Biomics

В 1955 г. у бактерии Azotobacter vinelandii был обнаружен фермент полинуклеотидфосфорилаза, и таким образом ферментативному синтезу олигонуклеотидов в 2025 г. формально исполняется 70 лет, а открытию выделенной из тимуса теленка терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (ТдТ), также иногда называемой по фамилии автора ферментом Боллума ‒ 65 лет. Однако лишь в последнее десятилетие наметился серьезный прогресс в ферментативном синтезе с помощью данного фермента протяженных олигонуклеотидов с задаваемой последовательностью. Справедливости ради следует заметить, что сам F.J.Bollum еще в 1986 г. в обзорной статье, намного опередив свое время, описал способ подобного ферментативного синтеза олигонуклеотидов. В настоящее время синтез олигонуклеотидов с помощью ТдТ с желаемой последовательностью может производиться разными путями, обеспечивающими временную остановку полимеризации после вставки одного модифицированного дНМФ, несущего на 3’-конце блокирующую группу, и затем его возобновления после удаления блокиратора, которых предложено уже немало. Другой подход заключается в формировании комплекса из обычного дНТФ с ТдТ, что приводит к встраиванию в растущую цепь ДНК дНМФ, связанного с ТдТ, и чтобы продолжить синтез с новым подобным комплексом, фермент из предыдущего конъюгата нужно из цепи ДНК удалить. Еще один подход основан на конкуренции ТдТ с другими ферментами, например, с апиразой, разрушающей неиспользованные на предыдущей стадии дНТФ. Для эффективного ферментативного синтеза олигонуклеотидов необходимо улучшение свойств ТдТ, в том числе увеличение ее термостабильности, чему во многих работах уделяется повышенное внимание. Если на протяжении многих лет ТдТ, помимо тимуса теленка, выделялась также из мыши, то в последние годы описаны подобные ферменты из птиц, которые, к слову сказать, являются более теплокровными по сравнению с млекопитающими и, следовательно, их ферменты априори более устойчивы к повышенной температуре. При этом уже создано множество генно-инженерных ТдТ, обладающих улучшенными свойствами по сравнению с нативными ферментами. Имеются примеры коммерческого заказного синтеза олигонуклеотидов увеличенной протяженности, производимого разными фирмами (в том числе до 600 звеньев), а также выпускается специализированный «ТдТ синтезатор».

олигонуклеотид, полинуклеотидфосфорилаза, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, ТдТ, фермент Боллума

1. Саченко А.Б., Щур В.В., Усанов С.А. и др. Влияние ДНК-связывающих белков на ферментативную активность терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в системах с гомополимерными субстратами. Прикл. биохим. микробиол. 2024. 60(6). 589-601. doi: 10.31857/S0555109924060038
2. Adamopoulos PG, Tsiakanikas P, Stolidi I et al. A versatile 5' RACE-Seq methodology for the accurate identification of the 5' termini of mRNAs. BMC Genomics. 2022. 23(1). 163. doi: 10.1186/s12864-022-08386-y
3. Ashley J, Potts IG, Olorunniji FJ. Applications of Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Enzyme in Biotechnology. Chembiochem. 2023. 24(5). e202200510. doi: 10.1002/cbic.202200510
4. Baltimore D. Is terminal deoxynucleotidyl transferase a somatic mutagen in lymphocytes? Nature. 1974. 248(447). 409-411. doi: 10.1038/248409a0
5. Barthel S, Palluk S, Hillson NJ et al. Enhancing Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Activity on Substrates with 3' Terminal Structures for Enzymatic De Novo DNA Synthesis. Genes (Basel). 11(1). 102. doi: 10.3390/genes11010102
6. Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene. 1977. 2(2). 95-113. doi: 10.1016/0378-1119(77)90000-2
7. Bollum FJ. Calf thymus polymerase. J Biol Chem. 1960. 235. 2399-2403.
8. Bollum FJ. Oligodeoxyribonucleotide primers for calf thymus polymerase. J Biol Chem. 1960. 235. PC18-20.
9. Bollum FJ. Oligodeoxyribonucleotide-primed reactions catalyzed by calf thymus polymerase. J Biol Chem. 237. 1945-1949.
10. Bollum FJ. Terminal deoxynucleotidyl transferase. In: Boyer PD (ed.) The enzymes. 1974. V. 10. Academic Press. 145–171.
11. Bollum FJ. Terminal deoxynucleotidyl transferase: biological studies. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 47. P.347-374. doi: 10.1002/9780470122921.ch6
12. Chang LM, Bollum FJ. Deoxynucleotide-polymerizing enzymes of calf thymus gland. V. Homogeneous terminal deoxynucleotidyl transferase. J Biol Chem. 1971. 246(4). 909-916.
13. Chang LM, Bollum FJ. Molecular biology of terminal transferase. CRC Crit Rev Biochem. 1986. 21(1). 27-52. doi: 10.3109/10409238609113608
14. Chang LM, Bollum FJ. Multiple roles of divalent cation in the terminal deoxynucleotidyltransferase reaction. J Biol Chem. 1990. 265(29). 17436-17440.
15. Chen D, Patton JT. Reverse transcriptase adds nontemplated nucleotides to cDNAs during 5'-RACE and primer extension. Biotechniques. 2001. 30(3). 574-580, 582. doi: 10.2144/01303rr02
16. Chua JPS, Go MK, Osothprarop T et al. Evolving a Thermostable Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. ACS Synth Biol. 2020. 9(7). 1725-1735. doi: 10.1021/acssynbio.0c00078
17. Church GM, Gao Y, Kosuri S. Next-generation digital information storage in DNA. Science. 337(6102). 1628. doi: 10.1126/science.1226355
18. Desiderio SV, Yancopoulos GD, Paskind M et al. Insertion of N regions into heavy-chain genes is correlated with expression of terminal deoxytransferase in B cells. Nature. 1984. 311(5988). 752-755. doi: 10.1038/311752a0
19. Efcavitch JW, Sylvester JE. Modified template-independent enzymes for polydeoxynucleotide synthesis. US Patent US20160108382A1. (2015).
20. Eisenstein M. Enzymatic DNA synthesis enters new phase. Nat Biotechnol. 2020. 38(10). 1113-1115. doi: 10.1038/s41587-020-0695-9
21. Flamme M, Hanlon S, Iding H et al. Towards the enzymatic synthesis of phosphorothioate containing LNA oligonucleotides. Bioorg Med Chem Lett. 48. 128242. doi: 10.1016/j.bmcl.2021.128242
22. Flamme M, Hanlon S, Marzuoli I. et al. Evaluation of 3′-phosphate as a transient protecting group for controlled enzymatic synthesis of DNA and XNA oligonucleotides. Commun Chem. 5. 68. doi: 10.1038/s42004-022-00685-5
23. Flamme M, Katkevica D, Pajuste K et al. Benzoyl and Pivaloyl as Efficient Protecting Groups for Controlled Enzymatic Synthesis of DNA and XNA Oligonucleotides. 2022. Asian J. Organ. Chem. 2022. 11(10). e202200384. doi: 10.1002/ajoc.202200384
24. Forget SM, Krawczyk MJ, Knight AM et al. Evolving a terminal deoxynucleotidyl transferase for commercial enzymatic DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 2025. 53(4). gkaf115. doi: 10.1093/nar/gkaf115
25. Gao N, Yu A, Yang W et al. Enzymatic de novo oligonucleotide synthesis: Emerging techniques and advancements. Biotechnol Adv. 2025. 82. 108604. doi: 10.1016/j.biotechadv.2025.108604
26. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 1992. 119(3). 493-501. doi: 10.1083/jcb.119.3.493
27. Gilham S, Smith M. Enzymatic synthesis of deoxyribo-oligonucleotides of defined sequence. Nat New Biol. 1972. 238(86). 233-234. doi: 10.1038/newbio238233a0
28. Gillam S, Jahnke P, Smith M. Enzymatic synthesis of oligodeoxyribonucleotides of defined sequence. J Biol Chem. 1978. 253(8). 2532-2539.
29. Gillam S, Rottman F, Jahnke P et al. Enzymatic synthesis of oligonucleotides of defined sequence: synthesis of a segment of yeast iso-1-cytochrome c gene. Proc Natl Acad Sci USA. 1977. 74(1). 96-100. doi: 10.1073/pnas.74.1.96
30. Gillam S, Waterman K, Doel M et al. Enzymatic synthesis of deoxyribo-oligonucleotides of defined sequence. Deoxyribo-oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Res. 1(12). 1649-1664. doi: 10.1093/nar/1.12.1649
31. Gillam S, Waterman K, Smith M. Enzymatic synthesis of oligonucleotides of defined sequence. Addition of short blocks of nucleotide residues to oligonucleotide primers. Nucleic Acids Res. 1975. 2(5). 613-624. doi: 10.1093/nar/2.5.613
32. Grunberg-Manago M, Ochoa S. Enzymatic synthesis and breakdown of polynucleotides; polynucleotide phosphorylase. Am. Chem. Soc. 1955. 77(11). 3165–3166. doi: 10.1021/ja01616a093
33. Grunberg-Manago M, Oritz PJ, Ochoa S. Enzymatic synthesis of nucleic acidlike polynucleotides. Science. 1955. 122(3176). 907-910. doi: 10.1126/science.122.3176.907
34. Grunbeerg-Manago M, Ortiz PJ, Ochoa S. Enzymic synthesis of polynucleotides. I. Polynucleotide phosphorylase of Azotobacter vinelandii. Biochim Biophys Acta. 1956. 20(1). 269-285. doi: 10.1016/0006-3002(56)90286-4
35. Gu R, Oweida T, Yingling YG et al. Enzymatic Synthesis of Nucleobase-Modified Single-Stranded DNA Offers Tunable Resistance to Nuclease Degradation. Biomacromolecules. 2018. 19(8). 3525-3535. doi: 10.1021/acs.biomac.8b00816
36. Hiatt AC, Rose F. Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides. US Patent 6,214,987 B1. (2001)
37. Hsieh WT. Polymerization of deoxyribonucleoside diphosphates with an enzyme from an Escherichia coli mutant lacking deoxyribonucleic acid polymerase activity. J Biol Chem. 1971. 246(6). 1780-1784.
38. Jackson DA, Symons RH, Berg P. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 1972. 69(10). 2904-2909. doi: 10.1073/pnas.69.10.2904
39. Kato KI, Gonçalves JM, Houts GE eet al. Deoxynucleotide-polymerizing enzymes of calf thymus gland. II. Properties of the terminal deoxynucleotidyltransferase. J Biol Chem. 1967. 242(11). 2780-2789.
40. Kaufmann G, Littauer UZ. Deoxyadenosine diphosphate as substrate for polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli. FEBS Lett. 1969. 4(2). 79-83. doi: 10.1016/0014-5793(69)80201-2
41. Lee H, Wiegand DJ, Griswold K et al. Photon-directed multiplexed enzymatic DNA synthesis for molecular digital data storage. Nat Commun. 2020. 11(1). 5246. doi: 10.1038/s41467-020-18681-5
42. Lee HH, Kalhor R, Goela N et al. Terminator-free template-independent enzymatic DNA synthesis for digital information storage. Nat Commun. 2019. 10(1). 2383. doi: 10.1038/s41467-019-10258-1
43. Li AN, Shi K, Zeng BB et al. Enhancing the expression of terminal deoxynucleotidyl transferases by N-terminal truncation. Biotechnol J. 19(9). e2400226. doi: 10.1002/biot.202400226
44. Li K, Lu X, Liao J et al. DNA-DISK: Automated end-to-end data storage via enzymatic single-nucleotide DNA synthesis and sequencing on digital microfluidics. Proc Natl Acad Sci USA. 2024. 121(34). e2410164121. doi: 10.1073/pnas.2410164121
45. Lu X, Li J, Li C et al. Enzymatic DNA Synthesis by Engineering Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. ACS Catalysis. 2022. 12. 2988-2997. doi: 10.1021/acscatal.1c04879
46. Mackey JK, Gilham PT. New approach to the synthesis of polyribonucleotides of defined sequence. Nature. 1971. 233(5321). 551-553. doi: 10.1038/233551a0
47. Mathews AS, Yang H, Montemagno C. Photo-cleavable nucleotides for primer free enzyme mediated DNA synthesis. Org Biomol Chem. 2016. 14(35). 8278-8288. doi: 10.1039/c6ob01371f
48. Mathews AS, Yang H, Montemagno C. 3'-O-Caged 2'-Deoxynucleoside Triphosphates for Light-Mediated, Enzyme-Catalyzed, Template-Independent DNA Synthesis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2017. 71. 13.17.1-13.17.38. doi: 10.1002/cpnc.41
49. Minhaz Ud-Dean SM. A theoretical model for template-free synthesis of long DNA sequence. Syst Synth Biol. 2008. 2(3-4). 67-73. doi: 10.1007/s11693-009-9023-x
50. Michelson AM, Todd AR. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage. Chem. Soc. 1955. 2632-2638. doi: 10.1039/JR9550002632
51. Motea EA, Berdis AJ. Terminal deoxynucleotidyl transferase: the story of a misguided DNA polymerase. Biochim Biophys Acta. 2010. 1804(5). 1151-1166. doi: 10.1016/j.bbapap.2009.06.030
52. Nikiteev I, Kuzmina J, Rog I et al. Optimization of Expression and Thermostability of Terminal Deoxynucleotidyl Transferase through Iterative Mutagenesis and Computational Design. Preprint. 2025. DOI: 10.21203/rs.3.rs-7436431/v1
53. Palluk S, Arlow DH, de Rond T et al. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nat Biotechnol. 2018. 36(7). 645-650. doi: 10.1038/nbt.4173
54. Perkel JM. The race for enzymatic DNA synthesis heats up. Nature. 2019. 566(7745). 565. doi: 10.1038/d41586-019-00682-0
55. Sachanka AB, Douhaya SS, Shchur VV et al. Enhancement of the nucleotide incorporation activity of the terminal deoxynucleotidyl transferase by N-terminal truncation and DNA-binding protein modulation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2026. 1874(1). 141114. doi: 10.1016/j.bbapap.2025.141114
56. Sachanka AB, Dzichenka YU, Shchur VV et al. Design and Characterization of the Fusion Enzyme of Bovine Terminal Deoxynucleotidyl Transferase and DNA Binding Protein Sso7d from Sulfolobus solfataricus. Chembiochem. 2025. 26(19). e202500405. doi: 10.1002/cbic.202500405
57. Sachanka A, Shchur V, Dzichenka Y et al. Design, Expression, and Purification of a Fusion Enzyme Containing Terminal Deoxynucleotidyl Transferase from bovis and DNA-Binding Proteins from E. coli. Protein Pept Lett. 2025. 32(5). 353-367. doi: 10.2174/0109298665372636250504084653
58. Schaudy E, Lietard J, Somoza MM. Sequence Preference and Initiator Promiscuity for De Novo DNA Synthesis by Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. ACS Synth Biol. 2021. 10(7). 1750-1760. doi: 10.1021/acssynbio.1c00142
59. Schmitz C, Reetz MT. Solid-phase enzymatic synthesis of oligonucleotides. Org Lett. 1(11). 1729-1731. doi: 10.1021/ol990240n
60. Smith JA, Nguyen BH, Carlson R et al. Spatially Selective Electrochemical Cleavage of a Polymerase-Nucleotide Conjugate. ACS Synth Biol. 2023. 12(6). 1716-1726. doi: 10.1021/acssynbio.3c00044
61. Tauraitė D, Jakubovska J, Dabužinskaitė J et al. Modified Nucleotides as Substrates of Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. Molecules. 2017. 22(4). 672. doi: 10.3390/molecules22040672
62. Uchiyama Y, Takeuchi R, Kodera H et al. Distribution and roles of X-family DNA polymerases in eukaryotes. Biochimie. 2009. 91(2). 165-170. doi: 10.1016/j.biochi.2008.07.005
63. Verardo D, Adelizzi B, Rodriguez-Pinzon DA et al. Multiplex enzymatic synthesis of DNA with single-base resolution. Sci Adv. 2023. 9(27). eadi0263. doi: 10.1126/sciadv.adi0263
64. Wang G, He C, Zou J et al. Enzymatic Synthesis of DNA with an Expanded Genetic Alphabet Using Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. ACS Synth Biol. 2022. 11(12). 4142-4155. doi: 10.1021/acssynbio.2c00456
65. Zhang C, Subthain H, Guo F et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications. Eng Microbiol. 2025. 5(1). 100179. doi: 10.1016/j.engmic.2024.100179