Том 16, №2

Рассмотрены принцип и особенности мультиплексной ПЦР, акцентировано внимание на преимуществах этого варианта реакции: снижении временных, финансовых и трудозатрат при массовых анализах, а также возможности анализа малого количества генетического материала. Отмечено, что качественно подобранные праймеры являются главным фактором, обеспечивающим специфичность мультиплексной ПЦР, однако и прочие компоненты реакционной смеси должны быть оптимизированы. Продемонстрировано отличие мультиплексной ПЦР от мультиматричной ПЦР. Приведены данные о способах повышения эффективности мультиплексной ПЦР, среди которых особое место занимают «горячий старт» и измененные протоколы термоциклирования. Уделено внимание истории появления мультиплексной ПЦР и используемой терминологии.

Вложенная полимеразная цепная реакция (влПЦР) представляет собой двухстадийную ПЦР, в которой в первом раунде используется внешняя пара праймеров, ведущая к образованию ампликона, содержащего места отжига для внутренней пары праймеров. Эти внутренние праймеры, в свою очередь, образуют ампликон меньшего размера. Существует также вариант полувложенной ПЦР (пвлПЦР), при котором во втором раунде используется один внутренний праймер в паре с одним из внешних. Вложенная ПЦР в первую очередь предназначена для повышения чувствительности реакции за счет увеличения числа копий целевой последовательности в первом раунде для их использования во втором. Кроме того, она обеспечивает специфичность амплификации и отжига праймеров. Внутренние праймеры отжигаются на ампликоне первого раунда, подтверждая правильность отжига внешних праймеров. Существуют различные методы разделения реакционной смеси первого раунда от внутренних праймеров перед вторым раундом амплификации, которые подробно описаны в этом обзоре. Описаны различные вариации влПЦР и практическое применение этого подхода для амплификации целевых последовательностей и анализа ампликонов, включая выявление полиморфизмов ДНК. Отмечено использование вложенной ПЦР для решения задач небиологического характера.

У льна Linum usitatissimum L. in silico идентифицированы ортологи β-1,3-глюканаз (BG) Arabidopsis thaliana L. Им соответствовали 57 последовательностей, сгруппированные в 27 ортологичных групп. Для 22 основных ортологов, проявляющих изменение экспрессии на уровне генов во время развития волокна (индивидуальной клетки) в норме (разные стадии), предсказаны белковые домены, характерные для β-1,3-глюканаз и проведен анализ временных (8 ч, 24 ч, 96 ч после наклона стебля) и пространственных (верхняя (PUL) и нижняя (OPP) стороны стебля растения) профилей экспрессии при гравиответе. Большинство анализируемых BG проявляли максимум экспрессии в апикальной меристеме. В ответ на гравистимуляцию изменение экспрессии выявлено у генов 11 BG. Из них 7 генов проявляли повышение экспрессии в волокнах обеих сторон стебля (Lus10015151, Lus10040461, Lus10033244), PUL-стороны (Lus10019801, Lus10039095 и Lus10032562) и OPP-стороны (Lus10024535). Понижение экспрессии при гравиответе выявилось у генов Lus10011482, Lus10002295, Lus10043075 и Lus10038099. При этом для Lus10011482 и Lus10043075 активность была обнаружена на обеих сторонах стебля через 8, 24 и 96ч после наклона растений. При гравиответе значение экспрессии генов основных ортологов изменялось в сторону более молодой стадии развития волокна и часто подтверждалось изменением экспрессии всех генов соответствующей ортологичной группы. Предполагается локализация соответствующих β-1,3-глюканаз в клеточной стенке и ее модификация для проявления «мускульных» функций волокон. Данное исследование обеспечивает основу для выяснения функциональных характеристик β-1,3-глюканаз в процессе развития волокна и при гравиответе.

Pseudomonas spр. обладают большим потенциалом как ризосферные бактерии, стимулирующие рост растений (PGPR), а также имеющие микостатическую активностью по отношению к фитопатогенным грибам, поэтому данный вид микроорганизмов представляет собой большой интерес для создания биопрепаратов с высокой эффективностью для разных видов растений. Целью данной работы было исследование штаммов Pseudomonas sp. с фунгистатической активностью сохранять способность к подавлению роста фитопатогенных штаммов грибов Microdochium nivale ВКМ 3106, Fusarium graminearum ВКМ 1668, F. culmorum ВКМ 844 и Bipolaris sorokiniana после длительной заморозки. В результате штамм P. chlororaphis Елена показал ингибирование Microdochium nivale ВКМ 3106 на 41,87 %, P. chlororaphis ВКПМ В-9444 на 35,93 %, F. culmorum ВКМ 844 на 78,68 и 72,66 %, соответственно, F. graminearum ВКМ 1668 на 47,31 и 33,39 %, соответственно, B. sorokiniana на 86,6 и 78,15 %, соответственно. Таким образом, штамм Елена показал хорошую антагонистическую активность даже после долгой глубокой заморозки, штамм В-9444 немного уступал по своим показателям.

В статье рассмотрена проблема поиска ассоциаций аллельных вариантов микросателлитных локусов с содержанием протеина в семенах гороха. Среди всех зернобобовых культур, отличающихся высокобелковостью, горох является наиболее адаптивной культурой к условиям Предуральской степной зоны Республики Башкортостан. Его возделывание является перспективным на данной территории. Для выявления аллельных вариантов, которые могут быть использованы в будущем в качестве ДНК-маркеров высокого содержания запасных белков семян (легумина, вицилина, конвицилина) было проведено генотипирование сортов и линий гороха посевного различного экололого-географического происхождения. По методу Бредфорд было определено содержание общего белка в исследуемых сортообразцах данной культуры, и выявлены сортообразцы, контрастно различающиеся по данному признаку. Были сформированы две группы образцов с высоким (23,5±0,4 – 26,1±0,5%) и низким (18,0±0,3 – 19,7±0,3%) содержанием белка. Затем было проведено генотипирование вышеперечисленных групп методом SSR-анализа. В результате примененной методики была получена информация об аллельном составе сортообразцов с высоким и низким содержанием запасных белков семян. Полученные данные планируется использовать в качестве дополнительных критериев при отборе родительских форм в скрещиваниях для получения высокобелковых гибридов.

Три десятилетия назад, в ноябре 1994 г., вышла эпохальная статья Л.Адлемана, посвященная молекулярным вычислениям с помощью синтетических фрагментов ДНК, которой он пробудил дремавший у ряда исследователей интерес к небиологическому применению данного биополимера. Адлеман с использованием набора олигонуклеотидов путем их лигирования Т4 ДНК-лигазой и некоторых других молекулярно-биологических операций «нашел» путь в Гамильтоновом графе из семи вершин, им самим проложенный. И это был модельный эксперимент, показавший принципиальную возможность вести ДНК-вычисления на основе Булевой алгебры с помощью молекул ДНК и решать сверхтяжелые задачи с нечеткой логикой, характеризующиеся сложностью O(N!), в полиномиальное время, что часто невозможно для классических электронных компьютеров. Однако за той его статьей последовала отчасти справедливая мощная критика, сводившаяся к необходимости обращения с огромным количеством ДНК, превышающим для ряда задач, по некоторым подсчетам, вес нашей Планеты. Тем не менее, толчок развитию ДНК-вычислений был дан, и за прошедшее время опубликовано огромное количество работ, в которых описано множество иных подходов. Среди них появились принципиально новые, которые позволяют оперировать молекулами ДНК, присваивая нуклеотидным последовательностям компьютерные «0» и «1» и используя их как логические ДНК-вентили с образованием из них целых каскадов, а также просто кодируя олигонуклеотидами некие условия и формируя сложные наноконструкции, пригодные для молекулярных вычислений. В данном обзоре кратко рассмотрены особенности уникальнейшего природного биополимера, коим является ДНК, дающие возможность использовать его для молекулярных вычислений, основанных на различных принципах. Однако следует признать, что первые весьма оптимистичные ожидания от ДНК-вычислений пока так и не оправдались, хотя заметный прогресс в молекулярно-биологических технологиях в последние годы позволяет надеяться на дальнейшее совершенствование ДНК-вычислений и достижения возможности для них занять свою нишу, в том числе реализоваться в виде работающих ДНК-компьютеров. Уделено также некоторое внимание и их конкурентам в виде основанных на различных физических принципах квантовых компьютеров, которые не исключено, что в будущем смогут использовать для ведения вычислений и молекулы ДНК в виде их неприродных аналогов, несущих нужные модификации для обеспечения квантовой запутанности и квантового превосходства.