Biomics

Применение термостабильной Taq-ДНК-полимеразы из термофильной эубактерии Thermus aquaticus в реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) превратило этот метод в один из наиболее востребованных инструментов молекулярной биологии. Среди его важных применений — оценка уровня транскрипционной активности отдельных генов и детекция РНК-содержащих вирусов. Для работы с РНК-матрицами требовался предварительный этап синтеза комплементарной ДНК (кДНК), который первоначально выполнялся исключительно с помощью вирусных обратных транскриптаз. Однако термолабильность этих ферментов создавала существенные ограничения: реакции обратной транскрипции, предшествующей ПЦР, приходилось проводить в неоптимальных температурных условиях. Кроме того, при относительно низких температурах молекулы РНК образовывали стабильные вторичные структуры, затрудняющие синтез кДНК. В связи с этим перспективным представлялось использование для получения кДНК термостабильной Taq-ДНК-полимеразы, что и было успешно реализовано. Позднее было установлено, что Tth-ДНК-полимераза из родственной бактерии T. thermophilus в присутствии ионов марганца проявляет значительно более высокую ревертазную (обратной транскриптазную) активность — примерно на два порядка выше, чем у Taq-полимеразы. Создание генно-инженерных вариантов термостабильных ДНК-полимераз на основе Taq-, Tth-полимераз и ряда других аналогичных ферментов позволило существенно улучшить этап обратной транскрипции. Особо важным достижением стало получение мутантных ферментов, сочетающих ревертазную активность с редактирующей 3′→5′-экзонуклеазной (корректирующей) активностью, что заметно снижает частоту ошибок при синтезе кДНК.

термостабильная ДНК-полимераза, Taq-полимераза, Tth-полимераза, обратная транскриптаза, ревертазная активность, ОТ-ПЦР, кДНК

1. 1. Гребенникова Т.В., Глухов А.И., Чистякова Л.Г. и др. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus KTП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2α и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости. Молек. Биол. 1995. 29(4). 930-931.
   2. Каледин А.С., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus aquaticus YT Биохимия. 1980. 45(4). 644-651.
   3. Каледин А.С., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus flavus. Биохимия. 1981. 46(9). 1576-1581.
   4. Каледин А.С., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus ruber. Биохимия. 1982. 47(11). 1785-1791.
   5. Auer T, Sninsky JJ, Gelfand DH et al. Selective amplification of RNA utilizing the nucleotide analog dITP and Thermus thermophilus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1996. 24(24). 5021-5025. doi: 10.1093/nar/24.24.5021
   6. Barnes WM, Zhang Z, Kermekchiev MB. A Single Amino Acid Change to Taq DNA Polymerase Enables Faster PCR, Reverse Transcription and Strand-Displacement. Front Bioeng Biotechnol. 8. 553474. doi: 10.3389/fbioe.2020.553474
   7. Bellofatto V, Cross GA. Characterization of RNA transcripts from the alpha tubulin gene cluster of Leptomonas seymouri. Nucleic Acids Res. 1988 Apr 25;16(8):3455-69. doi: 10.1093/nar/16.8.3455
   8. Bhadra S, Maranhao AC, Paik I, Ellington AD. One-Enzyme Reverse Transcription qPCR Using Taq DNA Polymerase. Biochemistry. 59(49). 4638-4645. doi: 10.1021/acs.biochem.0c00778
   9. Blatter N, Bergen K, Nolte O et al. Structure and function of an RNA-reading thermostable DNA polymerase. Angew Chem Int Ed Engl. 2013. 52(45). 11935-11939. doi: 10.1002/anie.201306655
   10. Byrne BC, Li JJ, Sninsky J et al. Detection of HIV-1 RNA sequences by in vitro DNA amplification. Nucleic Acids Res. 1988. 16(9). 4165. doi: 10.1093/nar/16.9.4165
   11. Cai D, Behrmann O, Hufert F et al. Capacity of rTth polymerase to detect RNA in the presence of various inhibitors. PLoS One. 2018. 13(1). e0190041. doi: 10.1371/journal.pone.0190041
   12. Chang H. In situ transcription with Tth DNA polymerase and fluorescent nucleotides. J Immunol Methods. 1994. 176(2). 235-243. doi: 10.1016/0022-1759(94)90317-4
   13. Choi WS, He P, Pothukuchy A et al. How a B family DNA polymerase has been evolved to copy RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 2020. 117(35). 21274-21280. doi: 10.1073/pnas.2009415117
   14. Cozens C, Pinheiro VB, Vaisman A et al. A short adaptive path from DNA to RNA polymerases. Proc Natl Acad Sci USA. 109(21). 8067-8072. doi: 10.1073/pnas.1120964109
   15. Cusi MG, Valassina M, Valensin PE. Comparison of M-MLV reverse transcriptase and Tth polymerase activity in RT-PCR of samples with low virus burden. Biotechniques. 1994. 17(6). 1034-1036.
   16. Ellefson JW, Gollihar J, Shroff R et al. Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase. Science. 352(6293). 1590-1593. doi: 10.1126/science.aaf5409
   17. Goblet C, Prost E, Whalen RG. One-step amplification of transcripts in total RNA using the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1989. 17(5). 2144. doi: 10.1093/nar/17.5.2144
   18. Grabko VI, Chistyakova LG, Lyapustin VN et al. Reverse transcription, amplification and sequencing of poliovirus RNA by Taq DNA polymerase. FEBS Lett. 1996. 387(2-3). 189-192. doi: 10.1016/0014-5793(96)00491-7
   19. Harbarth P, Vosberg HP. Enzymatic amplification of myosin heavy-chain mRNA sequences in vitro. DNA. 1988. 7(4). 297-306. doi: 10.1089/dna.1988.7.297
   20. Heller RC, Chung S, Crissy K et al. Engineering of a thermostable viral polymerase using metagenome-derived diversity for highly sensitive and specific RT-PCR. Nucleic Acids Res. 47(7). 3619-3630. doi: 10.1093/nar/gkz104
   21. Huber LB, Marchand V, Somtürk M et al. Engineering of novel DNA polymerase variants for single enzyme quantitative multiplex reverse transcription-PCR. Sci Rep. 15(1). 26147. doi: 10.1038/s41598-025-10211-x
   22. Jones MD, Foulkes NS. Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1989. 17(20). 8387-8388. doi: 10.1093/nar/17.20.8387
   23. Jozwiakowski SK, Connolly BA. A modified family-B archaeal DNA polymerase with reverse transcriptase activity. Chembiochem. 2011. 12(1). 35-37. doi: 10.1002/cbic.201000640
   24. Karkas JD, Stavrianopoulos JG, Chargaff E. Action of DNA polymerase I of Escherichia coli with DNA-RNA hybrids as templates. Proc Natl Acad Sci USA. 1972. 69(2). 398-402. doi: 10.1073/pnas.69.2.398
   25. Kranaster R, Drum M, Engel N et al. One-step RNA pathogen detection with reverse transcriptase activity of a mutated thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase. Biotechnol J. 5(2). 224-231. doi: 10.1002/biot.200900200
   26. Moser MJ, DiFrancesco RA, Gowda K et al. Thermostable DNA polymerase from a viral metagenome is a potent RT-PCR enzyme. PLoS One. 2012. 7(6). e38371. doi: 10.1371/journal.pone.0038371
   27. Myers TW, Gelfand DH. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry. 1991. 30(31). 7661-766 doi: 10.1021/bi00245a001
   28. Okano H, Baba M, Kawato K, Hidese R et al. High sensitive RNA detection by one-step RT-PCR using the genetically engineered variant of DNA polymerase with reverse transcriptase activity from hyperthermophilies. J Biosci Bioeng. 2018. 125(3). 275-281. doi: 10.1016/j.jbiosc.2017.10.004
   29. Okano H, Katano Y, Baba M et al. Enhanced detection of RNA by MMLV reverse transcriptase coupled with thermostable DNA polymerase and DNA/RNA helicase. Enzyme Microb Technol. 2017. 96. 111-120. doi: 10.1016/j.enzmictec.2016.10.003
   30. Ong JL, Loakes D, Jaroslawski S et al. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 2006. 361(3). 537-550. doi: 10.1016/j.jmb.2006.06.050
   31. Powell LM, Wallis SC, Pease RJ et al. A novel form of tissue-specific RNA processing produces apolipoprotein-B48 in intestine. Cell. 1987. 50(6). 831-840. doi: 10.1016/0092-8674(87)90510-1
   32. Raghunathan G, Marx A. Identification of Thermus aquaticus DNA polymerase variants with increased mismatch discrimination and reverse transcriptase activity from a smart enzyme mutant library. Sci Rep. 2019. 9(1). 590. doi: 10.1038/s41598-018-37233-y
   33. Rüttimann C, Cotorás M, Zaldívar J et al. DNA polymerases from the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB-8. Eur J Biochem. 1985. 149(1). 41-46. doi: 10.1111/j.1432-1033.1985.tb08890.x
   34. Sano S, Yamada Y, Shinkawa T et al. Mutations to create thermostable reverse transcriptase with bacterial family A DNA polymerase from Thermotoga petrophila J Biosci Bioeng. 2012. 113(3). 315-321. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.11.001
   35. Sauter KB, Marx A. Evolving thermostable reverse transcriptase activity in a DNA polymerase scaffold. Angew Chem Int Ed Engl. 45(45). 7633-7635. doi: 10.1002/anie.200602772
   36. Schönbrunner NJ, Fiss EH, Budker O et al. Chimeric thermostable DNA polymerases with reverse transcriptase and attenuated 3'-5' exonuclease activity. Biochemistry. 2006. 45(42). 12786-12795. doi: 10.1021/bi0609117
   37. Shaffer AL, Wojnar W, Nelson W. Amplification, detection, and automated sequencing of gibbon interleukin-2 mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase reverse transcription and polymerase chain reaction. Anal Biochem. 1990. 190(2). 292-296. doi: 10.1016/0003-2697(90)90196-g
   38. Shibata H, Tahira T, Hayashi K. RNA-primed PCR. Genome Res. 1995. 5(4). 400-403. doi: 10.1101/gr.5.4.400
   39. Smirnova EV, Blagodatskikh KA, Barsova EV et al. Comparison of Commercially Available Thermostable DNA Polymerases with Reverse Transcriptase Activity in Coupled Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assays. Methods Protoc. 2025. 8(1). 11. doi: 10.3390/mps8010011
   40. Tomilova YE, Russkikh NE, Yi IM, Shaburova EV, Tomilov VN, Pyrinova GB, Brezhneva SO, Tikhonyuk OS, Gololobova NS, Popichenko DV, Arkhipov MO et al. Enhancing the reverse transcriptase function in Taq polymerase via AI-driven multiparametric rational design. Front Bioeng Biotechnol. 12. 1495267. doi: 10.3389/fbioe.2024.1495267
   41. Tse WT, Forget BG. Reverse transcription and direct amplification of cellular RNA transcripts by Taq polymerase. Gene. 1990 Apr 16;88(2):293-6. doi: 10.1016/0378-1119(90)90047-u
   42. Rechkunova NI, Akishev AG, Lebedeva NA et al. Thermostable DNA-polymerase from Thermus thermophilus B35: isolation and characterization of some properties. Biochemistry (Mosc). 63(11). 1266-1270.
   43. Vichier-Guerre S, Ferris S, Auberger N et al. A population of thermostable reverse transcriptases evolved from Thermus aquaticus DNA polymerase I by phage display. Angew Chem Int Ed Engl. 2006. 45(37). 6133-6137. doi: 10.1002/anie.200601217
   44. Yasukawa K, Konishi A, Shinomura M et al. Kinetic analysis of reverse transcriptase activity of bacterial family A DNA polymerases. Biochem Biophys Res Commun. 2012. 427(3). 654-658. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.09.116