затем на второй стадии происходит совместная амплификация кольцевого вектора и вставки, причем наработанный целевой ампликон служит в качестве затравочной молекулы в виде так называемого мегапраймера, что приводит амплификации единой последовательности вектора и вставки. Для уменьшения фона из нерекомбинантных клонов требуется расщепление продуктов второй стадии ПЦР ферментом DpnI, узнающим последовательность GA▼TC и расщепляющим таковую только в случае присутствия метилированного аденина, для чего исходный вектор должен наращиваться в специальных штаммах E.coli dam+. При этом имеется сообщение, что используя крайне малое количество исходного вектора, при клонировании ампликонов этим методом можно обходиться и без использования рестрикционной эндонуклеазы DpnI, поскольку фон и так минимален [Spiliotis, 2012]. Прочие способы клонирования ампликонов по липким концам Одним из первых был предложен метод клонирования ампликонов, основанный на использовании 4 праймеров, два из которых амплифицировали мишень (a и b), а два других (c и d) - вектор [Shuldiner et al., 1990; 1991]. Ключевым моментом было то, что праймеры a и b несли на своих 5’-концах участки, комплементарные 3’-концам линериазованного вектора. Таким образом, после первых циклов ПЦР, удаления праймеров, добавления расщепленного вектора содержимое пробирки делилось на две части и в одной ПЦР шла с праймерами a и с, а в другой - с праймерами b и d, благодаря чему нарабатывались комплементарные последовательности вектора и вставки. После объединения содержимого этих двух пробирок, денатурации и гетерологичного отжига формировались в том числе, несущие по одному отстоящему друг от друга на длину вставки нику на разных цепях, кольцевые молекулы вектора со вставкой, которыми проводилась трансформация компетентных клеток. В дальнейшем метод был несколько упрощен, поскольку оказалось достаточным использование всего трех праймеров [Temesgen, Eschrich, 1996]. Самый простой способ бесферментного клонирования ампликонов путем отжига их 5’-концов, представляющих собой экстрапраймерные последовательности, с комплементарными им участками векторной молекулы, получивший название PIPE (Polymerase Incomplete Primer Extension), заключается в простом непродолжительном объединении амплифицированных вектора и вставки перед трансформацией [Klock et al., 2007; Klock, Lesley, 2009; Stevenson et al., 2013]. Данный метод основан на раннем наблюдении, говорящем что «при ближайшем рассмотрении» ампликоны, даже формирующие одну полосу при их анализе гель- электрофорезом, на самом деле весьма гетерогенны, поскольку несут терминированные на разных расстояниях 3’-концы [Olsen, Eckstein, 1989]. Таким образом, и амплифицированный вектор и вставка среди сотен миллиардов копий (особенно если не проводить последний этап достройки концов) неизбежно будут представлены вариантами с по- разному недостроенными 3’-концами, пригодными для отжига друг с другом, а образующиеся бреши и ники репарируются уже in vivo после трансформации. Ввиду своей простоты этот подход обеспечивает высокую производительность и массовость клонирования ампликонов. Создание вектора, несущего в полилинкере два сайта узнавания рестрикционной эндонуклеазы SfiI, узнающей прерванную палиндромную последовательность GGCCNNNN▼NGGCC, позволило разработать метод клонирования ампликонов, названный китайскими авторами как 3GC-клонирование [Zheng et al., 2008]. Его суть заключается в объединении данного вектора, несущего на обоих 3’-концах последовательности в виде GGG, образующихся, благодаря возможности помещения на места незначащих нуклеотидов в сайте узнавания (приведенных здесь как N) для одного сайта гуанинов, а для другого - цитозинов, с ампликонами, несущими на 3’-концах гомополимерные участки в виде нескольких цитозинов. Последние возникают за счет постамплификационного действия терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, способной к присоединению к свободному 3’-концу некоторого числа нематричных нуклеотидов. При этом лишние (начиная с четвертого цитозина) нуклеотиды гомополимерного хвоста удаляются репарационными ферментами самих бактерий после трансформации. Недавно предложен сходный метод объединения специально подготовленных ампликона и вектора, каждый из которых несет соответствующие гомополимерные концы [Lazinski, Camilli, 2013]. Можно заметить, что некоторое ограничение длины гомополимерных хвостов при их построении ТдТ в этой работе было достигнуто определенным соотношением (19:1) дЦТФ и ддЦТФ. В одной работе также описано создание векторов, предназначенных для клонирования ампликонов и пригодных для лигирования как по тупым, по липким концам, так и путем А/Т-клонирования [Cease, Lohff, 1993]. А/Т-клонирование ампликонов Некой разновидностью липких или выступающих концов можно считать присутствие на 3’-концах молекул ДНК нематричных нуклеотидов, которые или преимущественно представлены аденинами (у А-ампликонов) или могут быть целенаправленно «изготовлены» в виде остатков тимина (для Т-векторов), что позволяет вести так называемое А/Т-клонирование. Если в предыдущих разделах основное внимание уделялось преимущественно способам подготовки ампликонов к лигированию с готовыми векторами, несущими или тупые или липкие концы, которые относительно несложно создать, не принимая во внимание безлигазные методы клонирования, то при А/Т-клонировании, напротив, наиболее важным становится подготовить вектор, несущий навешенные Т-нуклеотиды, а ампликоны в норме (в большинстве случаев) и так содержат нематричные аденины. При этом однородность таких концов у ампликонов весьма важна и об этом нужно помнить, поскольку, как уже отмечалось выше, прилегающие к 3’-концу несколько нуклеотидов оказывают заметное влияние на тип нематричного нуклеотида [Hu, 1993; Smith et al., 1995; Brownstein et al., 1996; Magnuson et al., 1996]. Детальное исследование клонирования ампликонов с Т-вектором в зависимости от первых двух нуклеотидов на 5’-конце праймеров показало, что от наличия того или иного терминального нуклеотида меняется его эффективность, зависимость которой приблизительно можно выразить так - A>>>>>>>>G>C>>>T [Peng et al., 2007], из чего можно сделать вывод, что «выбор» Taq полимеразой нематричного нуклеотида (в данном случае аденина, поскольку оценивалось клонированием в Т-вектор) нуклеотидо-зависим. Как оказалось и проксимальный нуклеотид (при терминальном аденине) также влияет на процесс клонирования следующим образом - aG>aA>>aT>>>aC. Таким образом, при намерении клонировать ампликон с помощью А/Т-концов при подборе праймеров следует избегать наличия на их 5’-концах тимина(ов). Показано также, что более продолжительная финальная достройка ампликонов увеличивает эффективность клонирования продуктов ПЦР, амплифицированных с помощью ДНК-полимеразы без редактирующей активности, свидетельствующая об увеличении пула ампликонов с нематричными нуклеотидами и в частности А-ампликонов [Li, Guy, 1996]. Существует несколько подходов к созданию T-векторов, заключающихся в расщеплении полилинкерных участков векторов с помощью особых эндонуклеаз рестрикции, генерирующих 3’-выступающие концы, или узнающих прерванные палиндромы, в использовании Т-адапторов, а также в «простом навешивании» остатков тимина на тупые концы расщепленного подходящим ферментом вектора находящегося в реакционной смеси только дТТФ с помощью Taq полимеразы. Максимально простой способ клонирования А-ампликонов предложен тайваньскими авторами [Chuang et al., 1995]. Его суть заключается в использовании подходящих рестрикционных эндонуклеаз, генерирующих 3’-выступающие концы - SacI (GAGCT▼C), PvuI (CGAT▼CG), AatII (GACGT▼C), PacI (TTAATT▼AA), где жирным шрифтом выделены крайние нуклеотиды их липких концов, являющиеся у этих ферментов тиминами. Важным моментом для данного способа клонирования является наличие фосфатных групп на 5’-концах ампликона. На этапе лигирования возникают конструкции, в которых происходит образование водородных связей (между комплементарными А/Т основаниями) и фосфодиэфирных связей между остатками тиминов на 3’-концах вектора и нуклеотидами на 5’-концах ампликона. При этом на противоположных цепях образуются бреши в виде одного или трех нуклеотидов, которые после трансформации репарируются уже in vivo. Наиболее часто используемым ферментом для создания вектора с Т-концами является рестрикционная эндонуклеаза XcmI, расщепляющая последовательность CCANNNNN▼NNNNTGG и генерирующая 3’-концы с одним выступающим нуклеотидом, который фактически может быть любым, так как место разреза приходится на незначащие нуклеотиды. Общий принцип, лежащий в основе всех таких векторов, заключается в размещении в полилинкере на некотором расстоянии друг от друга двух участков узнавания этого фермента, последовательности которых подобраны с таким расчетом, что в результате рестрикции образуются одинаковые 3’-концы с тиминами, исключающими лигирование расщепленного вектора без вставки на себя. Учитывая популярность такого подхода для клонирования ПЦР-продуктов, создано большое количество подобных векторов, отличающихся друг от друга расстоянием между двумя сайтами XcmI, фланкирующими сайтами других эндонуклеаз рестрикции и прочими особенностями [Kovalic et al., 1991; Mead et al., 1991; Mitchell et al., 1992; Cha et al., 1993; Harrison et al., 1994; Testori et al., 1994; Kwak, Kim, 1995; Borovkov, Rivkin, 1997; Sampath et al., 1997; Schutte et al., 1997; Testori, Sollitti, 1997, de Vries, 1998; Arashi-Heese et al., 1999; Jo C., Jo S.A., 2001]. Несмотря на то, что большинство T-векторов на основе этой эндонуклеазы рестрикции созданы в 90-х гг. конструирование новых вариантов продолжается и поныне [Aranishi et al., 2004; Wang et al., 2007; Chen et al., 2009; Hong et al., 2009; Zhao et al., 2009; Jun et al., 2010; Gu, Ye, 2011; Janner et al., 2013]. Ряд таких T-векторов в качестве маркерного гена несет ген зеленого флуоресцентного белка gfp [Kwon et al., 1998; Ito et al., 2000; Luo et al., 2008; Park, Zeng, 2007; 2008]. Гораздо меньшее число Т-векторов создано на основе других, также узнающих прерванные палиндромные последовательности рестрикционных эндонуклеаз Eam1105I (GACNNN▼NNGTC) и ее изошизомеров [Ichihara, Kurosawa, 1993; Ido, Hayami, 1997; Jeung et al., 2002; Xuejun et al., 2002; Reisinger et al., 2007; Wang et al., 2007; Dimov, 2012]. Другой подход к приготовлению Т-векторов заключается в расщеплении таковых рестрикционными эндонуклеазами, образующими тупоконечные фрагменты, и навешивании на их 3’-концы тиминов с помощью Taq полимеразы [Marchuk et al., 1991; Trower, Elgar, 1994; Papp et al., 1995; Hadjeb, Berkowitz, 1996; Tsang et al., 1996]. Еще один способ получения Т-вектора, пригодного для лигирования с ампликонами, несущими преимущественно аденины на их 3’-концах, заключается в использовании нематричной активности терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы [Holton et al., 1991]. Однако ввиду того, что данный фермент способен присоединить несколько нуклеотидов, то для исключения такой возможности авторы применили дидезоксиТТФ, не позволяющий происходить дальнейшему росту цепи ДНК. Описан вариант создания Т-векторов, где выступающий остаток тимина на 3’-концах принадлежит специальному адаптору, представляющему собой двухцепочечную олигонуклеотидную структуру, пригодную для лигирования с образующимися липкими концами расщепленного подходящей рестрикционной эндонуклеазой вектора [Horton et al., 1996]. Для исключения самолигирования адаптора и образования димеров 5’-конец липкого конца такого адаптора не содержал фосфатной группы, тогда как 5’-конец комплементарной цепи напротив был фосфорилирован, чтобы облегчить лигирование с А-ампликоном. Был также предложен совсем иной способ создания вектора с выступающими на 3’-концах тиминами [Zimmer, 1993]. Основой конструкции послужила одноцепочечная ДНК фага М13, на которой был отожжен первый олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы XbaI (T▼CTAGA), сформировавший таким образом двухцепочечный участок ДНК, пригодный для расщепления данным ферментом. В результате фаговая одноцепочечная ДНК становалась линеаризованной и несущей на 3’-конце остаток тимина, входящего в сайт узнавания XbaI, а два оставшихся после рестриктазного расщепления фрагмента первого олигонуклеотида, будучи короткими, диссоциировали с матрицы. После отжига на линеаризованной ДНК фага М13 двух новых олигонуклеотидов, подобранных с таким расчетом, что двухцепочечные участки полилинкера данного вектора оба стали нести по одному выступающему на 3’-концах нуклеотиду (а именно, по тимину, отмеченному в сайте узнавания жирным шрифтом), благодаря которым можно было вести A/T-лигирование ампликонов. При этом образуется одно/двухцепочечная конструкция, где вектор представлен по большей части в одноцепочечном виде, а вставка - в двухцепочечном. Еще более сложный способ образования T-концов у вектора для клонирования ампликонов, основанный на использовании специально сконструированных довольно протяженных Т-кассет, был предложен другими авторами [Iwahana et al., 1994; 1994а]. Как и при клонировании ампликонов по тупым концам с помощью особым образом фосфорилированных и дефосфорилированных концов вектора и вставки можно добиться направленного клонирования [Zhou, Gomes-Sanchez, 2000]. В этом случае один из праймеров изначально содержал на 5’-конце фосфатную группу, а вектор был расщеплен первой рестрикционной эндонуклеазой, дефосфорилирован и затем второй фермент удалил десфорилированный участок линейного вектора после чего было произведено навешивание Т-концов Taq полимеразой. В завершении данного раздела по Т-векторам следует уделить внимание работе, где A/T-клонирование ампликонов проводилось после амплификации с использованием Pfu полимеразы, обладающей редактирующей активностью и образующей тупые концы [Zhou et al., 1995]. Учитывая низкую эффективность тупоконечного лигирования, авторы прибегли к постамплификационной достройке А-концов с помощью Taq полимеразы, однако при этом требовался дополнительный этап для удаления остаточной активности Pfu полимеразы. Обойтись без него смогли японские ученые, которые вместе с Taq полимеразой для навешивания аденинов на 3’-концы ампликонов в реакционную смесь добавляли антитела, блокирующие работу ДНК- полимеразы с редактирующей активностью [Kitabayashi et al., 2003]. Топоизомеразное клонирование ампликонов При топоизомеразном клонировании ампликонов возможно объединение вектора со вставкой по тупым концам, А/Т-клонированием, а также путем направленного клонирования вставки [D’Arpa, 2009]. Несмотря на то, что разнообразные варианты этих способов уже описаны в предыдущих разделах, ввиду серьезных отличий предложенного метода TOPO-клонирования ампликонов с помощью Vaccinia virus топоизомеразы I [Shuman, 1994; Cheng, Shuman, 2000] логично остановится на нем отдельно. Топоизомераза I вируса осповакцины является ферментом двойного действия - она узнает пентапиримидиновый мотив (C/T)CCTT▼, расщепляя как никаза лишь одну цепь, а также способна лигировать такие участки. Участок расщепленной цепи в случае его близости к краю молекулы ДНК и соответственно небольшого размера, например из 6 нуклеотидов, диссоциирует. При этом данный фермент через тирозин в 274 положении белковой молекулы образует комплекс с ДНК, несущей на 3’-конце последовательность C/TCCTT [Shuman et al., 1989]. Благодаря реакции трансэтерификации фосфатная группа остается связанной с 3’-концом цепи ДНК. Наличие на противоположных цепях векторной ДНК двух сайтов узнавания TOPO I C/TCCTT, расположенных вплотную или вблизи друг от друга, приводит к формированию линейной формы вектора с двумя ковалентно-связанными молекулами топоизомеразы на концах. Такие комплексы весьма устойчивы и выдерживают 4-х дневное пребывание при 37оС, а при низкой температуре могут храниться неограниченно долго. Это обстоятельство крайне удобно для выпуска соответствующих готовых наборов для клонирования различных фрагментов ДНК. Активированный топоизомеразой осповакцины вектор способен объединяться с ампликоном при условии, что 5’-концы последнего не фосфорилированы, что обычно и бывает при использовании при ПЦР стандартных праймеров. К основным преимуществам TOPO-клонирования следует отнести быстроту процесса (5 мин при комнатной температуре), высокий выход рекомбинантов (до 95%). Некоторым недостатком TOPO-клонирования можно считать необходимость исключения в праймерах последовательностей YCCTT или AAGGR. В литературе также содержится предостережение использования LNA-праймеров, поскольку топоизомераза осповакцины ингибируется нестандартными азотистыми основаниями [Liu et al., 2012], а также наличием мест с отсутствием нуклеотидов [Tian et al., 2004]. Целую линейку TOPO-векторов из нескольких семейств, имеющих различное предназначение, производит американская фирма Invitrogen [Heyman et al., 1999]. Так, в ее ассортименте имеются группы векторов общего назначения для клонирования обычных и протяженных фрагментов ДНК, для клонирования с последующей транскрипцией in vitro, секвенирования, экспрессии в про- и эукариотических клетках, а также для дальнейшего переноса вставок в вектора системы Gateway. Ряд векторов сконструирован для T/A-клонирования вставок, тупоконечного клонирования, направленного клонирования. Причем имеется работа, где показано, что одни и те же вектора, изначально рассчитанные на клонирование того или иного типа вставок (с тупыми или липкими концами, А-ампликонов), хотя и с различной эффективностью, но пригодны для клонирования всех вышеперечисленных типов продуктов ПЦР [Geng et al., 2006]. Подобное возможно потому, что топоизомераза I осповакцины способна вытеснять ненужные (мешающие лигированию) одноцепочечные участки ДНК с последующей репарацией таких мест in vivo [Xiao et al., 2007; D’Arpa, 2009]. Клонирование ампликонов путем рекомбинации Объединение вставки с вектором может происходить также за счет рекомбинации их гомологичных участков в системах как in vitro, так и in vivo, достигаемой благодаря тому, что на 5’-концах праймеров размещаются дополнительные последовательности, совпадающие с определенными местами векторной молекулы. Такое рекомбинационное клонирование ампликонов осуществляется с помощью разных ферментных систем, нуждающихся в разной протяженности гомологичных участков. При этом все методы рекомбинационного клонирования отличаются быстротой процесса, обеспечивая в большинстве случаев бесшовное объединение вставки и вектора в отличие, например, от методов клонирования ампликонов с помощью рестрикционнных эндонуклеаз или А/Т-клонирования, где в местах лигирования могут оказаться нежелательные лишние нуклеотиды, что крайне важно при создании экспрессионных конструкций. Одним из ниболее распространенных методов является клонирование в поставляемых фирмой Invitrogen Gateway векторах, основанных на сайт-специфичной рекомбинационной системе бактериофага лямбда. Протекающие реакции контролируются различными комбинациями ферментов, белков и рекомбинационных сайтов [Hartley et al., 2000; D’Arpa, 2009]. В результате амплификации на противоположных концах ампликона формируются изначально включенные в праймеры дополнительные последовательности attB1 и attB2 протяженностью 25 пар нуклеотидов, позволяющие с помощью так называемой BP Clonase в виде комплекса ферментов (интегразы Int и хозяйского интеграционного фактора IHF) замещать в векторе-доноре pDONR по гомологичным им участкам attP селективный упомянутый выше летальный ген ccdB на ампликон с образованием фланкирующих участков attL1 и attL2, приводя к созданию на основе плазмид из группы pENTR промежуточной генно-инженерной конструкции в виде «вводного клона». Далее вставка из такого вводного клона с помощью специального вектора «доставки», первоначально несущего последовательность attR1-ccdB-attR2, может быть под действием второго ферментного комплекса LR Clonase (Int, IHF и эксиционазы Xis) легко перемещена в подходящий вектор, в том числе для экспрессии клонированного гена и наработки целевого продукта. Желая иметь некоммерческую альтернативу Gateway векторам фирмы Invitrogen китайские авторы создали свой «вводный» Т-вектор, получаемый путем расщепления полилинкера рестрикционной эндонуклеазой AhdI (изошизомер Eam1105I) и рассчитанный на клонирование А-ампликонов [Chen et al., 2007]. Было также предложено сократить двухстадийное клонирование в Gateway векторах до одной стадии за счет использования укороченных attL сайтов, позволяющих обходиться без донорного вектора [Fu et al., 2008]. Если в TOPO-клонировании задействована топоизомераза I вируса осповакцины, то в поставляемой фирмой Clontech системе для рекомбинационного клонирования In-Fusion, используется ДНК-полимераза данного вируса Vaccinia virus вкупе с его же белком I3, специфически связывающимся с одноцепочечной ДНК. Для этого достаточно на 5’-концы праймеров добавить по 15 нуклеотидов, гомологичных выбранным участкам любого вектора, чтобы с линеаризованным вектором под действием Vv полимеразы (присутствие I3 белка увеличивает эффективность клонирования ампликонов на треть [Irwin et al., 2012]) за 30 мин происходило объединение вставки и вектора, по одноцепочечным гомологичным участкам, которые образуются за счет 3’→5’-экзонуклеазной активности данной ДНК-полимеразы [Benoit et al., 2006; Berrow et al., 2007; Zhu et al., 2007]. Репарация возможных брешей будет происходить in vivo уже после трансформации клеток E.coli. Эффективность бесшовного направленного In-Fusion-клонирования фрагментов ДНК протяженностью от 0,5 до 15 т.п.н. достигает 95%. Оно может с успехом использоваться и для одновременного множественного клонирования ампликонов, генерируя протяженные участки в заданной последовательности [Sleight et al., 2010]. Еще одним способом рекомбинационного клонирования ампликонов служит Cre/lox-рекомбиназная система бактериофага P1 [Liu et al., 1998; Buchholz, Bishop, 2001; Khalil et al., 2007]. Описан способ клонирования ампликонов по тупым концам, предполагающий использование несущего lox-участок специального вектора, после расщепления которого подходящей рестрикционной эндонуклеазой на первой стадии лигирования с ампликоном происходит образование тримеров, состоящих из вектора::вставки::вектора. При этом половина конструкций будет содержать векторные последовательности с lox-участком в виде прямых повторов, другая половина - в виде инвертированных. На второй стадии добавляется Cre-белок, циркулизующий рекомбинантные молекулы, становящиеся пригодными для трансформации компетентных клеток [Boyd, 1993]. Среди других используемых для клонирования ампликонов рекомбинационных систем можно отметить RecE/RecT-рекомбинацию [Zhang et al., 2000], Flp-рекомбинацию [Sadowski, 2003], требующих специально сконструированные векторы. В нескольких статьях описываются способы клонирования ампликонов путем гомологичной рекомбинации in vivo после котрансформации компетентных клеток линеаризованным вектором и вставкой, несущей на 3’- и 5’-концах протяженные участки, совпадающие с векторными последовательностями [Bubeck et al., 1993; Oliner et al., 1993; Zhang et al., 2000]. Причем проведенное исследование достаточной длины таких участков показало, что всего 10 нуклеотидов (при 42 нуклеотидах на другом конце) обеспечивают появление рекомбинантных клонов [Bubeck et al., 1993]. Неким продолжением этих работ можно считать технологию клонирования ампликонов путем рекомбинации в системе in vitro, содержащей экстракт лизата клеток какого-либо RecA--штамма E.coli, когда после часовой инкубации линеаризованного вектора с ампликоном при 37оС следовала трансформация компетентных клеток [Zhang et al., 2012; 2014]. Довольно простой и весьма быстрый способ клонирования ампликонов, получивший обозначение Xi-cloning, предлагает фирма Genlantis [www.genlantis.com]. Он заключается в совместной трансформации компетентных клеток (входящих в набор для клонирования) рекомбиназа-позитивного штамма E.coli (SmartCells) двумя молекулами ДНК в виде специального линеаризованного вектора и ампликона, амплифицированного с помощью специфичных праймеров, несущих дополнительно по 28-32 экстрануклеотида на их 5’-концах, гомологичных концам вектора [D’Arpa, 2009]. После трансформации происходит рекомбинация in vivo, в результате которой свыше 85% колоний несут вставку в нужной ориентации. Заключение На основании вышеизложенного можно сделать вывод об огромном разнообразии методов клонирования продуктов ПЦР, которое мы попытались уложить в несколько основных типов и видов, насчитывающих несколько десятков вариантов и вариаций. При этом в последние годы довольно отчетливо прослеживается тенденция разработки новых способов безлигазного бесшовного клонирования ампликонов, пригодных для широкомасштабного конструирования синтетических генов и геномов, что должно являться предметом рассмотрения самостоятельной обзорной статьи.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз