Biomics

Вложенная полимеразная цепная реакция (влПЦР) представляет собой двухстадийную ПЦР, в которой в первом раунде используется внешняя пара праймеров, ведущая к образованию ампликона, содержащего места отжига для внутренней пары праймеров. Эти внутренние праймеры, в свою очередь, образуют ампликон меньшего размера. Существует также вариант полувложенной ПЦР (пвлПЦР), при котором во втором раунде используется один внутренний праймер в паре с одним из внешних. Вложенная ПЦР в первую очередь предназначена для повышения чувствительности реакции за счет увеличения числа копий целевой последовательности в первом раунде для их использования во втором. Кроме того, она обеспечивает специфичность амплификации и отжига праймеров. Внутренние праймеры отжигаются на ампликоне первого раунда, подтверждая правильность отжига внешних праймеров. Существуют различные методы разделения реакционной смеси первого раунда от внутренних праймеров перед вторым раундом амплификации, которые подробно описаны в этом обзоре. Описаны различные вариации влПЦР и практическое применение этого подхода для амплификации целевых последовательностей и анализа ампликонов, включая выявление полиморфизмов ДНК. Отмечено использование вложенной ПЦР для решения задач небиологического характера.

ПЦР, мультиплексная ПЦР, праймеры

1. Бикбулатова С.М., Мингазетдинова С.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Эволюция in vitro – есть ли предел методам «перетасовки» генов? // Успехи современной биологии. 2009. Т. 129(4). С. 323-335.
2. Бикбулатова С.М., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Машков О.И., Гарафутдинов Р.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Cпособы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Вестн. Башгосуниверситета. 2012. Т. 17. № 1. С. 59-67.
3. Гарафутдинов Р.Р., Баймиев Ан.Х., Малеев Г.В., Алексеев Я.И., Зубов В.В., Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Матниязов Р.Т., Сахабутдинова А.Р., Никоноров Ю.М., Кулуев Б.Р., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора // Биомика. 2019. Т.11(1). С. 23 – 70. DOI: 10.31301/2221-6197.bmcs.2019-04
4. Кулуев Б.Р., Баймиев Ан.Х., Геращенков Г.А., Юнусбаев У.Б., Гарафутдинов Р.Р., Алексеев Я.И., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Сто лет гаплоидным геномам. Сейчас наступает время диплоидных // Биомика. 2020. Т.12(4). С. 411-434. DOI: 10.31301/2221- 6197.bmcs.2020-33
5. Чемерис А.В., Аминев Ф.Г., Гарафутдинов Р.Р., Анисимов В.А., Сагитов А.М., Хуснутдинова Э.К., Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А., Михайленко К.И. ДНК-криминалистика. М.: Наука. 2022. 466 С.
6. Чемерис Д.А., Гарафутдинов Р.Р., Кулуев А.Р., Сахабутдинова А.Р., Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Разнообразие методов детекции полиморфных нуклеотидов в известных снипах. III. Аллельспецифичная ПЦР // Биомика. 2022. Т.14(1). С. 32-51. DOI: 10.31301/2221-6197.bmcs.2022-2
7. Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных) // Биомика. 2016. Т. 8. № 3. С. 215-238.
8. Ashrafi EH, Paul N. Heat-activatable primers for hot-start PCR and hot-start one-step RT-PCR: endpoint and real-time experiments // Curr Protoc Mol Biol. 2009. Chapter 15. Unit 15.9. doi: 10.1002/0471142727.mb1509s88
9. Ballantyne KN, van Oorschot RA, Mitchell RJ. Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance // Genomics. 2008. V.91(3). P.301-305. doi: 10.1016/j.ygeno.2007.10.016
10. Ballantyne KN, van Oorschot RA, Mitchell RJ. Increased amplification success from forensic samples with locked nucleic acids // Forensic Sci Int Genet. 2011. V.5(4). P.276-280. doi: 10.1016/j.fsigen.2010.04.001
11. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification // Nucleic Acids Res. 1988. V.16(23). P.11141-11156. doi: 10.1093/nar/16.23.11141
12. Chen R, Gao XB, Yu XL, Song CX, Qiu Y. Novel multiplex PCR assay using locked nucleic acid (LNA)-based universal primers for the simultaneous detection of five swine viruses // J Virol Methods. 2016. V.228. P.60-66. doi: 10.1016/j.jviromet.2015.11.018
13. Claustres M, Kjellberg P, Desgeorges M, Bellet H, Sarda P, Bonnet H, Boileau C. Detection des deletions par amplification d'exons (PCR multiplex) dans la myopathie de Duchenne // J. Genet. Hum. 1989. V.37(3). P.251-257.
14. De Lellis L, Curia MC, Veschi S, Aceto GM, Morgano A, Cama A. Methods for routine diagnosis of genomic rearrangements: multiplex PCR-based methods and future perspectives // Expert Rev Mol Diagn. 2008 Jan;8(1):41-52. doi: 10.1586/14737159.8.1.41
15. Edwards MC, Gibbs RA. Multiplex PCR: advantages, development, and applications // PCR Methods Appl. 1994 Feb;3(4):S65-75. doi: 10.1101/gr.3.4.s65
16. Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology // Clin Microbiol Rev. 2000. V.13(4). P.559-570. doi: 10.1128/CMR.13.4.559
17. Garafutdinov R.R., Galimova A.A., Sakhabutdinova A.R. Polymerase chain reaction with nearby primers // Anal. Biochem. 2017. V. 518. P. 126- 133. doi: 10.1016/j.ab.2016.11.017.
18. Garafutdinov R.R., Galimova A.A., Sakhabutdinova A.R. The influence of quality of primers on the formation of primer dimers in PCR // Nucleos. Nucleot. Nucleic Acids. 2020. V. 39(9). P. 1251-1269. doi: 10.1080/15257770.2020.1803354.