Biomics

Амплификация с помощью ПЦР так называемых «трудных» матриц, к которым относятся и нуклеотидные последовательности с высоким содержанием GC-пар, представляет определенную проблему. При этом четкой границы процентного содержания GC‑пар, позволяющей причислять ДНК-мишени к трудным матрицам, не существует. Тем не менее, таковыми можно считать те, у которых GC‑состав превышает 60%. При этом общее содержание GC‑пар в некой последовательности может быть относительно невысоким, но в ней может локально находиться участок или участки с экстремально высоким GC‑составом. Поэтому простое упоминание процентного содержания GC-пар дает лишь очень грубую характеристику мишени, поскольку немалый вклад в эффективность амплификации вносит вся нуклеотидная последовательность выбранного участка, а она для различных мишеней каждый раз разная. Ввиду того, что GC-пары формируют три водородных связи между азотистыми основаниями в отличие от AT-пар, у которых таких связей всего две, GC-богатые фрагменты ДНК после этапа денатурации в гораздо большей степени склонны к образованию прочных вторичных структур, преодолеть которые ДНК-полимераза в обычных условиях при построении новой комплементарной цепи бывает неспособна. Для амплификации GC-богатых мишеней необходимо использовать различные энхансеры ПЦР, оказывающие разное воздействие на полимеризацию цепей ДНК. Ряд энхансеров снижают температуру плавления ДНК и тем самым препятствуют образованию вторичных структур, другие вещества уменьшают влияние энхансеров на ферментативную активность ДНК-полимеразы, обеспечивая синергетический эффект. Использование модифицированных аналогов дГТФ или дЦТФ дестабилизирует GC-пары, лишая их возможности образовывать вторичные структуры. Важное значение имеют особенности термоциклирования в ПЦР в виде субциклирования на этапе отжига праймеров, а также кратковременные высокотемпературные прогревы и прочие вариации смены температур. Однако единого рецепта для проведения ПЦР с любыми GC-богатыми матрицами не существует, и чтобы достичь желаемого результата, необходимо опробовать различные энхансеры и/или их комбинации, разные ДНК-полимеразы, а также режимы термоциклирования.

ПЦР, GC-богатая мишень, энхансер, ДМСО, бетаин, глицерин, формамид, 7-дезаза-дГТФ, ДНК-полимераза

1. Гарафутдинов Р.Р., Чемерис Д.А., Сахабутдинова А.Р. Энхансеры ПЦР. II. Химические и биологические вещества. Biomics. 2025. 17(2). 157-169. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-12
2. Зубов В.В., Чемерис Д.А., Сахабутдинова А.Р. и др. Энхансеры ПЦР. III. Амплификация длинных матриц. Biomics. 2025. 17(2). 170-181. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-13
3. Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А., Гарафутдинов Р.Р. Энхансеры ПЦР. V. Наноматериалы или наноПЦР. Biomics. 2025. 17(2). 193-205. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-15
4. Сахабутдинова А.Р. Чемерис Д.А., Чемерис А.В. и др. Энхансеры ПЦР. I. Общие сведения. Biomics. 2023. 15(3). 218-223. DOI: 10.31301/2221-6197.bmcs.2023-20
5. Чемерис А.В., Чемерис Д.А., Магданов Э.Г. и др. Причины ложно-негативной ПЦР и недопущение некоторых из них. Biomics. 2012. 4(1). 31-47.
6. Чемерис Д.А., Магданов Э.Г., Машков О.И. и др. ПЦР с отложенным (горячим или задержанным) стартом. Biomics. 2011. 2(1). 1-8.
7. Agarwal RK, Perl A. PCR amplification of highly GC-rich DNA template after denaturation by NaOH. Nucleic Acids Res. 21(22). 5283-5284. doi: 10.1093/nar/21.22.5283
8. Bachmann HS, Siffert W, Frey UH. Successful amplification of extremely GC-rich promoter regions using a novel 'slowdown PCR' te Pharmacogenetics. 2003. 13(12). 759-766. doi: 10.1097/00008571-200312000-00006
9. Chakrabarti R, Schutt CE. Novel sulfoxides facilitate GC-rich template amplification. Biotechniques. 32(4). 866, 868, 870-872, 874. doi: 10.2144/02324rr04
10. Chakrabarti R, Schutt CE. The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones. Gene. 2001. 274(1-2). 293-298. doi: 10.1016/s0378-1119(01)00621-7
11. Dutton CM, Paynton C, Sommer SS. General method for amplifying regions of very high G+C content. Nucleic Acids Res. 21(12). 2953-2954. doi: 10.1093/nar/21.12.2953
12. Farell EM, Alexandre G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 2012. 5. 257. doi: 10.1186/1756-0500-5-257
13. Flores-Juárez CR, González-Jasso E, Antaramian A et al. Capacity of N4-methyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate to sustain the polymerase chain reaction using various thermostable DNA polymerases. Anal Biochem. 2013. 438(1). 73-81. doi: 10.1016/j.ab.2013.03.025
14. Flores-Juárez CR, González-Jasso E, Antaramian A et al. PCR amplification of GC-rich DNA regions using the nucleotide analog N4-methyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate. Biotechniques. 2016. 61(4). 175-182. doi: 10.2144/000114457
15. Frey UH, Bachmann HS, Peters J et al. PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR'. Nat Protoc. 3(8). 1312-1317. doi: 10.1038/nprot.2008.112
16. Garafutdinov RR, Galimova AA, Sakhabutdinova AR. Polymerase chain reaction with nearby primers. Anal Biochem. 518. 126-133. doi: 10.1016/j.ab.2016.11.017
17. Henke W, Herdel K, Jung K et al. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25(19). 3957-3958. doi: 10.1093/nar/25.19.3957
18. Horáková H, Polakovičová I, Shaik GM et al. 1,2-propanediol-trehalose mixture as a potent quantitative real-time PCR enhancer. BMC Biotechnol. 2011. 11. 41. doi: 10.1186/1472-6750-11-41
19. Hubé F, Reverdiau P, Iochmann S et al. Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences. Mol Biotechnol. 31(1). 81-84. doi: 10.1385/MB:31:1:081
20. Kang J, Lee MS, Gorenstein DG. The enhancement of PCR amplification of a random sequence DNA library by DMSO and betaine: application to in vitro combinatorial selection of aptamers. J Biochem Biophys Methods. 64(2). 147-151. doi: 10.1016/j.jbbm.2005.06.003
21. Karunanathie H, Kee PS, Ng SF et al. PCR enhancers: Types, mechanisms, and applications in long-range PCR. Biochimie. 2022. 197. 130-143. doi: 10.1016/j.biochi.2022.02.009
22. Liu Q, Sommer SS. Subcycling-PCR for multiplex long-distance amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion hotspot in the factor VIII gene. Biotechniques. 1998. 25(6). 1022-1028. doi: 10.2144/98256rr01
23. Lotte Hansen L, Justesen J. PCR Amplification of Highly GC-Rich Regions. CSH Protoc. 2006. 2006(1). pdb.prot4093. doi: 10.1101/pdb.prot4093
24. Mamedov TG, Pienaar E, Whitney SE et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Comput Biol Chem. 2008. 32(6). 452-457. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2008.07.021
25. McConlogue L, Brow MA, Innis MA. Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine. Nucleic Acids Res. 1988. 16(20). 9869. doi: 10.1093/nar/16.20.9869
26. Mousavian Z, Sadeghi HM, Sabzghabaee AM et al. Polymerase chain reaction amplification of a GC rich region by adding 1,2 propanediol. Adv Biomed Res. 2014. 3. 65. doi: 10.4103/2277-9175.125846
27. Musso M, Bocciardi R, Parodi S et al. Betaine, dimethyl sulfoxide, and 7-deaza-dGTP, a powerful mixture for amplification of GC-rich DNA sequences. J Mol Diagn. 2006. 8(5). 544-550. doi: 10.2353/jmoldx.2006.060058
28. Orpana AK, Ho TH, Stenman J. Multiple heat pulses during PCR extension enabling amplification of GC-rich sequences and reducing amplification bias. Anal Chem. 84(4). 2081-2087. doi: 10.1021/ac300040j
29. Ralser M, Querfurth R, Warnatz HJ et al. An efficient and economic enhancer mix for PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2006. 347(3). 747-751. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.06.151
30. Sahdev S, Saini S, Tiwari P et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 2007. 21(4). 303-307. doi: 10.1016/j.mcp.2007.03.004
31. Sakhabutdinova AR, Chemeris AV, Garafutdinov RR. Enhancement of PCR efficiency using mono- and disaccharides. Anal Biochem. 20 606. 113858. doi: 10.1016/j.ab.2020.113858
32. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucleic Acids Res. 1990. 18(24). 7465. doi: 10.1093/nar/18.24.7465
33. Schnoor M, Voss P, Cullen P et al. Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer. Biochem Biophys Res Commun. 2004. 322(3). 867-8 doi: 10.1016/j.bbrc.2004.07.200
34. Schuchard M, Sarkar G, Ruesink T et al. Two-step "hot" PCR amplification of GC-rich avian c-myc sequences. Biotechniques. 1993. 14(3). 390-394.
35. Seifi T, Ghaedi K, Salamian A et al. Amplification of GC-rich Putative Mouse PeP Promoter using Betaine and DMSO in Ammonium Sulfate Polymerase Chain Reaction Buffer. Avicenna J Med Biotechnol. 2012. 4(4). 206-209.
36. Shi X, Jarvis DL. A new rapid amplification of cDNA ends method for extremely guanine plus cytosine-rich genes. Anal Biochem. 2006. 356(2). 222-228. doi: 10.1016/j.ab.2006.06.028
37. Shi Y, Liu YL, Lai PY et al. Ionic liquids promote PCR amplification of DNA. Chem Commun (Camb). 48(43). 5325-5327. doi: 10.1039/c2cc31740k
38. Shore S, Paul N. Robust PCR Amplification of GC-Rich Targets with Hot Start 7-deaza-dGTP. BioTechniques. 2010. 49(5). 841-843. doi: 10.2144/000113552
39. Strien J, Sanft J, Mall G. Enhancement of PCR amplification of moderate GC-containing and highly GC-rich DNA sequences. Mol Biotechnol. 54(3). 1048-1054. doi: 10.1007/s12033-013-9660-x
40. Turner SL, Jenkins FJ. Use of deoxyinosine in PCR to improve amplification of GC-rich DNA. Biotechniques. 1995. 19(1). 48-52.
41. Varadaraj K, Skinner DM. Denaturants or cosolvents improve the specificity of PCR amplification of a G + C-rich DNA using genetically engineered DNA pol Gene. 1994. 140(1). 1-5. doi: 10.1016/0378-1119(94)90723-4
42. Wei M, Deng J, Feng K et al. Universal method facilitating the amplification of extremely GC-rich DNA fragments from genomic DNA. Anal Chem. 2010. 82(14). 6303-6307. doi: 10.1021/ac100797t
43. Xie B, Chen J, Wang Z et al. Sweet enhancers of polymerase chain reaction. PLoS One. 2024. 19(10). e0311939. doi: 10.1371/journal.pone.0311939
44. Yang Z, Yang J, Yue L et al. Enhancement Effects and Mechanism Studies of Two Bismuth-Based Materials Assisted by DMSO and Glycerol in GC-Rich PCR. Molecules. 2023. 28(11). 4515. doi: 10.3390/molecules28114515
45. Zhang Z, Kermekchiev MB, Barnes WM. Direct DNA amplification from crude clinical samples using a PCR enhancer cocktail and novel mutants of Taq. J Mol Diagn. 12(2). 152-161. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090070
46. Zhang Z, Yang X, Meng L et al. Enhanced amplification of GC-rich DNA with two organic reagents. Biotechniques. 2009. 47(3). 775-779. doi: 10.2144/000113203