Том 17, № 2

Несмотря на кажущуюся простоту ПЦР с двумя праймерами, экспериментаторы нередко сталкиваются с тем, что даже хорошо подобранные праймеры не обеспечивают получение желаемого результата. Это может происходить в силу множества причин. Одной из них является амплификация так называемых «трудных» матриц, к которым относятся ДНК-мишени с высоким GC-составом, обусловливающим образование прочных вторичных структур, которые ДНК-полимераза не всегда способна преодолеть, а также чрезмерно протяженные ДНК-мишени, с которых ДНК-полимераза не способна синтезировать ампликоны в случае ее низкой процессивности. Помимо перечисленных, иногда имеет место ингибирование ДНК-полимеразы из-за присутствующих в реакционной смеси веществ, обычно вносимых вместе с анализируемым препаратом ДНК, мешающих полноценной работе фермента. Для преодоления этих трудностей в реакционную смесь добавляют дополнительные компоненты, или ПЦР-энхансеры. Таковыми могут выступать различные наноматериалы и нанокомпозитные субстанции, использование которых привело к появлению так называемой наноПЦР. Наиболее популярными добавками служат наночастицы золота, в том числе покрытые различными соединениями, меняющими их поверхностный заряд. Довольно широкое применение в наноПЦР находят наночастицы некоторых других металлов, их оксидов и сульфидов. Также используются материалы на основе углерода: графен, оксид графена, восстановленный оксид графена, алмазные наночастицы, углеродные нанотрубки, углеродный нанопорошок. Были попытки применения и фуллерена, но он лишь ингибировал реакцию. Помимо этих наноструктурированных соединений нередко применяются квантовые точки разного диаметра и состава. Механизмы действия разных наноматериалов в наноПЦР отличаются, но можно выделить ключевые: сорбция на поверхности наночастиц ДНК, праймеров и ДНК-полимеразы, а также увеличение теплопроводности раствора. При этом лишь незначительное превышение оптимальных концентраций таких энхансеров способно приводить к ингибированию амплификации.

Амплификация с помощью ПЦР так называемых «трудных» матриц, к которым относятся и нуклеотидные последовательности с высоким содержанием GC-пар, представляет определенную проблему. При этом четкой границы процентного содержания GC‑пар, позволяющей причислять ДНК-мишени к трудным матрицам, не существует. Тем не менее, таковыми можно считать те, у которых GC‑состав превышает 60%. При этом общее содержание GC‑пар в некой последовательности может быть относительно невысоким, но в ней может локально находиться участок или участки с экстремально высоким GC‑составом. Поэтому простое упоминание процентного содержания GC-пар дает лишь очень грубую характеристику мишени, поскольку немалый вклад в эффективность амплификации вносит вся нуклеотидная последовательность выбранного участка, а она для различных мишеней каждый раз разная. Ввиду того, что GC-пары формируют три водородных связи между азотистыми основаниями в отличие от AT-пар, у которых таких связей всего две, GC-богатые фрагменты ДНК после этапа денатурации в гораздо большей степени склонны к образованию прочных вторичных структур, преодолеть которые ДНК-полимераза в обычных условиях при построении новой комплементарной цепи бывает неспособна. Для амплификации GC-богатых мишеней необходимо использовать различные энхансеры ПЦР, оказывающие разное воздействие на полимеризацию цепей ДНК. Ряд энхансеров снижают температуру плавления ДНК и тем самым препятствуют образованию вторичных структур, другие вещества уменьшают влияние энхансеров на ферментативную активность ДНК-полимеразы, обеспечивая синергетический эффект. Использование модифицированных аналогов дГТФ или дЦТФ дестабилизирует GC-пары, лишая их возможности образовывать вторичные структуры. Важное значение имеют особенности термоциклирования в ПЦР в виде субциклирования на этапе отжига праймеров, а также кратковременные высокотемпературные прогревы и прочие вариации смены температур. Однако единого рецепта для проведения ПЦР с любыми GC-богатыми матрицами не существует, и чтобы достичь желаемого результата, необходимо опробовать различные энхансеры и/или их комбинации, разные ДНК-полимеразы, а также режимы термоциклирования.

Периодически у экспериментаторов возникает необходимость наработки с помощью ПЦР довольно протяженных ампликонов, что не всегда удается осуществить в стандартных условиях. В таких случаях проводится так называемая "дальнобойная" ПЦР, особенностями которой являются увеличенное время этапа элонгации из расчета не менее 1 мин для 1 т.п.н. матрицы, смесь высокопроцессивной ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы с редактирующей активностью, позволяющей удалять неверно вставленные нуклеотиды, способные прервать дальнейшую полимеризацию, а также использование дополнительных компонентов в реакционной смеси, являющихся энхансерами ПЦР. В качестве таких энхансеров при амплификации протяженных матриц выступают различные вещества химической или биологической природы. Несмотря на то, что приоритеты для проведения "дальнобойной" ПЦР с течением времени несколько изменились в виду в первую очередь бурного развития высокопроизводительного секвенирования ДНК последних поколений и появления благодаря им возможности длинных и ультрадлинных прочтений, тем не менее, востребованность в амплификации протяженных фрагментов ДНК остается и даже расширяется спектр их применения, в том числе не только для биологических задач.

Несмотря на высокие специфичность и чувствительность ПЦР, нередки случаи, когда экспериментаторы сталкиваются с невозможностью получения результатов в удовлетворяющих их объемах и качестве ввиду слабой наработки целевых ампликонов или даже полного их отсутствия из-за ингибирования амплификации, либо, напротив, образования множественных ампликонов вместо одного ожидаемого. Причинами таких неудач являются как присутствие различных веществ, соэкстрагируемых вместе с нуклеиновыми кислотами из анализируемых образцов и являющихся ингибиторами ДНК-полимераз, так и сами нуклеотидные последовательности искомой мишени, образующие прочные вторичные структуры, преодолеть которые ДНК-полимераза бывает не в состоянии или делает это очень неэффективно. Однако для усиления работы ДНК-полимеразы и повышения специфичности отжига праймеров возможно применение химических веществ или биологических препаратов, дополнительно вносимых в реакционную смесь и получивших название ПЦР-энхансеры. При этом разные типы ПЦР-энхансеров влияют на разные компоненты реакционной смеси, или приводя к улучшению ферментативной активности фермента, или лишая ампликоны прочной вторичной структуры, либо обеспечивая высокую специфичность отжига праймеров. В данном обзоре кратко рассмотрены наиболее часто применяемые энхансеры, разделенные на группы по химическому составу и биологическому происхождению. Необходимо отметить, что проявление энхансерами активности зависит от их концентрации, нуклеотидной последовательности мишени, присутствия ингибиторов, температурного режима реакции. Фактически, для каждой мишени энхансеры и режимы термоциклирования нужно подбирать индивидуально.

ДНК известна уже более 150 лет, и за это время разработано множество методов выделения данного биополимера из разных источников. При этом подавляющее большинство методов выделения ДНК предполагает ее осаждение из водно-солевых растворов, в которых ДНК окружена полярными молекулами воды, положительно заряженная часть диполя которых взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК, способствуя ее растворимости. Наиболее часто используемыми осадителями ДНК служат этанол и изопропанол, которые не взаимодействуют с полярными группами нуклеиновых кислот так же сильно, как вода, что вкупе с частичной нейтрализацией заряда солями ведет к снижению растворимости ДНК и ее преципитации. Поскольку ДНК за счет остатков фосфорной кислоты является полианионом, то нейтрализация ее заряда с помощью поликатионов, которыми служат различные соединения, среди которых спермидин, спермин, хлорид гексаамминкобальта, полиэтиленимин и другие, ведет к компактизации и агрегации ДНК, приводя к осаждению. Аналогичные процессы, ведущие к снижению растворимости ДНК, вплоть до образования осадка, вызываются такими соединениями как высокомолекулярные полиэтиленгликоль, поливинипирролидон, фиколл. Причем неспиртовое осаждение / переосаждение ДНК весьма востребовано в случаях, когда необходимо сменить буфер или избавиться от ингредиентов предыдущей ферментативной реакции, но добавление спирта не может быть произведено. Показателем чистоты выделенных препаратов долгое время служило определение фосфора, содержание которого в идеальном случае должно составлять 9.3%. Позже для определения чистоты выделенной ДНК в обиход вошло измерение оптической плотности и показателей A260/A280 и A260/A230, свидетельствующих о степени загрязнения препаратов белками и полисахаридами, соответственно. В последней четверти прошлого столетия возникла необходимость контролировать с помощью гель-электрофореза размер выделяемой ДНК. При этом важен не только максимальный размер, но и гомогенность препарата ДНК, подразумевающая отсутствие в нем множества коротких фрагментов, которые могут мешать проведению некоторых экспериментов, включая методы мономолекулярного секвенирования ДНК, рассчитанные на длинные и ультрадлинные прочтения. И в таких случаях возможно фракционирование молекул ДНК по размеру путем простого их переосаждения под действием агентов неспиртовой природы, добиваясь первоочередного осаждения высокомолекулярной ДНК.

We report the isolation and characterization of Rhodopseudomonas sp. RCAM05734 from the upper horizon of Holocene permafrost on the southern shore of Isfjorden, Svalbard. The strain was recovered on R2A at 5°C and sequenced using Oxford Nanopore long reads; assembly produced a single circular chromosome of 6.65 Mb (GC 63.9%) encoding 6,183 predicted proteins and 65 RNA genes (GenBank CP199742; SRA SRS26238712). Although the 16S rRNA gene shows high similarity (98%) to several Rhodopseudomonas type strains, average nucleotide identity values (78–80%) indicate that RCAM05734 is genomically distinct and may represent a novel species. The genome contains three fix loci and an almost complete nif gene complement, consistent with potential for nitrogen fixation under microaerobic conditions. Genes implicated in plant‑associated functions (acdS/acdR, iaaM/iaaH), multiple cold‑shock proteins, and accessory nod regulatory loci were also identified. RCAM05734 encodes extensive aromatic‑compound catabolic pathways, including both catechol and protocatechuate branches of the β‑ketoadipate pathway and meta‑cleavage enzymes. Phenotypic profiling (Biolog GEN III) revealed utilization of diverse mono‑ and disaccharides and selected carboxylic acids, limited halotolerance (growth at 1% NaCl) and activity at mildly acidic pH. Collectively, genomic and physiological data suggest that RCAM05734 harbors metabolic versatility relevant to carbon and nitrogen turnover, stress tolerance, and potential plant‑growth promotion in cold Arctic conditions.

Статья посвящена разработке первого российского прибора для массового параллельного секвенирования ДНК Нанофор СПС. Прибор задумывался как отечественная альтернатива наиболее распространенного на мировом рынке секвенатора MiSeq, производства американской компании Illumina, имеющего производительность достаточную для расшифровки полных геномов малых организмов – бактерий, вирусов, грибов, а также для проведения расшифровки большого количества образцов по интересующим исследователей группам генов. Такая универсальность при одновременно невысокой (по сравнению с истинно полногеномными высокопроизводительными секвенаторами) стоимости запуска обусловили большую популярность приборам MiSeq. В основе принципа функционирования приборов Нанофор СПС и MiSeq лежит технология секвенирования путем синтеза с детекцией сигнала флуоресценции, базовые элементы которой разработаны советскими и российскими учеными в 90-х годах прошлого века.