ИММУНОЛОКАЛИЗАЦИЯ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ ГОРОХА В НОРМЕ И ПРИ ЗАСОЛЕНИИ

Авторы:
Ахиярова Г.Р. , Финкина Е.И. , Овчинникова Т.В. , Веселов С.Ю. , Кудоярова Г.Р.
Название:
ИММУНОЛОКАЛИЗАЦИЯ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ ГОРОХА В НОРМЕ И ПРИ ЗАСОЛЕНИИ
Страницы:
372-380
скачано
12 раз(а)


Иммуногистохимическое окрашивание срезов корня растений гороха с помощью специфических антител к липид-транспортирующим белкам (ЛТБ) выявило их присутствие по периметру клеток, расположенных преимущественно в зоне флоэмы. Добавление хлорида натрия в прикорневую среду растений до концентрации 50 мМ приводило к повышению уровня ЛТБ в области флоэмы. Гистохимическое окрашивание срезов на суберин с помощью судана обнаружило ускорение формирования поясков Каспари в области эндодермы под влиянием засоления, что соответствовало повышенному уровню окрашивания на ЛТБ. Эти данные подтверждают гипотезу об участии ЛТБ гороха в отложении суберина. Засоление вызывало повышение иммуноокрашивания на АБК клеток корня. Однако, распределение данного гормона отличалось от локализации ЛТБ в корнях. Следовательно, это не могло подтвердить предположение о прямом влиянии АБК на накопление ЛТБ в клетках корня гороха при засолении. Обсуждается разнообразие предполагаемых функций ЛТБ в растениях.
Введение
Липиды играют важную роль в жизни растений, участвуя в формировании мембран, клеточной дифференцировке, передаче внутриклеточных сигналов и сигналов между клетками, образуя непроницаемые для воды и термоизолирующие покровы, обеспечивающие защиту растений от неблагоприятных воздействий, выполняя запасающую и энергетическую функции. Белки, участвующие во внутриклеточном и внеклеточном транспорте липидов, обеспечивают их доставку к месту назначения [Финкина и др. (Finkina et al.), 2016]. Липид-транспортирующие белки (ЛТБ) – сравнительно недавно открытый класс белков, который привлек к себе пристальное внимание исследователей [Abdelkader, Mazliak, 1970; Tsuboi et al., 1992; Kader, 1996]. Характерной особенностью пространственной структуры этих белков является наличие впадины, устланной боковыми радикалами гидрофобных аминокислотных остатков [Simorre et al., 1991; Samuel et al., 2002; Cheng et al., 2004; Hoh et al., 2005]. Ее присутствие обеспечивает продемонстрированную in vitro способность ЛТБ образовывать комплексы с жирными кислотами и липидами и осуществлять их перенос между природными и искусственными мембранами [Tassin et al., 1998; Cheng et al., 2004; Pato et al., 2001]. Считается, что благодаря этому свойству данные белки участвуют в транспорте и метаболизме липидов [Cameron et al., 2006; Lee et al., 2009], а также в формировании гидрофобных слоев кутина и суберина [Douliez et al., 2000; Edstam, Edqvist, 2014], образующих непроницаемые для воды барьеры (например, пояски Каспари). Однако прямые доказательства этого предположения не были получены. Увеличение экспрессии генов ЛТБ происходит в условиях воздействия на растение различных неблагоприятных факторов, в связи с чем, данные белки относят к системе защиты растений от стресса [см. обзор Финкина и др., 2016 и ссылки в нем (see review Finkina et al., 2016 and references inside)].
Ранее в горохе были обнаружены три ЛТБ, названные Ps-LTP1-3. Было показано, что гены, кодирующие данные белки, дифференциально экспрессируются в различных частях растения, но в корнях присутствуют транскрипты всех трех изоформ Ps-LTP. В экспериментах по исследованию способности Ps-LTP1 связывать гидрофобные лиганды было показано, что данный белок наиболее эффективно связывает лизофосфолипиды с ацильными радикалами С16 и ненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи С16 и С18, содержащие различное число двойных связей, и возможно принимает участие в биосинтезе кутина и суберина [Bogdanov et al., 2016]. В данной работе мы применили иммуногистохимический подход с использованием полученных ранее [Bogdanov et al., 2015] специфичных к ЛТБ антител для выявления тканевой локализации белков данного класса, как в норме, так и в условиях солевого стресса и установления их возможных функций в корнях гороха.
Материалы и методы
Семена гороха посевного Pisum sativum сорта Сахарный 2 замачивали в воде в течение суток, после чего оборачивали влажной марлей для прорастания. Трехсуточные проростки гороха пересаживали на плотики, помещали в поддоны с водопроводной водой и выставляли на светоплощадку с 14-часовом фотопериодом, освещенностью 400-500 мкмоль м-2с-1 ФАР (лампы ZN-500 и DNAT-400) и температурой 24/18°С (день/ночь). В возрасте 4 суток часть проростков переносили в поддоны с водопроводной водой, содержащей 50 мМ хлорида натрия. Замену растворов проводили ежедневно.
Фиксацию корней для изучения иммуногистохимической локализации ЛТБ и абсцизовой кислоты (АБК) производили через 1 и 7 суток после введения хлорида натрия в прикорневую среду. Для этого брали кусочки тканей корня из его центральной (середина корня) и базальной частей. Сегменты корня длиной 5 мм фиксировали в течение 12 ч в растворе 4% карбодиимида (Sigma, Германия), приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7.2-7.4). Карбодиимид не только фиксировал белки, но и осуществлял конъюгирование АБК с белками тканей [Ахиярова и др. (Akhiyarova et al.), 2006; Веселов (Veselov), 1998]. Затем ткани корня на 12 ч помещали в смесь 4% параформальдегида (Riedel de Haen, Германия) и 0.1% глютаральдегида (Sigma, Германия). После фиксации растительные ткани отмывали в течение 1 ч в фосфатном буфере (рН 7.2-7.4) и последовательно выдерживали по 30 минут в разведениях этанола для их дегидратации. Кусочки корней заливали в смолу JB4 (Electron Microscopy Sciences, США). Гистологические срезы толщиной 1.5 мкм получали с помощью ротационного микротома (HM 325, MICROM Laborgerate, Германия). Перед нанесением иммунной сыворотки срезы в течение 30 минут инкубировали при комнатной температуре в 0.1 М фосфатном буфере (по 50 мкл на каждый срез), содержащем 0.2% желатина и 0.05% Твина-20. Далее на часть срезов наносили кроличью сыворотку, содержащую поликлональные IgG антитела к ЛТБ чечевицы Lc-LTP2, перекрестно реагирующие с ЛТБ гороха (Ps-LTP1) (разведение 1:200) или — сыворотку кроликов, иммунизированных АБК (разведение 1:80). Другие срезы служили в качестве иммунологического контроля, для чего их обрабатывали неиммунной сывороткой кролика. После трехкратной промывки в растворе ФТ (0.05% Твин-20 в 0.1 М фосфатном буфере) на срезы наносили вторичные козьи антивидовые антитела к IgG кролика, меченные коллоидным золотом (Aurion, США), в разведении 1:40. Детекцию связавшихся антител проводили, нанося на срезы серебряный усилитель (Aurion, США), и наблюдали за появлением характерного почернения тканей в световой микроскоп. После этого серебро удаляли ополаскиванием стекол в деионизированной воде. Съемку полученных препаратов проводили с помощью цифровой камеры AxioCam Mrc5 (Carl Zeiss, Германия).
Суберин в тканях корня окрашивали спиртовым суданом III (Sigma, Германия) [Фурст (Furst), 1979]. Суберинизированные ткани окрашивались в темно-оранжевый цвет.
Результаты и обсуждение
Иммуногистохимическое исследование срезов корней контрольных растений гороха (без воздействия засоления) с помощью сыворотки, содержащей поликлональные анти-ЛТБ антитела класса IgG, показало усиление окрашивания преимущественно по периметру клеток. В связи с тем, что ЛТБ гороха, как и другие представители данного класса белков, синтезируются в виде предшественников с сигнальными N-концевыми пептидами [Bogdanov et al., 2016], это могло свидетельствовать об их локализации в апопласте (рис. 1).
Рис. 1. Иммунолокализация ЛТБ на срезах центральной (а, в) и базальной (б, г) части корня 7-дневных контрольных растений гороха. Срезы а и б покрашены с помощью специфической сыворотки, содержащей анти-ЛТБ антитела, срезы в и г – сывороткой неиммунизированного кролика: к – кора;
цц – центральный цилиндр; кс – ксилемные сосуды; пф – предполагаемая флоэма.
Fig. 1. Immunohistochemical staining of LTPs on cross sections of roots from central (a, c) and basal (b, d) zones of 7-days pea control plants. (a) and (b) sections were incubated by anti-LTP antibody, (c) and (d) - by non-immune serum.
к – cortex, цц – central cylinder, кс – xylem, пф – phloem.Наблюдаемое окрашивание проявлялось на срезах корней как в центральной (рис. 1а), так и в базальной (рис. 1б) части. Специфичность метода подтверждалась отсутствием окрашивания при обработке срезов контрольной (неиммунной) сывороткой (рис. 1в и г). По краю центрального цилиндра между радиальными рядами клеток ксилемы интенсивность окрашивания на ЛТБ была повышена в рядах, образующих дуги клеток. Количество рядов таких клеток было больше на поперечном срезе базальной части корня, по сравнению со срезом центральной части. Такое расположение и форма рядов клеток, окрашивающихся анти-ЛТБ антителами, характерны для флоэмных клеток. Недавно появившиеся литературные данные свидетельствуют о возможности транспорта липидных молекул по флоэме и участия в этом белков различных классов, связывающих гидрофобные лиганды, в том числе гомологов Bet v 1 [Guelette et al., 2012] и ЛТБ [Carella et al., 2016]. Более того, показано, что ЛТБ могут менять свою локализацию. Например, Ha-AP10 подсолнечника Helianthus annuusoccurs в семенах находится в апопласте, но при прорастании последних проникает внутрь клеток. Таким образом, выявленное нами повышенное окрашивание в области флоэмы указывает на возможную роль ЛТБ в транспорте липидных молекул по флоэме или разгрузке флоэмы и доставке липидов из сока флоэмы к месту назначения. Так как ЛТБ гороха связывают жирные кислоты, являющиеся предшественниками суберина, а флоэма расположена близко к месту формирования поясков Каспари, выявленные нами особенности локализации ЛТБ свидетельствуют в пользу их возможного участия в отложении суберина.
Известно, что засоление ускоряет отложение суберина и формирование поясков Каспари [Perumalla, Peterson, 1986]. Гистохимическое окрашивание на суберин с помощью судана выявило формирование поясков Каспари в области эндодермы (граница между центральным цилиндром и корой – четкая линия по окружности ряда эндодермальных клеток) (рис. 2) в корнях под действием засоления (эта линия не заметна на срезе корней контрольных растений).
Рис. 2. Влияние засоления (50мМ NaCI) на окрашивание суданом поперечных срезов корней гороха:
а — контроль; б - засоление. Стрелками отмечено окрашивание суберина в слое эндодермы.
Fig. 2. Cross sections of pea roots stained with Sudan III in control conditions (a) and under salinity (b).
Suberin was stained in endoderma (arrows).
В наших экспериментах через сутки после добавления хлорида натрия в прикорневую среду не было обнаружено различий в окрашивании клеток поперечных срезов корней с помощью сыворотки с анти-ЛТБ антителами (рис. 3). Однако, воздействие недельного засоления на растения гороха приводило к заметному увеличению иммунного окрашивания клеток на поперечных срезах корня в его центральной и базальной части (рис. 4). Увеличение интенсивности окрашивания срезов анти-ЛТБ антителами при засолении в предполагаемой области локализации флоэмы, прилегающей к пояскам Каспари, согласовалось с возможным  участием ЛТБ в отложении суберина в области эндодермы в условиях солевого стресса.
Известно, что АБК участвует в защитном ответе растений на разные виды стресса, и, в частности, накапливается в тканях растения при засолении [Veselov et al., 2008]. Защитное действие данного гормона обусловлено повышением уровня экспрессии генов белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis Related Proteins или PR-белков), в том числе ЛТБ [Kim et al., 2006]. Окрашивание срезов корней гороха анти-АБК антителами выявило увеличение содержания АБК в клетках растения при засолении (рис.5). Через сутки этот эффект проявлялся в отдельных клетках коры и центрального цилиндра, а через неделю после начала действия засоления окрашивание на АБК было выше практически по всех тканях поперечного среза корней по сравнению с контролем, особенно в зоне экзодермы.
Рис. 3. Иммунолокализация ЛТБ на срезах контрольных растений гороха (а, в) и через сутки (б, г) после начала засоления. Срезы а и б — центральная часть корня, срезы в и г – базальная часть корня.
Fig. 3. Immunohistochemical staining of LTPs on cross sections of control pea roots (a, c) and in a day (b, d) after salt adding (50 mM NaCl) from central (a, b) and basal (c, d) zones.
Рис. 4. Иммунолокализация ЛТБ на срезах контрольных растений (а, в) и на 7-ые сутки (б, г) после начала засоления. Срезы а и б — центральная часть корня, срезы в и г – базальная часть корня.
Fig. 4. Immunohistochemical staining of LTPs on cross sections of control pea roots (a, c) and in 7 days (b, d) after salt adding (50 mM NaCl) from central (a, b) and basal (c, d) zones.
Рис. 5. Иммунолокализация АБК на срезах корней 7- (а, б) и 14-дневных (в, г) растений гороха, которые росли на среде без соли (а, в); 1 сутки (б) или 7 суток (г) на среде с добавлением 50 мМ NaCl. Все срезы покрашены с помощью специфической сыворотки, содержащей анти-АБК антитела.
Fig. 5. Immunohistochemical staining of ABA on root cross sections of 7-days (a, b) and 14-days (c, d) pea plants. Control (a, c) conditions, in 1-day (b) and in 7 days (d) after salt adding (50 mM NaCl).
All sections were incubated by anti-ABA antibody.
Повышенный уровень интенсивности окрашивания срезов на АБК в области экзодермы на фоне засоления указывает на то, что этот гормон может стимулировать отложение суберина и формирование экзодермальных поясков Каспари. В тоже время такое тканевое распределение гормона, скорее всего, является следствием множественности процессов, регулируемых АБК, и не может напрямую свидетельствовать о его влиянии на накопление ЛТБ в клетках корня гороха при засолении.
Таким образом, нами выявлено, что ЛТБ гороха присутствуют в корнях растений и локализуются в клетках флоэмы. Накопление ЛТБ в ткани флоэмы происходит в условиях солевого стресса и свидетельствует об участии данных белков, связывающих предшественники суберина, в формировании непроницаемого для воды барьера в виде поясков Каспари.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз