Biomics

Известно, что EDS1 белок арабидопсиса контролирует активацию защиты и программируемую клеточную смерть, обусловленную межклеточными Toll-подобными иммунными рецепторами, которые узнают специфические эффекторы патогена. К сожалению, вовлеченность EDS1 белка в антифитовирусный иммунитет растений картофеля не изучена. В ходе исследований осуществлен подбор геномных мишеней для введения мутаций (последовательности 20 п.н.) в ортолог гена LOC102598075 EDS1-подобного белка. Выполнен дизайн гРНК. Для минимизации вариантов ложно-целевых мутаций были использованы он-лайн биоинформатические ресурсы, такие как CRISPR DESIGN TOOLS, CRISPR GE, CRISPROR, CHOP-CHOP 2.0. Выполнена сборка Cas9/sgRNA экспрессионных кассет на основе вектора pBAtC с увеличенной специфичностью Cas9 мутирования ортолога гена EDS1-подобного белка. Для лучшей трансформации картофеля в векторе pBAtC промотор арабидопсиса был заменен на собственный промотор pStU6-6 размером 323 п.н.. На основе модифицированного вектора был получен экспрессионный вектор с клонированной по сайту AarI мишенью размером 20 п.н. Валидацию присутствия в векторе pSt6-6 промотора размером 323 п.н. и фрагмента гена Basta размером 424 п.н. осуществляли методом ПЦР. Наличие нужной вставки подтверждено секвенированием. Созданный вектор будет использован для биобаллистической трансформации растений картофеля in vitro.

CRISPR, геномное редактирование, EDS1 белок, вектор pBAtC, секвенирование ДНК

1. Геращенков Г.А, Рожнова Н.А, Кулуев Б.Р., Кирьянова О.Ю., Гумерова Г.Р., Князев А.В., Вершинина З.Р., Михайлова Е.В., Чемерис Д.А., Матниязов Р.Т., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.М., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Дизайн РНК-гидов для CRISPR/CAS редактирования геномов растений // Молекулярная биология. 2020. Т.54(1). С. DOI:10.1134/S0026898420010061 

2. Макарова С.С., Макаров В.В., Тальянский М.Э., Калинина Н.О. Устойчивость картофеля к вирусам: современное состояние и перспективы // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(1):62-73. DOI10.18699/VJ17.224 

3. Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Геращенков Г.А., Кулуев Б.Р., Рожнова Н.А., Матниязов Р.Т., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Биоинформатические ресурсы для CRISPR/Cas редактирования геномов // Биомика. 2017. Т.9(3). С. 202-226.

4. Gantner J., Ordon J., Kretschmer C., Guerois R., Stuttmann J. An EDS1-SAG101 Complex is Essential for TNL-mediated Immunity in Nicotiana benthamiana // Plant Cell. 2019. Vol. 31. p. 2456–2474. DOI:https://doi.org/10.1105/tpc.19.00099 

5. Green, M. and Sambrook, J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Vol. II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

6. Kim H, Kim ST, Ryu J, Choi MK, Kweon J, Kang BC, Ahn HM, Bae S, Kim JS, Kim SG. A simple, flexible and high-throughput cloning system for plant genome editing via CRISPR-Cas system // J Integr Plant Biol. 2016. V.58(8). P.705-712. doi:10.1111/jipb.12474.10.1111/jipb.12474

7. Peart J.R., Cook G., Feys B.J., Parker J.E., Baulcombe D.C. An EDS1 orthologue is required for N-mediated resistance against tobacco mosaic virus // Plant J. 2002 Mar;29(5):569-79.

8. Rogers E.E., Ausubel F.M. Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants exhibit enhanced susceptibility to several bacterial pathogens and alterations in PR-1 gene expression // Plant Cell. 1997 Mar;9(3):305-16. DOI:10.1105/tpc.9.3.305 

9. Soosaar J.L., Burch-Smith T.M., Dinesh-Kumar S.P. Mechanisms of plant resistance to viruses // Nat Rev Microbiol. 2005 Oct;3(10):789-98. DOI:10.1038/nrmicro1239