Создание экспрессионного вектора для геномного редактирования гена EDS1

Известно, что EDS1 белок арабидопсиса контролирует активацию защиты и программируемую клеточную смерть, обусловленную межклеточными Toll-подобными иммунными рецепторами, которые узнают специфические эффекторы патогена. К сожалению, вовлеченность EDS1 белка в антифитовирусный иммунитет растений картофеля не изучена. В ходе исследований осуществлен подбор геномных мишеней для введения мутаций (последовательности 20 п.н.) в ортолог гена LOC102598075 EDS1-подобного белка. Выполнен дизайн гРНК. Для минимизации вариантов ложно-целевых мутаций были использованы он-лайн биоинформатические ресурсы, такие как CRISPR DESIGN TOOLS, CRISPR GE, CRISPROR, CHOP-CHOP 2.0. Выполнена сборка Cas9/sgRNA экспрессионных кассет на основе вектора pBAtC с увеличенной специфичностью Cas9 мутирования ортолога гена EDS1-подобного белка. Для лучшей трансформации картофеля в векторе pBAtC промотор арабидопсиса был заменен на собственный промотор pStU6-6 размером 323 п.н.. На основе модифицированного вектора был получен экспрессионный вектор с клонированной по сайту AarI мишенью размером 20 п.н. Валидацию присутствия в векторе pSt6-6 промотора размером 323 п.н. и фрагмента гена Basta размером 424 п.н. осуществляли методом ПЦР. Наличие нужной вставки подтверждено секвенированием. Созданный вектор будет использован для биобаллистической трансформации растений картофеля in vitro.