ЛЕКТИН КОЗЛЯТНИКА ВОСТОЧНОГО КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ АССОЦИАЦИЙ МЕЖДУ КУЛЬТУРНЫМИ РАСТЕНИЯМИ И ПОЛЕЗНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Авторы:
Чубукова О.В. , Баймиев Ан.Х. , Вершинина З.Р. , Баймиев Ал.Х.
Название:
ЛЕКТИН КОЗЛЯТНИКА ВОСТОЧНОГО КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ АССОЦИАЦИЙ МЕЖДУ КУЛЬТУРНЫМИ РАСТЕНИЯМИ И ПОЛЕЗНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Страницы:
400-409
скачано
7 раз(а)


Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген GORL лектина козлятника восточного Galega orientalis под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Исследование адгезии на корнях данных растений флуоресцентно меченых бактерий Rhizobium galegae (микросимбионтов козлятника восточного) показало, что на корнях табаков, трансгенных по гену лектина GORL сорбировалось в 4 раза больше бактерий R. galegae, по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями. Полученные результаты свидетельствуют об участии лектина GORL в прикреплении бактерий к поверхности корней трансгенных растений, однако, данное взаимодействие носит малоспецифичный характер. Тем не менее, подобная стратегия, основанная на использовании лектинов бобовых растений в качестве трансгенов для инициации процессов узнавания, может быть использована в дальнейшем для получения новых ассоциативных систем экономически ценных несимбиотрофных видов растений и бактерий, обладающих различными полезными свойствами.
Введение Клубеньковые бактерии (ризобии) - почвенные грамотрицательные микроорганизмы, способные вступать в высокоэффективный азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями. Молекулярный азот, получаемый в ходе микробиологической азотфиксации, является альтернативой дорогостоящим и экологически небезопасным азотным удобрениям. Поэтому последние десятилетия активно ведутся исследования, конечной целью которых является получение стабильных искусственных азотфиксирующих комплексов между несимбиотрофными растениями и ризобиями.  В попытке создания несимбиотрофных растений, способных вступать в азотфиксирующий симбиоз с ризобиями, различными авторами получены трансгенные растения, содержащие гены, продукты которых необходимы на ранних этапах развития бобово-ризобиальных отношений - кальций и кальмодулин-зависимой протеинкиназы CCaMK, изофлавонсинтазы, LysM рецепторных киназ [Sreevidya et al., 2006; Radutoiu et al., 2007; Li et al., 2011]. Некоторое время назад выполнена большая работа, в которой в несимбиотрофные растения переносили сразу семь генов сигнального каскада, запускаемого специфической рецепцией Nod-факторов, и инициирующего процесс образования клубеньков [Untergasser et al., 2012]. Другим подходом к созданию искусственных симбиозов является получение трансгенных растений, синтезирующих вещества, способствующие прикреплению к корням растений ризосферных бактерий с полезными свойствами. Одними из таких веществ, активно используемых для получения искусственных растительно-микробных симбиозов, являются лектины - белки, способные специфично и обратимо связывать углеводы. Предполагается, что функции растительных лектинов чрезвычайно разнообразны и включают в себя регуляцию роста и развития растения, участие в межклеточных взаимодействиях, защиту растений от стрессовых воздействий, транспортные фунции [Шакирова, Безрукова (Shakirova, Bezrukova), 2007]. У бобовых растений лектины находятся на поверхности корневых волосков и за счет специфичного взаимодействия с полисахаридами клеточной стенки ризобий осуществляют двойное специфическое связывание последних c корнями растений [Laus et al., 2006]. В ряде работ было показано, что перенос гена лектина из одного бобового растения в другое приводил к тому, что трансгенное растение приобретало способность инфицироваться и в ряде случаев образовывать клубеньки при заражении неспецифичным для него штаммом ризобий [Diaz et al., 1989; Diaz et al., 1995; van Rhijn et al., 2001]. Однако, несмотря на значительные усилия исследователей, новых симбиозов ризобий с трансгенными небобовыми растениями до сих пор не удалось получить. В тоже время есть данные о возможности использования ризобий в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как томаты, перец, рис, пшеница и др. [Mishra et al., 2006; García-Fraile et al., 2012]. Азотфиксация в данном симбиозе невелика и по данным литературы на порядок ниже уровня симбиотической азотфиксации, однако ризобии способны улучшить рост растения за счет синтеза гормоноподобных соединений, сидерофоров, антибиотиков, растворения фосфатов, защиты от фитопатогенов и ряда других процессов [Моргун и др. (Мorgun et al.), 2009; Dimkpa et al., 2009]. Ранее в нашей лаборатории были проведены успешные эксперименты по созданию искусственных симбиотических ассоциаций небобовых растений табака, томата и рапса, трансгенных по гену лектина гороха (psl) с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum [Вершинина и др. (Vershinina et al.), 2011]. Однако, данный вид клубеньковых бактерий имеет повсеместное распространение в почве и есть вероятность, что в подобной ассоциации в естественных условиях искусственно интродуцированный штамм «полезных» ризобий будет вытеснен «местными» бактериальными штаммами. Бобовое растение козлятник восточный - перспективная многолетняя кормовая культура. Симбиоз козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium galegae bv. orientalis характеризуется исключительно строгой специфичностью партнеров [Radeva et al., 2001]. Естественным ареалом произрастания данного растения является Кавказ [Andronov et al., 2003]. В средней полосе России в диком виде козлятник не растет, что является причиной отсутствия в почвах специализированных клубеньковых бактерий, способных полноценно инфицировать это бобовое растение. Данные обстоятельства позволяют предположить, что трансгенные растения, синтезирующие лектин козлятника восточного, будут способны адгезировать на корнях только определенный вид ризобий, с которым не смогут конкурировать «дикие» ризосферные штаммы. Целью нашего исследования было получение трансгенных по гену лектина (GORL) козлятника восточного растений табаков и анализ колонизации корней данных растений микросимбионтом козлятника восточного R. galegae.  Материалы и методы Бактериальные штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции, последовательности олигонуклеотидных праймеров  В работе были использованы бактерии Escherichia coli штамма XL-Blue и Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. При создании генно-инженерных конструкций использовался бинарный вектор pCambia 1301 (Cambia, Австралия), содержащий в области Т-ДНК репортерный ген GUS и ген устойчивости к гигромицину. Для удобства клонирования в pCambia 1301 по сайту SmaI была вставлена 35S кассета, состоящая из 35S промотора, полилинкера и 35S polyA последовательности. Тотальную ДНК табака выделяли методом солевой экстракции [Aljanabi, Martinez, 1997], которую затем очищали с помощью набора фирмы “Цитокин” (Россия). Для анализа рекомбинантных клонов применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний. ПЦР проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия) с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Фрагменты ДНК элюировали из агарозного геля после препаративного электрофореза с помощью набора для очистки ДНК (Цитокин, Россия). Выделенные препараты ДНК и продукты амплификации анализировали в 1%-ном агарозном геле при напряжении 6 В/см длины геля. Секвенирование проводили на автоматических секвенаторах ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и GenomeLab GeXP (Beckman Coulter, США).  Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, Inc., США). Бактерии A. tumefaciens трансформировали методом электропорации с помощью прибора Micropulser (Bio-Rad Laboratories, США). Для амплификации полноразмерной кодирующей последовательности гена GORL лектина козлятника восточного использовали праймеры gorlf 5'- ATACATATATACAATGGCTTCT-3' и gorlr 5'-TACATACAACACATACATCTA-3', фланкирующие ген. Наличие гена GORL в геноме табака проверяли с помощью ПЦР с использованием следующих пар праймеров: gorlf-gorlr и gorlf-rGorLseq 5'-AATGCACGACCTACTATCTCCT-3'. Получение трансгенных растений табака   Трансгенные растения Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SR1 получали путем агробактериальной трансформации листовых пластинок табака рекомбинантным штаммом A. tumefaciens [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2011]. Первичные трансгенные T0-побеги отбирали на селективной среде (соли МС с добавлением 1 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л НУК), содержащей 25 мг/л гигромицина. Анализ активности гена GUS в листьях T0-побегов проводили по методу, описанному R.A. Jefferson с небольшими модификациями [Jefferson, 1987]. Растительный материал инкубировали в растворе X-Gluc, содержащем 1 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронид, 0.5% тритон X-100, 100 мМ Na2ЭДТА, 20% метанола, 0.5 мМ K3Fe(CN)6, 0.5 мМ K4Fe(CN)6 и 50 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 7.0). Корни инкубировали при 37°С в течение ночи, отбеливали в 70% этиловом спирте, выдерживали в 50% растворе глицерина в воде и проводили визуальный анализ при помощи микроскопа. Проверенные на GUS активность T0-побеги переносили на среду для укоренения (соли МС, витамины среды Гамборга, 3% сахароза, 0.1 мг/л ИУК, 25 мг/л гигромицина), затем в почвенную смесь и выращивали на светоплощадке до получения семян (Т1-потомство). Часть Т1-семян от каждой полученной линии проращивали на среде МС с добавлением гигромицина. Через три недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев и определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера. Результаты обрабатывали методом χ2 по стандартной методике и выделяли для дальнейшей работы линии, характеризующиеся расщеплением 3:1, что косвенно свидетельствует о наличии одной интегрированной копии трансгена в геноме табака. В качестве контроля использовали нетрансгенные растения исходного сорта Petit Havana линии SR1 и трансгенные растения, содержащие Т ДНК бинарного вектора pCambia 1301 без целевого гена. Трансгенные растения табака выращивали одновременно с контрольными в условиях светоплощадки при 25°С, 16-часовом фотопериоде и при освещенности 5 тыс. лк на универсальном грунте (Terra vita, Россия) ОТ-ПЦР  Тотальную РНК из листьев табака выделяли с использованием реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Ревертазную реакцию проводили с помощью олиго(dT) праймера (Силекс, Россия) и обратной траскриптазы MINT (Евроген, Россия). Наличие гена GORL в препаратах кДНК проверяли с помощью ПЦР с использованием праймеров gorlf и rGorLseq. Иммунофлуоресцентный анализ  Для локализации лектина GORL G. orientalis на поверхности табака проводили иммунофлуоресцентный анализ с использованием первичных антиполилектиновых антител к фрагменту углеводсвязывающего участка GORL длиной 25 аминокислотных остатков (НПФ ВЕРТА, Россия) и вторичных антител, меченных Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, USA) по методике, описанной Diaz с соавт. с модификацией [Diaz et al., 1986]. Корни табаков, трансгенных по гену лектина GORL, и корни контрольных растений разрезали на фрагменты длиной около 5 см и помещали в 10 мл пластиковые пробирки с 5% раствором сухого обезжиренного молока (Applichem, Германия) в 0.1 М карбонатном буфере, pH 9.6. Инкубировали в течение ночи на качалке при +4ºС. На следующий день корни трижды отмывали в TBS буфере и далее инкубировали на качалке в течение 1 часа с первичными антителами к лектину GORL, в разведении 1:5000. После инкубации корни снова отмывали в TBS буфере, затем переносили в TBS буфер с вторичными антителами, меченными Alexa Fluor 488 в разведении 1:50000, и сразу микроскопировали.  Обработка корней табака R. galegae и подсчет количества адсорбированных на поверхности корней бактерий Для анализа колонизации корней использовали растения, трансгенные по гену GORL, выращенные из семян первого поколения и достигшие месячного возраста. Из бактерий использовали штаммы ризобий R. galegae bv. orientalis 0702 из коллекции ВНИИСХМ, которые для удобства детектирования были маркированы флуоресцентным белком GFP [Баймиев и др. (Baymiev et al.), 2011]. Бактерии выращивали при 28°С в течение 1 - 2 сут в жидкой среде TY (дрожжевой экстракт - 0.1%, бакто-триптон - 1%, CaCl2 - 0.1%) до концентрации 108 КОЕ/мл. Затем их разбавляли стерильной водой до концентрации 106/мл. Корни табаков, трансгенных по гену GORL, и корни контрольных растений разрезали на сегменты длиной 1 см, и по 100 мг корней вносили в пробирки с суспензией бактерий. После инкубации на качалке с бактериями в течение ночи при температуре 28°С корни трижды отмывали стерильной средой TY, гомогенизировали в ступке и доводили объем стерильной средой TY до 10 мл. После этого 0.1 мл суспензии из последовательных десятикратных разведений рассевали на чашки Петри с твердой средой TY и выращивали в термостате при 28°С в течение 2 сут. Количество адгезированных жизнеспособных клеток определяли по числу выросших флуоресцентно меченых колоний, которые потом пересчитывали на массу корней. Микроскопирование  Флуоресцентно окрашенные бактерии и иммунолокализацию лектина GORL на корнях трансгенного табака наблюдали с помощью флуоресцентных микроскопов BioZero Analyzer (Keyence, Япония), Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Германия) и конфокального микроскопа Zeiss LSM 5 Exciter (Carl Zeiss, Германия).  Статистическая обработка данных   Эксперименты включали не менее 10 биологических повторностей при подсчете количества адсорбированных на поверхности корней бактерий. На рисунках приведены средние результаты опыта и их стандартные ошибки. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel. Результаты и обсуждение  Для амплификации гена GORL были подобраны праймеры к полноразмерной последовательности гена лектина G. orientalis, зарегистрированной в GenBank под номером AY253985.1. Размер ожидаемого ПЦР-продукта составил 877 п.н. Полноразмерная кодирующая последовательность гена лектина GORL G. orientalis была амплифицирована Pfu-полимеразой (рис.1.) и клонирована за 3'-концом конститутивного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты по сайту SmaI в Т-ДНК модифицированного вектора pCambia 1301.  Полученная генетическая конструкция pCambia 1301 GORL была перенесена методом электропорации в агробактерии A. tumefaciens штамма AGL0, которые далее были использованы для трансформации листовых пластинок табака. Трансгенную природу табака проверяли гистохимическим анализом на активность гена GUS.  Рис.1. Электрофореграмма ПЦР-продукта гена GORL. 1 - ампликон гена GORL; 2 - отрицательный контроль без ДНК; 3 - маркер, плазмида pBSK, расщепленная рестрикционной эндонуклеазой HpaII. Fig.1. The gel electrophoresis image of PCR products of GORL gene. 1- PCR product of GORL gene; 2-negative control without DNA; 3- marker, pBSK  digested with HpaII Присутствие гена GORL G. orientalis в геноме трансгенных растений определяли ПЦР с тотальной растительной ДНК с праймерами gorlf и gorlr, фланкирующими полноразмерную последовательность искомого гена. Транскрипционную активность гена лектина GORL в трансгенных растениях табака подтверждали ОТ-ПЦР (рис. 2). В контрольных растениях гистохимический анализ, ПЦР и ОТ-ПЦР дали отрицательный результат. Рис.2. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР фрагмента гена GORL в трансгенных растениях табака поколения T1. 1-6 - продукты ОТ-ПЦР  табаков, трансгенных по гену GORL;  7-12 - контроль на наличие ДНК в препаратах мРНК; 13 - положительный контроль (ампликон фрагмента гена GORL с плазмиды pCambia 1301 GORL);  14 - отрицательный контроль без ДНК;  15 - маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.) Fig.2. The gel electrophoresis image of RT-PCR product of GORL gene in transgenic tobacco T1. 1-6 - products of RT-PCR of tobacco transformed with GORL gene;  7-12 - DNA control in mRNA preparations;  13 - positive control (PCR product of GORL gene with pCambia 1301GORL); 14 - negative control without DNA; 15 - DNA marker, 100-1000 bp. Локализация целевого белка на поверхности корней табака, трансгенного по гену GORL, была подтверждена с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием первичных антител к лектину GORL козлятника восточного и вторичных антител, меченных Alexa Fluor 488 (рис. 3). В качестве контроля для исключения автофлуоресценции брали фрагменты корней трансгенных и контрольных растений, которые инкубировали только с вторичными антителами. Корни табаков в возрасте одного месяца, трансгенных по гену GORL, и корни контрольных табаков заражали клубеньковыми бактериями - микросимбионтами козлятника восточного R. galegae штаммом CIAM 0702, маркированными зеленым флуоресцентным белком (GFP). После инкубации с бактериями проводили подсчет числа адгезированных клеток на корнях контрольных и трансгенных растений. Анализ показал, что на корнях табаков, трансгенных по гену лектина GORL сорбировалось в 4 раза больше бактерий R. galegae, по сравнению с контрольными растениями (рис. 4). При этом наблюдался значительный разброс в результатах для трансгенных растений, что может быть связано с различным уровнем экспрессии гена GORL в отдельных растениях. Рис.3. Иммунолокализация лектина козлятника восточного на поверхности корней контрольного нетрансгенного (А) и трансгенного (Б) по гену GORL растений табака. Fig.3. Immunolocalization of Galega orientalislectin  on the roots surface, control (A) and transgenic (B) GORL tobacco plants. Рис.4. Адгезия бактерий на поверхности корней растений табака. А) корни контрольных растений, обработанных R. galegae; Б) корни трансгенных по гену GORL растений, обработанных R. galegae. Fig.4. Bacterial adhesion on the root surface of tobacco. А) roots of non-transgenic plants treated by R. galegae; B) roots of transgenic GORL plants treated by R. galegae. Рис. 5. Количественный анализ бактерий R.galegae, адгезированных на поверхности корней трансгенных (GORL+) и контрольных (GORL) растений табака. Fig. 5. The number of adhered bacteria R.galegae  onto the root surface of transgenic (GORL+) and  control non-transgenic (GORL) tobacco plants. Сравнительно низкий уровень адгезии бактерий R. galegae на корнях трансгенных табаков в сравнении с контрольными растениями может быть объяснен наличием у козлятника восточного нескольких отличных друг от друга лектинов. Ранее У. Тредсон с соавт. при изучении процессов узнавания в симбиозе Galega - R. galegae изолировали несколько растительных генов, один из которых был идентифицирован ими как ген лектина [Troedsson et al., 2006]. Полноразмерная кодирующая последовательность этого гена (GORL) была выбрана нами в качестве объекта данного исследования. Второй ген лектина козлятника восточного (GORIENT) был идентифицирован позднее в нашей лаборатории, однако для него известна только часть последовательности, включающей углевод-связывающий домен соответствующего белка [Баймиев и др. (Baimiev et al.), 2005]. При этом белки, кодируемые генами GORL и GORIENT, не изучались. Сравнительный анализ нуклеотидных и выведенных аминокислотных последовательностей, проведенный методом множественного выравнивания показал достаточно низкий уровень гомологии транслируемых областей лектинов GORL и GORIENT козлятника восточного, включая значительные различия в области пептида, определяющего специфичность молекулы данного белка к моносахариду (рис. 6). Подобный пептид был впервые обнаружен К.Ямамото с соавт. [Yamamoto et al., 1992] в составе лектина Bauhinia purpurea, а затем и в лектинах других бобовых. Экспериментально было показано, что даже единичная аминокислотная замена в области УСП лектина бобовых может вызвать изменение или потерю углеводсвязывающей активности соответствующего белка [van Eijsden et al., 1992]. Окончательная тонкая специфичность лектина формируется с участием аминокислотных остатков окружающих углеводсвязывающий пептид [Young, Oomen, 1992].  Рис. 6. Сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей фрагментов лектинов GORL и GORIENT козлятника восточного, включающих углеводсвязывающие последовательности (подчеркнуты). Fig. 6. Comparative analysis of the predicted amino acid sequences of the lectin fragments GORL and GORIENT of G. orientalis, including carbohydrate binding sequences (underlined) Таким образом, вероятно, гены лектина GORL и GORIENT козлятника восточного кодируют белки с разными функциями и углеводсвязывающей активностью. Отметим, что в литературе описаны случаи наличия в бобовом растении нескольких изолектинов или лектинов, различающихся по углеводной специфичности [Baumann et al., 1979; Moreira et al., 2013]. Причем лектины из различных растений могут быть более подобны друг другу, нежели разные лектины из одного и того же растения [Konami et al., 1991]. Поэтому, возможно, что выявленная низкая избирательность взаимодействия лектина GORL с микросимбионтом козлятника восточного на корневых волосках табаков, трансгенных по гену GORL, вызвана тем, что данный лектин не принимает участие в процессах специфического узнавания и прикрепления ризобий при формировании симбиоза G. orientalis - R. galegae. В то же время, вероятно, из-за некоторого сходства в строении углеводсвязывающих центров двух лектинов GORL и GORIENT происходит низкоспецифичное взаимодействие белка GORL с углеводными компонентами клеточной стенки бактерий R. galegae, что приводит к увеличению на трансгенных корнях числа сорбированных ризобий относительно контроля.  Полученные данные продемонстрировали участие трансгенного лектина GORL в прикреплении бактерий, на примере ризобий R. galegae к поверхности корней. Однако, данное прикрепление носит, по-видимому, неспецифический характер, тогда как в предлагаемом подходе для развития успешных ассоциативных отношений необходима активная колонизация ризобиями ризосферы растения-хозяина, за счет специфического направленного взаимодействия бактериальных клеток с лектином на поверхности корней.  В дальнейшем нами планируется определить полноразмерную последовательность гена GORIENT лектина козлятника восточного и провести исследование, аналогичное вышеописанному, с целью изучения возможности использования лектина GORIENT в качестве якорного белка для получения стабильных искусственных ассоциаций между растениями и ризобиями.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз