Biomics

Несмотря на высокие специфичность и чувствительность ПЦР, нередки случаи, когда экспериментаторы сталкиваются с невозможностью получения результатов в удовлетворяющих их объемах и качестве ввиду слабой наработки целевых ампликонов или даже полного их отсутствия из-за ингибирования амплификации, либо, напротив, образования множественных ампликонов вместо одного ожидаемого. Причинами таких неудач являются как присутствие различных веществ, соэкстрагируемых вместе с нуклеиновыми кислотами из анализируемых образцов и являющихся ингибиторами ДНК-полимераз, так и сами нуклеотидные последовательности искомой мишени, образующие прочные вторичные структуры, преодолеть которые ДНК-полимераза бывает не в состоянии или делает это очень неэффективно. Однако для усиления работы ДНК-полимеразы и повышения специфичности отжига праймеров возможно применение химических веществ или биологических препаратов, дополнительно вносимых в реакционную смесь и получивших название ПЦР-энхансеры. При этом разные типы ПЦР-энхансеров влияют на разные компоненты реакционной смеси, или приводя к улучшению ферментативной активности фермента, или лишая ампликоны прочной вторичной структуры, либо обеспечивая высокую специфичность отжига праймеров. В данном обзоре кратко рассмотрены наиболее часто применяемые энхансеры, разделенные на группы по химическому составу и биологическому происхождению. Необходимо отметить, что проявление энхансерами активности зависит от их концентрации, нуклеотидной последовательности мишени, присутствия ингибиторов, температурного режима реакции. Фактически, для каждой мишени энхансеры и режимы термоциклирования нужно подбирать индивидуально.

ПЦР, энхансеры, ДНК-полимераза, праймер, ДМСО, формамид, бетаин, специфичность

1. Гарафутдинов Р.Р., Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А. и др. Энхансеры ПЦР. IV. Амплификация GC-богатых матриц. Biomics. 2025. 17(2). 182-192. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-14
2. Зубов В.В., Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А. и др. Энхансеры ПЦР. III. Амплификация протяженных матриц. Biomics. 2025. 17(2). 170-181. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-13
3. Игнатов К.Б., Крамаров В.М. ДНК-лигазы термофильных бактерий повышают эффективность ПЦР-амплификации длинных последовательностей ДНК. Биохимия. 2009. 74(5). 685-690.
4. Сахабутдинова А.Р., Чемерис Д.А., Гарафутдинов Р.Р. Энхансеры ПЦР. V. Наноматериалы или наноПЦР. Biomics. 2025. 17(2). 193-205. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2025-15
5. Сахабутдинова А.Р. Чемерис Д.А., Чемерис А.В. и др. Энхансеры ПЦР. I. Общие сведения. Biomics. 2023. Т.15(3). С.218-223. doi: 10.31301/2221-6197.bmcs.2023-20
6. Чемерис А.В., Магданов Э.Г., Гарафутдинов Р.Р. и др. Как исключить появление ложно-позитивных результатов при проведении полимеразной цепной реакции? Вестн. биотехнол. физ.-хим. биол. 2012. 8(3). 34-45.
7. Феофилова Е.П., Усов А.И., Мысякина И.С. и др. Трегалоза: особенности химического строения, биологические функции и практическое значение. Микробиология. 83(3). 271-283. doi: 10.7868/S0026365614020074
8. Ahokas H, Erkkilä MJ. Interference of PCR amplification by the polyamines, spermine and spermidine. PCR Methods Appl. 3(1). 65-68. doi: 10.1101/gr.3.1.65
9. Akane A, Matsubara K, Nakamura H et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci. 1994. 39(2). 362-372. doi: 10.1520/JFS13607J
10. Baskaran N, Kandpal RP, Bhargava AK et al. Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content. Genome Res 6(7). 633-638. doi: 10.1101/gr.6.7.633
11. Blüthmann H, Brück D, Hübner L et al. Reassociation of nucleic acids in solutions containing formamide. Biochem Biophys Res Commun. 1973. 50(1). 91-97. doi: 10.1016/0006-291x(73)91068-1
12. Bookstein R, Lai CC, To H et al. PCR-based detection of a polymorphic BamHI site in intron 1 of the human retinoblastoma (RB) gene. Nucleic Acids Res. 1990. 8(6). 1666. doi: 10.1093/nar/18.6.1666
13. Chakrabarti R, Schutt SE. The enhancement of PCR amplification by low molecular weight amides. Nucleic Acids Res. 2001a. 29(11). 2377-2381. doi: 10.1093/nar/29.11.2377
14. Chakrabarti R, Schutt SE. The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones. Gene. 2001b. 274(1-2). 293-298. doi: 10.1016/s0378-1119(01)00621-7
15. Chakrabarti R, Schutt SE. Novel sulfoxides facilitate GC-rich template amplifi Biotechniques. 2002. 32(4). 866 - 874. doi: 10.2144/02324rr04
16. Chang BS, Mahoney RR. Enzyme thermostabilization by bovine serum albumin and other proteins: evidence for hydrophobic interactions. Biotechnol Appl Biochem. 1995. 22(2). 203-214. doi: 10.1111/j.1470-8744.1995.tb00346
17. Chester N, Marshak DR. Dimethyl sulfoxide-mediated primer Tm reduction: a method for analyzing the role of renaturation temperature in the polymerase chain reaction. Anal Biochem. 1993. 209(2). 284-290. doi: 10.1006/abio.1993.1121
18. Chevet E, Lemaître G, Katinka MD. Low concentrations of tetramethylammonium chloride increase yield and specificity of PCR. Nucleic Acids Res. 1995. 23(16). 3343-3344. doi: 10.1093/nar/23.16.3343.
19. Dabrowski S, Olszewski M, Piatek R et al. Novel thermostable ssDNA-binding proteins from Thermus thermophilus and aquaticus-expression and purification. Protein Expr Purif. 2002. 26(1). 131-138. doi: 10.1016/s1046-5928(02)00504-1
20. Demeke T, Adams RP. The effects of plant polysaccharides and buffer additives on PCR. Biotechniques. 1992. 12(3). 332-334.
21. Farell EM, Alexandre G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 2012. 5. 257. doi: 10.1186/1756-0500-5-257
22. Flores-Juárez CR, González-Jasso E, Antaramian A et al. Capacity of N4-methyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate to sustain the polymerase chain reaction using various thermostable DNA polymerases. Anal Biochem. 2013. 438(1). 73-81. doi: 10.1016/j.ab.2013.03.025
23. Fuller CW. Cycle sequencing with non-thermostable DNA polymerase. US Patent 5,432,065, Jul. 11, 1995
24. Hengen PN. Optimizing multiplex and LA-PCR with betaine. Trends Biochem Sci. 1997. 22(6). 225-226. doi: 10.1016/s0968-0004(97)01069-4
25. Henke W, Herdel K, Jung K et al. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 1997. 25(19). 3957-3958. doi: 10.1093/nar/25.19.3957
26. Hogrefe HH, Borns MC. Long-range PCR with a DNA polymerase fusion. Methods Mol Biol. 2011. 687. 17-23. doi: 10.1007/978-1-60761-944-4_2
27. Horáková H, Polakovičová I, Shaik GM et al. 1,2-propanediol-trehalose mixture as a potent quantitative real-time PCR enhancer. BMC Biotechnol. 2011. 11. 41. doi: 10.1186/1472-6750-11-41
28. Hung T, Mak K, Fong K. A specificity enhancer for polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1990. 18(16). 4953. doi: 10.1093/nar/18.16.4953
29. Iakobashvili R, Lapidot A. Low temperature cycled PCR protocol for Klenow fragment of DNA polymerase I in the presence of proline. Nucleic Acids Res. 1999. 27(6). 1566–1568. doi: 10.1093/nar/27.6.1566
30. Kovárová M, Dráber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res. 2000. 28(13). E70. doi: 10.1093/nar/28.13.e70
31. Lippert K, Galinski EA. Enzyme stabilization be ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying. Appl Microbiol Biotechnol. 1992. 37. 61–65. doi: 10.1007/BF00174204
32. Louwrier A, van der Valk A. Can sucrose affect polymerase chain reaction product formation?. Biotechnology Letters. 23. 175–178. doi: 10.1023/A:1005656100993
33. Lu YH, Nègre S. Use of glycerol for enhanced efficiency and specificity of PCR amplification. Trends Genet. 1993. 9(9). 297. doi: 10.1016/0168-9525(93)90238-d
34. McConaughy BL, Laird CD, McCarthy BJ. Nucleic acid reassociation in formamide. Biochemistry. 1969. 8(8). 3289-3295. doi: 10.1021/bi00836a024
35. McConlogue L, Brow MA, Innis MA. Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2’-deoxyguanosine. Nucleic Acids Res. 1988. 16(20). 9869. doi: 10.1093/nar/16.20.9869
36. Melchior WB Jr, Von Hippel PH. Alteration of the relative stability of dA-dT and dG-dC base pairs in DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1973. 70(2). 298-302. doi: 10.1073/pnas.70.2.298
37. Mousavian Z, Sadeghi HM, Sabzghabaee AM et al. Polymerase chain reaction amplification of a GC rich region by adding 1,2 propanediol. Adv Biomed Res. 2014. 3. 65. doi: 10.4103/2277-9175.125846
38. Musielski H, Mann W, Laue R et al. Influence of dimethylsulfoxide on transcription by bacteriophage T3-induced RNA polymerase. Z Allg Mikrobiol. 1981. 21(6). 447-456. doi: 10.1002/jobm.3630210606
39. Musso M, Bocciardi R, Parodi S et al. Betaine, dimethyl sulfoxide, and 7-deaza-dGTP, a powerful mixture for amplification of GC-rich DNA sequences. J Mol Diagn. 2006. 8(5). 544-550. doi: 10.2353/jmoldx.2006.060058
40. Nagai M, Yoshida A, Sato N. Additive effects of bovine serum albumin, dithiothreitol, and glycerol on PCR. Mol. Biol. Int. 1998. 44(1). 157-163. doi: 10.1080/15216549800201172
41. Oda Y, Uesugi S, Ikehara M et al. NMR studies for identification of dI:dG mismatch base-pairing structure in DNA. Nucleic Acids Res. 1991. 19(19). 5263-5267. doi: 10.1093/nar/19.19.5263
42. Oscorbin IP, Boyarskikh UA, Zakabunin AI et al. DNA-Binding Domain of DNA Ligase from the Thermophilic Archaeon Pyrococcus abyssi: Improving Long-Range PCR and Neutralization of Heparin's Inhibitory Effect. Appl Biochem Biotechnol. 2015. 176(7). 1859-1869. doi: 10.1007/s12010-015-1683-2
43. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucleic Acids Res. 1988. 16(20). 9775-9787. doi: 10.1093/nar/16.20.9775
44. Panaccio M, Lew A. PCR based diagnosis in the presence of 8% (v/v) blood. Nucleic Acids Res. 1991. 19(5). 1151. doi: 10.1093/nar/19.5.1151
45. Perales C, Cava F, Meijer WJ. et al. Enhancement of DNA, cDNA Synthesis and Fidelity at High Temperatures by a Dimeric Single-Stranded DNA-Binding Protein. Nucleic Acids Res. 2003. 31(22). 6473–6480. doi: 10.1093/nar/gkg865
46. Ralser M, Querfurth R, Warnatz HJ et al. An efficient and economic enhancer mix for PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2006. 347(3). 747-751. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.06.151
47. Rees WA, Yager TD, Korte J et al. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry. 1993. 32(1). 137-144. doi: 10.1021/bi00052a019
48. Ribble W, Kane SD, Bullard JM. Long-Range PCR Amplification of DNA by DNA Polymerase III Holoenzyme from Thermus thermophilus. Enzyme Res. 2015. 2015. 837842. doi: 10.1155/2015/837842
49. Sahdev S, Saini S, Tiwari P et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes 21(4). 303-307. doi: 10.1016/j.mcp.2007.03.004
50. Sakhabutdinova AR, Chemeris AV, Garafutdinov RR. Enhancement of PCR efficiency using mono- and disaccharides. Anal Biochem. 2020. 606. 113858. doi: 10.1016/j.ab.2020.113858
51. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucleic Acids Res. 1990. 18(24). 7465. doi: 10.1093/nar/18.24.7465
52. Scharf SJ, Horn GT, Erlich HA. Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science. 1986. 233(4768). 1076-1078. doi: 10.1126/science.3461561
53. Schnoor M, Voss P, Cullen P et al. Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer. Biochem Biophys Res Commun. 2004. 322(3). 867-872. doi: 10.1016/j.bbrc.2004.07.200
54. Schwarz K, Hansen-Hagge T, Bartram C. Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res. 1990. 18(4). 1079. doi: 10.1093/nar/18.4.1079
55. Shaik GM, Draberova L, Draber P et al. Tetraalkylammonium derivatives as real-time PCR enhancers and stabilizers of the qPCR mixtures containing SYBR Green I. Nucleic Acids Res 36(15). e93. doi: 10.1093/nar/gkn421
56. Shi Y, Liu YL, Lai PY et al. Ionic liquids promote PCR amplification of DNA. Chem Commun (Camb). 48(43). 5325-5327. doi: 10.1039/c2cc31740k
57. Sidhu MK, Liao MJ, Rashidbaigi A. Dimethyl sulfoxide improves RNA amplifi Biotechniques. 1996. 21(1). 44-47. doi: 10.2144/96211bm08
58. Śpibida M, Krawczyk B, Zalewska-Piątek B et al. Fusion of DNA-binding domain of Pyrococcus furiosus ligase with TaqStoffel DNA polymerase as a useful tool in PCR with difficult targets. Appl Microbiol Biotechnol. 2018. 102(2). 713-721. doi: 10.1007/s00253-017-8560-6
59. Spiess AN, Mueller N, Ivell R. Trehalose is a potent PCR enhancer: lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by the disaccharide trehalose. Chem. 2004. 50(7). 1256-1259. doi: 10.1373/clinchem.2004.031336
60. Turner SL, Jenkins FJ. Use of deoxyinosine in PCR to improve amplification of GC-rich DNA. Biotechniques. 1995. 19(1). 48-52.
61. Varadaraj K, Skinner DM. Denaturants or co-solvents improve the specificity of PCR amplification of a GC-rich DNA using genetically engineered DNA polymerases. Gene. 1994. 140(1). 1–5. doi: 10.1016/0378-1119(94)90723-4
62. Vilcek S. Detection of the bovine herpesvirus-1 (BHV-1) genome by PCR. J Virol Methods. 1993. 41(2). 245-247. doi: 10.1016/0166-0934(93)90132-b
63. Weissensteiner T, Lanchbury JS. Strategy for controlling preferential amplification and avoiding false negatives in PCR typing. Biotechniques. 1996. 21(6). 1102-1108. doi: 10.2144/96216rr03
64. Yang Z, Yang J, Yue L et al. Enhancement Effects and Mechanism Studies of Two Bismuth-Based Materials Assisted by DMSO and Glycerol in GC-Rich PCR. Molecules. 2023. 28(11). 4515. doi: 10.3390/molecules28114515
65. Zhang L, Liang Y, Meng L et al. Preparation and PCR-amplification properties of a novel amphiphilic poly(N-vinylpyrrolidone) (PVP) copolymer. Chem Biodivers. 2007. 4(2). 163-174. doi: 10.1002/cbdv.200790021
66. Zhang Y, Li X, Zou R et al. Bovine thrombin enhances the efficiency and specificity of polymerase chain reaction. Biotechniques. 2014. 57(6). 289-294. doi: 10.2144/000114237
67. Zhang Z, Kermekchiev M, Barnes W. Direct DNA amplification from crude clinical samples using a PCR enhancer cocktail and novel mutants of Taq. J Molecular Diagnostics. 2010. 12(2). 152-161. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090070
68. Zhang Z, Yang X, Meng L et al. Enhanced amplification of GC-rich DNA with two organic reagents. Biotechniques. 2009. 47(3). 775-779. doi: 10.2144/000113203