Молекулярные маркеры, применяемые для определения генетического разнообразия и видоидентификации дикорастущих растений

Авторы:
Нигматуллина Н.В. , Кулуев АР. , Кулуев Б.Р.
Название:
Молекулярные маркеры, применяемые для определения генетического разнообразия и видоидентификации дикорастущих растений
Страницы:
290-318
скачано
14 раз(а)


Видоидентификация и оценка внутривидового генетического полиморфизма являются важнейшими задачами не только современной генетики растений, но и науки о растениях в целом. Для решения этих задач было разработано большое число разнообразных методов поиска и исследования таксономически значимых участков ДНК, которые получили название молекулярных или ДНК-маркеров. Данный обзор посвящен рассмотрению наиболее популярных методов изучения ДНК-маркеров дикорастущих растений с использованием технологий полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК-чипирования и секвенирования. Из методов, основанных на ПЦР, наибольшее распространение получили ISSR, RAPD, SSR, AFLP, IRAP и REMAP, причем эти методы применяют как для оценки генетического разнообразия, так и при видоидентификации. Более эффективным для изучения внутривидового полиморфизма является SNP-анализ, который обычно проводится методом ДНК-чипирования. Стремительный рост исследований связанных с SNP-анализом говорит о том, что эта группа методов в скором времени, возможно, полностью вытеснит классические методы ПЦР-фингерпринтинга. Для видоидентификации дикорастущих растений довольно эффективен метод секвенирования вариабельных таксономически значимых фрагментов ДНК. Для этого чаще всего применяют хлоропластные маркеры rpoB, rpoC1, rbcL, matK, psbK-psbI, trnH-psbA, atpF-atpH и ядерные маркеры ITS1 и ITS2. Ни один из этих маркеров не претендует на универсальность, поэтому при филогенетических построениях используют одновременный анализ нескольких ДНК-маркеров, причем вспомогательную роль при этом могут выполнять методы ПЦР-фингерпринтинга. Полногеномное секвенирование вместе с компьютерным анализом полученных данных при условии уменьшения стоимости и трудоемкости в будущем могут заменить все современные методы оценки генетического полиморфизма, основанные на ПЦР и ДНК-чипировании, а также все методы видоидентификации, использующие метод секвенирования таксономически значимых хлоропластных и ядерных маркеров.
Введение
Дикорастущие растения составляют основу биологических ресурсов, как России, так и всего мира. Стратегической задачей любой страны является сохранение этого биологического разнообразия растений. Многие экономически развитые страны выделяют большие финансовые средства для сохранения генетических ресурсов и видового разнообразия дикорастущей флоры, однако этого пока нельзя сказать про современную Россию, где данному вопросу уделяется недостаточное внимание.
Из-за разнообразия климатических зон, как за счет широтной зональности, так и высотной поясности в Республике Башкортостан (РБ) произрастает большое видовое разнообразие растений, среди которых имеются редкие, эндемичные и реликтовые [Федоров и др. (Fedorov et al.), 2012; Байрамгулова и др. (Bairamgulova et al.), 2012; Тухватуллина и др. (Tuhvatullina et al.), 2017]. Значение дикорастущих растений для природы трудно переоценить, тем более, что многие из них к тому же являются хозяйственно-ценными ресурсными видами, а также могут быть использованы для доместикации и окультуривания. Современная систематика дикорастущих растений в России основана преимущественно на классических методах ботаники, тогда как генетические методы в нашей стране и, в частности, в нашем регионе для этого применяются нечасто. В связи с этим является актуальным проведение генетических исследований видового разнообразия и генетического полиморфизма видов и популяций в РБ с использованием различных ДНК-маркеров, которые также известны под названием молекулярно-генетических маркеров (МГМ). Анализ МГМ для определения полиморфизма различных участков геномной ДНК может помочь в выявлении внутривидового генетического разнообразия, оценки гетерозиготности, реконструкции филогенетических взаимоотношений между видами и пространственных взаимосвязей между популяциями. МГМ играют огромную роль в изучении наследования генов и их аллельного состояния, используются для анализа генетического полиморфизма и филогенетических отношений между видами, популяциями и отдельными индивидами, а также с целью выявления маркеров, тесно сцепленных с генами, контролирующими хозяйственно ценные признаки растений. В настоящее время существует огромное количество различных типов молекулярных маркеров, и их число постоянно увеличивается вместе с совершенствованием современных технологий и ростом знаний об отдельных генах и геномах растений в целом [Mohan et al., 1997; Хлесткина, Салина, (Khlestkina, Salina), 2006; Semagn et al., 2006; Henry, 2013; Poczai et al., 2013; Salgotra et al., 2014].
Огромное количество ДНК-маркеров ставит перед исследователями проблему рационального подбора оптимального варианта. Наиболее важные критерии для выбора МГМ:
1. Универсальность; к примеру, праймер, который можно использовать для амплификации и секвенирования не только близкородственных видов, но и представителей других таксонов растений. Представляют большой интерес праймеры, которые можно применять для разных групп организмов. В то же время отрицательной стороной универсальности праймеров может являться увеличение вероятности контаминации в лабораториях.
2. Степень перекрывания и качество выполнения; генетических локусов огромное количество, поэтому нужно обозначить какие из них наиболее выгодны для подбора праймеров. Значение неоднозначности прочтения должно быть минимизировано, в идеале отсутствовать.
3. Способность различать виды; необходимо знать, какие локусы позволяют идентифицировать максимальное число видов. Наилучшая ситуация, когда междвидовой полиморфизм выше внутривидового, а особи одного вида группируются отдельно от особей других видов [Матвеева и др. (Matveeva et al.), 2011].
Совокупность методов анализа генетического полиморфизма биологических объектов с использованием ДНК-маркеров называется ДНК-фингерпринтингом. В качестве молекулярных маркеров при изучении растений часто используют различные повторяющиеся последовательности геномов. Среди тандемно организованных повторяющихся последовательностей наиболее полиморфными являются минисателлитные, микросателлитные последовательности и ретротранспозоны. В целом все подходы по генетическому анализу дикорастущих растений основаны на четырех базовых методах: рестрикционный анализ (RFLP), ПЦР (RAPD, ISSR, AFLP, IRAP и др.), ДНК-чипы (SNP) и секвенирование. Благодаря дешевизне, простоте и большой информативности, на сегодняшний день наиболее широкое распространение получили методы, основанные на ПЦР [Сухарева, Кулуев (Sukhareva, Kuluev), 2018]. Однако для анализа дикорастущей флоры наибольшую ценность представляют молекулярные маркеры, пригодные для видоидентификации растений, к каковым относят ряд вариабельных участков хлоропластного и ядерного геномов, фланкированные консервативными участками [Матвеева и др. (Matveeva et al.), 2011]. Эти участки секвенируют и путем сравнения их нуклеотидных последовательностей при помощи различных компьютерных программ делают выводы о родстве растений.
ДНК-маркеры, применяемые для генетического анализа растений, ранее уже рассматривались в русскоязычной литературе, однако они чаще всего посвящались исследованиям культурных растений [Хлесткина (Khlestkina), 2013] или же отдельных групп дикорастущих растений [Калько (Kalko), 2015]. После опубликования этих и других обзорных статей прошло более трех лет, поэтому мы решили снова сосредоточить внимание заинтересованных специалистов на этом вопросе. Целью данного обзора является рассмотрение некоторых методов выявления ДНК-маркеров, которые могут быть использованы для видоидентификации и анализа генетического полиморфизма популяций дикорастущих растений. Рассматриваются также некоторые примеры успешного применения этих методов при исследовании растений.
ISSR-анализ (микросателлитное праймирование)
Пожалуй, наиболее часто используемым в России методом генетического анализа дикорастущих растений является ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), основанный на микросателлитном праймировании [Бобошина (Boboshina), 2012]. Этот метод начал развиваться с 1994 года, и в настоящее время получил широкое распространение в исследованиях генофондов различных видов растений, для картирования геномов и маркирования хозяйственно важных признаков [Manninen et al., 2000]. ISSR-маркеры относятся к маркерам доминантного типа наследования. В основе метода ISSR лежит анализ амплифицированных полиморфных участков ДНК между микросателлитными повторами. Нуклеотидный состав "якоря" должен отличаться от повторов микросателлита и не служить его аналогичным продолжением. Праймеры ISSR состоят из фрагмента микросателлитного локуса (ди- или тринуклеотидного, чаще всего) и 1-2 "якорных" нуклеотидов на одном из флангов повтора. Праймер состоит из тандемных повторов, например, 5'-АС АС АС АС АС АС АС АС АС G, и на 3'-конце имеется один селективный нуклеотид [Боронникова (Boronnikova), 2009]. Такие праймеры позволяют амплифицировать уникальные последовательности ДНК, которые могут быть проанализированы при помощи агарозного гель-электрофореза (рис. 1). Номенклатура ISSR-праймеров весьма обширна, к примеру, довольно широкое распространение получили праймеры: М1, М3, М27, Х10, Х11 [Бобошина (Boboshina), 2012]. В одном исследовании с помощью праймера М3 были выявлены самые низкие значения полиморфизма в популяциях, а при помощи праймера Х11 - самые высокие [Боронникова и др. (Boronnikova et al.), 2010]. После проведения ISSR-ПЦР в результате анализа на электрофореграмме образуется так называемый ISSR-фингерпринт, который выглядит как сочетание дискретных полос ДНК на геле [Грушецкая и др. (Grushetskaya et al.), 2013]. ISSR-фингерпринт довольно хорошо воспроизводится, потому что последовательность праймера строго специфична, за счет чего достигается довольно высокий уровень специфичного отжига. Однако проблема "сильных" и "слабых" ампликонов, как и в случае других ДНК-маркеров, основанных на методе ПЦР, остается [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018b]. В литературе подчеркивается необходимость более строгого подбора последовательностей ISSR-праймеров и использования в анализе только "ярких" продуктов ISSR-амплификации [Manninen et al., 2000]. Отжигаются ISSR-праймеры при амплификации только с одного конца матричной ДНК, поэтому получаемые фрагменты локализуются между инвертированными микросателлитами [Боронникова (Boronnikova), 2009].
Рис. 1. Результаты ISSR-анализа ДНК тладианты сомнительной Thladiantha dubia с использованием праймера HB14 (CTCTCTCTCTCTCTCTTG). 1 и 2 - образцы ДНК инвазионной популяции тладианты из Республики Башкортостан. 3, 4, 5 - образцы ДНК природной популяции тладианты из Приморского края. Черными стрелками на рисунке отмечен выявленный полиморфный локус между образцами естественной и инвазионной популяции T. dubia [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018d].
Fig. 1. Results of ISSR analysis of DNA probes of Thladiantha dubia using primer HB14 (CTCTCTCTCTCTCTCTG). 1 and 2 - DNA samples of the invasive population of T. dubia from the Republic of Bashkortostan. 3, 4, 5 - DNA samples of the natural population of T. dubia from the Primorsky Krai. The black arrows in the figure indicate the identified polymorphic locus between the samples of the natural and invasive T. dubia population [Kuluev et al., 2018d].
Результаты ISSR-анализа оценивают с использованием бинарной матрицы, в которой значения 1 и 0 указывают на наличие или отсутствие продукта, соответственно. Генетические отношения оцениваются с использованием анализа кластеров UPGMA (невзвешенный парный метод с арифметическим средним), основанный на индексах генетического подобия. Для построения дендрограммы применяют метод UPGMA с использованием программы TREECON (version 1.3b) [Van De Peer, 1994], а также кластерный анализ невзвешенного кластирования с арифметическим методом средних в программе NTSYS2.10 [Reddy et al., 2000; Rohlf, 2001; Prazak, Paczos-Grzeda, 2017; Mahatma et al., 2017]. Различия в этих программах заключаются в использовании метода вычисления.
Важным преимуществом ISSR-метода является то, что нет необходимости в предварительном знании нуклеотидной последовательности ДНК, что позволяет работать с одними и теми же праймерами с широким кругом видов растений. По сравнению с другими методами генетического анализа, основанными на ПЦР, для ISSR характерна улучшенная воспроизводимость за счет удлинения и повышения температуры отжига праймера. Причем изменчивость набора ISSR-ампликонов зависит только от времени расхождения между организмами. В таблице 1 представлены последовательности некоторых ISSR-праймеров, нашедших применение при генетическом анализе растений.
В литературе имеется большое количество примеров успешного применения ISSR-маркеров на практике. Этот подход применялся для изучения полиморфизма дикорастущих растений, таких как Calluna vulgaris и Polypodium vulgare [Грушецкая и др. (Grushetskaya et al.), 2013]. Был найден ISSR-маркер К-16, который может быть использован для поиска пол-специфичных последовательностей на дикорастущем двудомном растении Humulus japonicus. Высокая эффективность маркера на ранних этапах онтогенеза подтверждается тем, что на мужских растениях происходила стабильная амплификация фрагмента размером около 300 п.н., а на женских амплификация полностью отсутствовала [Александров и др. (Aleksandrov et al.), 2011].
Новый способ записи и компоновки молекулярно-генетической формулы базируется на обнаружении идентификационных (общих) молекулярных маркеров с использованием ISSR метода анализа полиморфизма ДНК, который охватывает значительную часть генома растений, и может быть полезен для генетической паспортизации редких дикорастущих растений, таких как Adonis vernalis, Digitalis grandiflora, Adenophora lilifolia [Боронникова (Boronnikova), 2009].
Таблица 1.
Примеры последовательностей некоторых ISSR-праймеров, применяемых при генетическом анализе дикорастущих растений [по Prazak, Paczos-Grzeda, 2017; Ebadi, Eghbali, 2017; Liu et al., 2017].
Table 1. Examples of some ISSR primers used in the genetic analysis of wild plants [Prazak, Paczos-Grzeda, 2017; Ebadi, Eghbali, 2017; Liu et al., 2017].
Название
праймера
Primer name
Последовательность
Sequence
Размер фрагментов (пн)
Size of DNA fragments (bp)
ISSR1
(AG)8G
480-1380
ISSR6
(GT)8C
450-1800
ISSR11
(AC)8G
330-1800
ISSR14
(GA)7YG
120-1600
ISSR16
(GA)8C
280-1800
ISSR17
(GA)8YC
220-1250
ISSR22
(CA)8G
430-1800
ISSR23
(CA)8GC
280-1030
ISSR27
(TC)8G
420-1700
ISSR28
(TG)8G
380-1600
ISSR33
(AG)8T
260-1370
ISSR34
(TC)8CC
540-2600
ISSR35
(TC)8CG
680-2600
ISSR36
(AC)8CG
380-2600
ISSR37
(AC)8C
290-1350
ISSR38
(CT)8G
430-1700
RAMP-TAG
T(AG)9
250-1800
RAMP-GAC
G(AC)9
350-2100
LK7
ССА(СТ)8
400-1600
HB-10
(GA)6CC
250-1700
(CA)7Y
(GCT)(AGT)(GCT)(CA)7Y
280-1850
(TG)7Y
(CAT)(GCA)(CAT)(TG)7Y
350-1600
(TG)7
(GCA)(CAT)(GCA)R(TG)7
300-2000
(GT)8
(GT)8(A/G)Y
TCC
(GT)8(A/G)TCC
350-1500
(CA)7
(GAT)(GCT)(GAT)(CA)7
440-1700
На основе ISSR-маркера был проведен компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК у Adonis sibirica с определением доли полиморфных локусов, общего числа аллелей, эффективного числа аллелей, ожидаемой гетерозиготности [Боронникова (Boronnikova), 2010].
Анализ информативности ISSR-маркеров оказался применим при исследовании как внутривидового, так и межвидового генетического полиморфизма дикорастущих растений, таких как Trollius europaeus, Salvia sclarea и других. Кластерный анализ генетических дистанций между видами, который был получен, базируясь на оценке полиморфизма по ISSR-маркерам, подтвердил современные представления о филогенетических взаимоотношениях между изученными видами [Грушецкая и др. (Grushetskaya et al.), 2013].
Довольно часто в ходе исследований выясняется, что некоторые ISSR-праймеры больше подходят для генетического анализа популяций, тогда как другие могут быть полезны для изучения межвидовых взаимосвязей [Костюкова и др. (Kostyukova et al.), 2013]. В литературе также предлагается использование метода ISSR для генетической паспортизации дикорастущих растений [Новикова и др. (Novikova et al.), 2012]. В целом, метод ISSR-анализа получил довольно широкое распространение в России и применялся также для анализа генетической гетерогенности популяций инвазивных сорных растений [Гуи и др. (Gui et al.), 2009; Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018d], древесных растений [Светлакова и др. (Svetlakova et al.), 2012; Нечаева и др. (Nechaeva et al.)., 2014; Пришнивская и др. (Prisnivskaya et al.), 2016; Янбаев и др. (Yanbaev et al.), 2017], ценных лекарственных растений [Реунова и др. (Reunova et al.), 2010], для генетической дифференциации сомаклонов с повышенной продукцией ценных биологически активных веществ в культуре in vitro [Спиридович и др. (Spiridovich et al.), 2012], для оценки генетического полиморфизма крымской популяции каучуконосного растения одуванчика осеннего [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018а], а также мутантных форм растений после проведенного химического мутагенеза [Баймухаметова и др. (Baimuhametova et al.), 2017].
RAPD-анализ (случайное праймирование)
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - полимеразная цепная реакция, основанная на использовании одного, обычно декануклеотидного праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью [Williams et al., 1990].

Методика RAPD включает:
1. Экстракцию высокочистой тотальной ДНК, при этом требования к качеству ДНК более высокие, чем при обычной ПЦР. Для растений чаще всего используют методы выделения ДНК при помощи ЦТАБ (цетил-триметиламмоний бромид) из высушенного материала [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018а].
2. Добавление в смесь единственного произвольного праймера. Хотя возможны варианты с использованием нескольких RAPD-праймеров в одной реакции (multiplex RAPD-PCR).
3. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
4. Разделение ПЦР-фрагментов гель-электрофорезом (рис. 2). Чаще всего используют 1,5-1,7% агарозный гель.
5. Визуализацию RAPD-спектра после окрашивания этидиум бромидом под ультрафиолетовым светом трансиллюминатора.
6. Определение размеров RAPD-фрагментов по сравнению с известным молекулярным маркером с помощью программного обеспечения для анализа геля [Karp et al., 1997].
Маркеры данного метода представляет собой продукты амплификации случайных последовательностей ДНК ограниченных произвольными олигонуклеотидными праймерами (табл. 2). Как и при ISSR в RAPD-методе чаще всего используется один праймер, то есть предполагается, что этот праймер отжигается во многих участках ДНК на комплементарных цепях. Количество амплифицированных фрагментов зависит от распределения и количества участков отжига по всему геному. Случайные ПЦР-продукты затем легко обнаруживаются на агарозном геле (рис. 2), и результирующая картина также как при ISSR представляет собой фингерпринт [Marwal, Gaur, 2014]. Важным моментом метода является подбор оптимальной температуры отжига, которая обычно варьирует в пределах от 30 до 40-С. Например, была проведена работа с RAPD-прймерами под условными названиями: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12 и Oligo 29. Оптимальные температуры отжига праймеров подбирались при помощи программы Oligo.net (Molecular Biology Insights, Inc). Размер RAPD-ампликонов в результате проведенной работы варьировал от 170 до 2800 п.н. [Калаев (Kalaev), 2012]. Также бывают случаи и неспаренности матрицы и праймера, что приводит к отсутствую ПЦР-продуктов или к слабой амплификации [Сулимова (Sulimova), 2004]. Решением этой проблемы может быть не только снижение температуры отжига (что часто нежелательно из-за возможного снижения специфичности), но и использование полуслучайных праймеров. Эти праймеры состоят из двух частей: 5'-конец комплементарен интрон-экзонной границе, 3'-конец имеет случайную последовательность. За счет консервативной части увеличивается длина праймера, что повышает воспроизводимость метода [Gawel et al., 2002; Матвеева и др. (Matveeva et al.), 2011].
Рис. 2. Результаты проведенного нами RAPD-анализа ДНК популяций водяного ореха Trapa sibirica из озер Упканкуль и Бильгиляр Республики Башкортостан с использованием праймера OPC-06 (5'-GAACGGACTC-3'). По результатам RAPD-анализа между исследуемыми популяциями генетический полиморфизм не выявлен.
Fig. 2. The results of the RAPD analysis of DNA of water caltrop Trapa sibirica from Lakes Upkankul and Bilgilyar of the Republic of Bashkortostan using primer OPC-06 (5'-GAACGGACTC-3 '). According to the results of RAPD analysis between the studied populations, genetic polymorphism was not detected.
Метод RAPD при всей своей простоте имеет ряд, как преимуществ, так и недостатков. Преимущества метода RAPD:
1. Высокая произвольная выборка.
2. Можно обнаружить неограниченное число локусов [Marwal, Gaur, 2014].
3. Относительная дешевизна.
4. Быстрота анализа [Алтухов, Салменкова (Altuhov, Salmenkova), 2002].
5. Информация о нуклеотидной последовательности не нужна [Кочиева, Оганисян (Kochieva, Oganisyan), 2000; Matveeva et al., 2003; Сулимова (Sulimova), 2004; Календарь, Глазко (Kalendar, Glazko), 2002].
Недостатки метода RAPD:
1. Проявление доминантных аллелей, которые затрудняют интерпретацию мультилокусов [Marwal, Gaur, 2014].
2. Высокая чувствительность к изменениям условий окружающей среды [Алтухов, Салменкова (Altuhov, Salmenkova), 2002].
3. ДНК у всех образцов должна быть выделена одним и тем же стандартным методом в одинаковых условиях из одних и тех же тканей. Сообщается, к примеру, что выявлен генетический полиморфизм в RAPD-спектрах плавающих листьев и подводных органов одного и того же растения водяного ореха Trapa natans [Bitonti et al., 1996].
RAPD-анализ, также как и ISSR, получил широкое распространение при генетическом анализе дикорастущих растений. RAPD-маркеры были использованы для оценки генетической гетерогенности 23 растений одного клона Populus deltoides. Это исследование подтвердило возможность использования RAPD метода для получения быстрой и точной информации о генетическом сходстве или различии [Rani et al., 1995]. Для определения молекулярно-генетических различий у Orobanche cumana из популяций различной географической локализации использовали реакции с 26 RAPD праймерами. Данный молекулярный маркер оказался подходящим для изучения меж- и внутрипопуляционной изменчивости O. cumana из регионов южной части Российской Федерации [Гучетль (Guchetl), 2013].
При помощи RAPD-маркеров были произведены вычисления основных показателей уровня генетического разнообразия растений из четырех локальных мест произрастания Arabidopsis thaliana на острове Валаам, а также обнаружен повышенный уровень его генетического разнообразия по сравнению с другими самоопыляющимися видами растений [Зарецкая (Zaretskaya), 2016]. При помощи RAPD-метода было показано разделение Deschampsia antarctica на две группы в соответствии с географическим происхождением [Андреев (Andreev), 2010]. Был проведен RAPD-анализ четырех диплоидных видов пшениц, который показал, что Triticum sinskajae более близок к T. monococcum, однако эти растения, вероятнее всего, являются разными видами [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018c]. RAPD-анализ также использовали для оценки генетического разнообразия популяций женьшеня [Реунова и др. (Reunova et al.), 2010], водяного ореха Trapa natans [Kachare et al., 2013], ферулы вонючой Ferula foetida [Сагындыкова и др. (Sagyndykova et al.), 2016].
Таблица 2.
Примеры последовательностей некоторых RAPD-праймеров, применяемых при генетическом анализе дикорастущих растений [по Awasthi et al., 2004; Nimbal et al., 2009; Liu et al., 2017].
Table 2. Examples of sequences of some RAPD primers using in the genetic analysis of wild plants [Awasthi et al., 2004; Nimbal et al., 2009; Liu et al., 2017]
Название праймера
OPC-01
TTCGAGCCAG
ОРС-05
GATGACCGCC
ОРС-11
AAAGCTGCGG
OPD-07
TTGGCACGGG
OPD-15
CATCCGTGCT
S4
GGACTGGAGT
S6
TGCTCTGCCC
S7
GGTGACGCAG
S8
GTCCACACGG
S10
CTGCTGGGAC
S11
GTAGACCCGT
S13
TTCCCCCGCT
S17
AGGGAACGAG
S22
TGCCGAGCTG
S23
AGTCAGCCAC
S24
AATCGGGCTG
S48
GTGTGCCCCA
S58
GAGAGCCAAC
S68
TGGACCGGTG
S70
TGTCTGGGTG
S75
GACGGATCAG
S96
AGCGTCCTCC
S121
ACGGATCCTG
S123
CCTGATCACC
S154
TGCGGCTGAG
S183
CAGAGGTCCC
S245
TTGGCGGCCT
S283
ACAGCCTGCT
S287
AGAGCCGTCA
S295
AGTCGCCCTT
S297
GACGTGGTGA
S303
TGGCGCAGTG
S340
ACTTTGGCGG
S417
TCAGTCCGGG
S476
CCAAGCTGCC
S488
CTCCAGCGGA
S1019
GGCAGTTCTC
S1505
CCCACTAGAC
S1510
ACTGCCCGAC
S1515
TTACGGTGGG
S1516
CCTGCGACAG
S1519
AGCCTCGGTT
S1520
TGCGCTCCTC
S1521
GTCTCGTCGG
S1522
AACGTACGCG
Используя метод RAPD нам ранее удалось дифференцировать инвазионные популяции Thladiantha dubia в Республике Башкортостан от растений, произрастающих на естественных местообитаниях Приморского края [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018d]. Методом RAPD-анализа было показано, что генетическая изменчивость дуба влияет на компоненты приспособленности паразитов этого вида [Симчук и др. (Simchuk et al.), 2015]. RAPD был успешно использован для генетической дифференциации сомаклонов многоколосника морщинистого с повышенным накоплением фенольных соединений и флавонолов в условиях in vitro [Спиридович и др. (Spiridovich et al.), 2012]. Таким образом, изучение RAPD-маркеров может рассматриваться как один из универсальных и дешевых методов оценки генетического разнообразия любых биологических объектов. В то же время по нашим наблюдениям, RAPD-спектры между разными видами довольно сильно различаются, тогда как внутри вида полиморфизм, в зависимости от праймера, вовсе может не выявляться. К примеру, при исследовании крымской популяции одуванчика осеннего нам не удалось выявить внутривидового генетического полиморфизма при использовании метода RAPD-ПЦР [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018а].
AFLP-анализ
AFLP (или AFLP-PCR - Amplified Fragment Length Polymorphism PCR - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов) был разработан для ДНК-фингерпринтинга в начале 90-х годов ХХ века [Zabeau, Vos, 1993]. В его основе лежит случайное расщепление тотальной ДНК парой рестрикционных эндонуклеаз, одна из которых - частощепящая (с тетрануклеотидным сайтом узнавания), а другая - редкощепящая (с гексануклеотидным сайтом узнавания), сопровождаемое амплификацией с помощью ПЦР лишь некоторой части образующихся рестрикционных фрагментов [Vos et al., 1995]. Таким образом, AFLP-анализ основан на селективной амплификации продуктов рестрикции ДНК (рис. 3). Так как продукты анализа разделяются в полиакриламидных гелях, этот метод имеет высокую разрешающую способность и может помочь выявить большее количество локусов, в том числе полиморфных, в сравнении с маркерами, анализируемыми в агарозных гелях (RAPD и ISSR). На разрешающую способность AFLP метода влияет система детекции фрагментов [Реунова (Reunova), 2010].
Методика AFLP включает следующие стадии:
1. Экстракция высокоочищенной ДНК.
2. Расщепление анализируемой ДНК рестрикционными эндонуклеазами (обычно смесь ферментов, например, EcoRI + MseI).
3. Лигирование адаптеров.
4. пре-ПЦР (амплификация рестрикционных фрагментов, предварительная селективная амплификация с праймером EcoRI + A и MseI primer + C).
5. Селективная ПЦР с мечеными праймерными (радиоактивные или флуоресцентные) парами (праймер + 3 пары оснований, прямой меченный, обратный немеченный).
6. Гель-электрофорез в полиакриламидном геле или разделение фрагментов при помощи автоматического капиллярного секвенатора [Romero et al., 2007]. Электрофореграммы можно анализировать с помощью такой программы, как GeneMapper.
После электрофореза в полиакриламидном геле получают высокоинформативную картину, состоящую из полос ДНК, число которых варьирует от 40 до 200.
Причины, по которым разные биологические образцы оказываются полиморфными:
1. Мутации в сайтах рестрикции.
2. Мутации в последовательностях, прилегающих к сайтам рестрикции.
3. Вставки или делеции в амплифицированных фрагментах [Savelkoul et al., 1999].
В литературе имеются многочисленные сведения о большей информативности AFLP перед RAPD и ISSR. Так, показано, что AFLP-маркеры более перспективны, чем RAPD и ISSR для характеристики генетической структуры и генетических связей популяций женьшеня [Реунова и др. (Reunova), 2010].
Основные преимущества AFLP:
1. Достаточно широкий спектр фрагментов ДНК, подлежащих анализу в результате эксперимента. При этом доля полиморфных фрагментов является существенной [Сулимова (Sulimova), 2004; Календарь, Глазко (Kalendar, Glazko), 2002].
2. В отличие от RAPD метод AFLP высоковоспроизводимый, поскольку он сочетает рестрикционное расщепление и ПЦР.
3. Является многолокусной системой, так как праймеры одновременно связываются со многими различными частями генома, что приводит к выявлению многих локусов [Arif et al., 2011].
Недостатки AFLP:
1. Требует больше ДНК (300-1000 нг на реакцию) и является более технически сложным методом, однако может быть автоматизирован [Romero, Adeva, 2007].
2. Требуется очищенная, высокомолекулярная ДНК.
3. Преобладание аллелей и возможная негомология перемещающихся фрагментов, принадлежащих разным локусам.
4. Из-за большого количества и разной интенсивности полос ДНК на комбинацию праймеров необходимо принять определенные строгие критерии в анализе [Vos et al., 1995].
Рис. 3. Общий вид AFLP-ПЦР.
Fig. 3. General view of AFLP-PCR.

Примером использования изучения генетической изменчивости с использованием AFLP-маркеров является работа [Teyer et al., 2009], в которой описывается изучение диких популяций агавы живородящей Agave angustifolia в пустыне, а именно изменчивости внутри и между природными популяциями. Маркеры AFLP широко применяются для филогенетического анализа и определения генетического разнообразия для сохранения исчезающих видов растений [Zawko et al., 2001, Ronikier et al., 2002]. AFLP-маркеры были также использованы как способ оценки родительского вклада в геном гибрида при искусственном скрещивании между Saxifraga cernua и S. sibirica. В результате проведенной работы было выяснено, что больший вклад был внесен S. cernua, чем с S. sibirica [Дышмакова (Dyshmakova), 2012]. AFLP-анализ проводился для оценки вариации ДНК у растений A. thaliana, регенерированных органогенезом из корней, при этом подвергли анализу пятьдесят одно регенерированное растение с использованием 12 комбинаций [Polanco, 2002].
Было идентифицировано 17 AFLP-маркеров, специфичных для мужских растений Humulus scandens. Эти AFLP-маркеры могут служить как новые молекулярные зонды, которые можно эффективно использовать для идентификации генетического пола H. scandens [Li et al., 2017]. Были выявлены AFLP-маркеры из шести популяций Rhazya stricta Кохат Платау (Kohat Plateau) и изучены их вариации как внутри, так и среди популяций. Обе группы маркеров выявили более низкую генетическую дифференциацию среди популяций и более высокую генетическую дифференциацию внутри популяций [Gilani et al., 2014]. Метод AFLP может быть использован не только для определения генетического полиморфизма, но и для разрешения вопросов по видовой дифференциации. К примеру, разделение на отдельные виды в роде Trapa (водяной орех) остается до сих пор неразрешенной задачей [Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2017]. Путем AFLP-анализа была подтверждена дифференциация китайских популяций водяного ореха в бассейне реки Янцзы на три вида T. quadrispinosa, T. japonica и T. bispinosa [Li et al., 2017].
SSR-анализ
SSR (Simple Sequence Repeats - простые повторяющиеся последовательности) или STR (Short Tandem Repeats - короткие тандемные повторы). Последняя аббревиатура методики применяется в области изучения животных и человека. Сокращение SSR этого вида анализа применяется для растений [Сулимова (Sulimova), 2004]. Одним из распространенных примеров микросателлита является повторение, представленной на формуле (1):
(СА) x n (1),
где n - переменная среди разных аллелей.
Эти маркеры часто дают высокий уровень меж- и внутривидового полиморфизма, особенно когда число тандемных повторов составляет 10 или больше [Queller et al., 1993]. Повторяющаяся последовательность часто бывает простой, состоящей из двух, трех или четырех нуклеотидов (ди-, три- и тетра-нуклеотидных повторов) и может повторяться многократно.
Микросателлиты могут быть амплифицированы для идентификации аллелей с помощью ПЦР с использованием уникальных последовательностей фланкирующих областей в качестве праймеров. Наиболее распространенным способом обнаружения микросателлитов является разработка ПЦР-праймеров, которые уникальны для одного локуса в геноме, и эта пара оснований локализована по обе стороны от повторяющейся части. Таким образом, одна пара ПЦР-праймеров будет производить продукты разного размера для каждого из разных микросателлитов (рис. 4). Продукты ПЦР разделяют либо обычным гель-электрофорезом, либо электрофорезом в капиллярном геле автоматического секвенатора.
Рис. 4. Общий вид SSR-ПЦР.
Fig. 4. General view of SSR-PCR.
Преимущества метода:
1. Универсальность маркеров, особенно для популяционного анализа.
2. Простата и быстрота в использовании.
3. Есть возможность применения для близкородственных видов [Jarne et al., 1996].
Недостатки метода:
1. Необходимость знания последовательности генома для того, чтобы подобрать специфичный праймер [Blouin et al., 1996; Palombi, Damiano, 2002].
2. Подбор корректно функционирующего праймера - кропотливая и дорогостоящая процедура.
3. При применении праймеров на близкородственных видах, процент усиления локусов обратно пропорционален генетической дистанции [Jarne et al., 1996].
SSR-маркеры широко используются при генетических исследованиях дикорастущих растений. К примеру, в одном исследовании были использованы SSR-маркеры для определения генетической структуры ели Abies ziyuanensis [Tang et al., 2007]. Семь популяций, состоящих из 139 особей, были отобраны по всему их ареалу. Оказалось, что A. ziyuanenesis имеет относительно низкий уровень генетической изменчивости со средним генетическим разнообразием на популяцию (He) 0,377 (SSR), которая ниже, чем у других эндемичных видов, исследованных на основе одного того же маркера. Для генетического анализа заразихи Orobanche cumana Wallr. было отобрано 10 SSR-праймеров, которые могут быть использованы для оценки меж- и внутрипопуляционной изменчивости данного паразита [Гучетль и др. (Guchetl et al.), 2013]. Для генетического анализа кок-сагыза (Taraxacum kok-saghyz) на основе 16441 EST (от Expressed Sequence Tag) были подобраны 192 пары праймеров, из которых 48 подошли для определения однолокусного полиморфизма [McAssey et al., 2016]. Теоретически наиболее надежные 17 пар праймеров были использованы для анализа 176 растений кок-сагыза из 17 популяций. Причем данные праймеры оказались эффективными и при анализе других видов рода Taraxacum [McAssey et al., 2016; Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018а].
Были также подобраны SSR-праймеры для сосны обыкновенной, двадцать четыре микросателлитных локуса из тридцати семи предложенных ранее показали стабильную амплификацию, причем данные маркеры относятся к типу EST-SSR, так как эти микросателлиты располагаются в транскрибируемой области генома [Калько (Kalko), 2017]. Другим примером схожей работы является исследование EST-SSR маркеров пачули Pogostemon cablin, однако в данном случае для их поиска и дальнейшего подбора праймеров использовались данные полногеномного секвенирования транскриптома этого растения. Причем авторам этой работы удалось идентифицировать 1144 EST-SSR локуса, были подобраны 192 пары праймеров и при исследовании 38 образцов из разных районов произрастания 45 EST-SSR оказались полиморфными и имели аллельные вариации от двух до четырех [Ouyang et al., 2018]. Такой же подход был использован для поиска SSR-локусов для лекарственного растения Halenia elliptica. Авторы данной работы испытали 126 пар праймеров, из которых 12 показывали полиморфизм при изучении 8 популяций данного вида [Yang et al., 2018]. Подобная работа была также проведена для Astragalus membranaceus, при этом авторам удалось сконструировать 19 пар праймеров, которые выявляли полиморфизм среди 20 растений, собранных из разных местообитаний [He et al., 2018].
Осока Carex rigescens является дикорастущим растением, которое распространенно в засоленных районах Китая. Уровень экспрессии генов, кодирующих домены EF-hand, ZFP и AP2 у этого растения изменялся под влиянием солевого стресса, что свидетельствовало об их возможной связи с солеустойчивостью в C. rigescens. В работе Ming-na с соавт. [2018] было идентифицировано 11643 простых повторяющихся последовательностей (SSR) в уникальных генах, ассоциированных с солеустойчивостью. В общей сложности 144 SSR-локуса успешно амплифицировались в двух линиях C. rigescens и отражали полиморфизм между двумя проверенными генотипами [Ming-na et al., 2018].
Indigofera szechuensis является эндемичным видом для гор Hengduan в Китае. Его ареал ограничивается склонами, тропами и берегами рек. Этот вид может служить моделью для изучения адаптации растений. Были обнаружены последовательности транскриптов и разработаны EST-SSR маркеры для эволюционного изучения этого вида растений. Было определено 4052 потенциальных сайтов SSR. Использовав 102 случайно выбранных EST-SSRs, 73 маркера были успешно амплифицированы с ожидаемым размером в I. szechuensis и 67-71 маркеров SSRs у восьми других видов рода Indigofera [Li-Na et al., 2016]. Из недавно опубликованных статей следует упомянуть работу по изучению 27 микросателлитных локусов редкого кустарника Amentotaxus argotaenia (Taxaceae), из которых 23 оказались полиморфными, а 18 из них вполне применимыми на близком виде A. yunnanensis [Huang et al., 2018].
IRAP-анализ
Генетические маркеры, основанные на использовании ретротранспозонов, обладают хорошей воспроизводимостью результатов и достаточным полиморфизмом, недорогой стоимостью и меньшей трудоемкостью анализа по сравнению с другими высокоинформативными маркерными системами; их многочисленные преимущества дают возможности для использования этих маркеров в исследованиях растений [Мельникова (Melnikova), 2013]. IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) основан на обнаружении полиморфизма путем амплификации участка ДНК между двумя ретротранспозонами [Kalendar et al., 1999; Kalendar, Schulman, 2006].
IRAP можно проводить с помощью одного праймера, соответствующего либо 5'-, либо 3'-концу LTR (длинные концевые повторы ретротранспозонов), но ориентированного от самого LTR, или с двумя праймерами (рис. 5).
Рис. 5. Общий вид IRAP-ПЦР.
Fig. 5. General view of IRAP-PCR.
Увеличивается диапазон инструментов, доступных для обнаружения полиморфизма, который зависит от комбинации метода и праймера. Если используются два праймера, они могут быть из одного семейства ретротранспозонов или из разных семейств. Продукты ПЦР и, следовательно, фингерпринтов являются результатом амплификации от сотен до тысяч целевых сайтов в геноме.
Основным преимуществом IRAP является экспериментальная простота. Недостатком IRAP является необходимость знаний о последовательности генома.
Метод ПЦР с IRAP-маркерами также получил довольно широкое распространение при генетическом анализе дикорастущих растений. К примеру, были получены данные об уровне генетического разнообразия мятлика лугового Poa pratensis, произрастающего на экспериментальных нефтезагрязненных площадках, при этом снижение генетического разнообразия растений, произрастающих в условиях нефтяного загрязнения почв, с давностью загрязнения в 9 и 12 лет, не подтвердилось [Девятова (Devyatova), 2011].
IRAP-методом изучили полиморфизм ДНК и оценили генетическое разнообразие по 127 выявленным маркерам у шести популяций лекарственного вида Adonis vernalis, который является редким для Пермского края [Боронникова (Boronnikova), 2009]. Методика генетической паспортизации бубенчика лилиелистного Adenophora lilifolia на основе IRAP-анализа дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации [Боронникова (Boronnikova), 2012]. IRAP-анализ также применяли при изучении межвидовых взаимоотношений в подсемействе Betuloideae [Roy et al., 2018], генетического разнообразия и динамики популяций пяти лекарственных видов растений рода Eulophia [Bhattacharyya, van Staden, 2018], марокканского дерева Argania spinosa [Pakhrou et al., 2017], маниока Manihot esculenta [Kuhn et al., 2016], диких видов фисташки Pistacia [Sorkheh et al., 2016].
REMAP-анализ
REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) - полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR-ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (SSR-праймер). Является улучшенной версией IRAP. В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона "заякоривается" путем использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5'-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) c единичным селективным нуклеотидом на 3'-конце праймера. В REMAP применяют варианты праймеров как для 5'-конца, так и для 3'-конца LTR. Последовательности праймеров к LTR подбираются из консервативных и концевых участков LTR. Большинство LTR на 5' и 3'-концах имеют консервативные последовательности, необходимые для ретротранспозиции (перемещения на другие участки генома). В основном праймеры подбираются к концам LTR таким образом, чтобы амплифицированные продукты были достаточно удобны для ПЦР и электрофореза (рис. 6). Возможно использовать праймеры к различным консервативным участкам LTR или центральной, кодирующей части ретротранспозона, поскольку в геномах присутствует большое количество неполноценных ретротранспозонных последовательностей, образованных, в частности, вследствие рекомбинации геномной ДНК [Kalendar et al., 1999, 2006].
Рис. 6. Общий вид REMAP-ПЦР.
Fig. 6. General view of REMAP-PCR.
В зависимости от того, праймеры REMAP используются индивидуально или в комбинации, полосы на электрофорезе получаются разными по размеру, что указывает на то, что большинство ДНК-фрагментов получены из последовательностей, граничащих с микросателлитом с одной стороны, и LTR - с другой (рис. 6).
Преимущества REMAP:
1. Относительная простота и потенциально очень большое количество комбинаций праймеров из различных ретротранспозонов и микросателлитов.
2. Потенциальная информативность (количество локусов и их полиморфизм) очень велика, потому что в геномах растений и животных выявляют большее количество ретротрапозонов [Kalendar et al., 1999, 2006].
3. Не требует ни расщепления рестрикционными ферментами, ни лигирования для создания маркерных полос.
Недостатки REMAP:
1. Необходимость в информации о ретротранспозонной последовательности в анализируемом геноме.
2. Вероятность появления индивидуальных особенностей в расположении ретротранспозонов в зависимости не только от генотипа, но и внешних условий.
Примеров использования REMAP-анализа в растительной биологии довольно много. Как и в случае с другими растениями дикие виды миндаля Prunus могут служить материалом для генетической изменчивости культурных сортов. Было проанализировано 389 образцов 18 видов дикого миндаля с использованием разных маркеров. Наиболее предпочтительным оказался REMAP-маркер, который позволял выявлять Ty3- и Ty1-элементы в геноме миндаля. Поскольку транспонируемые элементы связаны с крупномасштабными изменениями генома, REMAP позволяет делать более надежные филогенетические выводы, чем AFLP, при котором гомоплазия может оказывать существенное влияние на кластеризацию [Sorkheh et al., 2017].
194 зародыша имбиря лекарственного (Zingiber officinale) были проанализированы с помощью 7 ISSR, 9 SSR, 6 IRAP-пар и 25 комбинаций праймеров REMAP. Разрешающая способность и индекс маркера были оценены максимальные в REMAP (5.24 и 4.18). Был сделан вывод, что REMAP и SSR являются маркерами выбора в оценке генетического разнообразия у имбиря [Pandotra et al., 2015].
Лилия ланцетолистная Lilium lancifolium в природе представлена, как диплоидными, так и триплоидными формами. При помощи REMAP-анализа 55 популяций Кореи, Японии и Китая было показано что географическое, цитологическое и генетическое разделение этих популяций не было связано с плоидностью. Авторы делают вывод о том, что современные генетические вариации линий произошли до географической дифференциации диплоидов и триплоидов [Nguyen et al., 2016].
При помощи REMAP-анализа также проводят оценку стабильности генома при возникновении аллополиплоидов. Имеются предположения, что при образовании таких растений стабильность генома может нарушаться и при этом увеличивается число ретротранспозонов в геноме. К примеру, этим методом были проанализированы природные аллополиплоиды Spartina anglica, и было показано, что геном этих растений не претерпел существенных изменений после полиплоидизации [Baumel et al., 2002].
SSAP, R-BIP, TAM, ISBP
SSAP (Sequence-Specific Amplified Polymorphism) метод основан на амплификации ДНК между консервативным участком ретротранспозона (в частности, LTR-последовательностью) и ближайшим сайтом рестрикции эндонуклеазы рестрикции. Праймеры для амплификации подбираются к консервативной последовательности ретротранспозона и к специальному адаптеру, который лигируется к образованному под действием эндонуклеазы рестрикции концу ДНК [Waugh et al., 1997]. SSAP-анализ использовался, к примеру, для оценки генетического полиморфизма 18 видов дикого миндаля [Sorkheh et al., 2017], представителей рода Aegilops [Nagy et al., 2006], для исследований видообразования арктической горчицы Draba nivalis [Gustafsson et al., 2014], для оценки реструктуризации генома в четырех независимых аллотетраполиплоидных генотипах Aegilops [Senerchia et al., 2014].
Следующий метод, который основан на существовании полиморфных сайтов интеграции ретротранспозонов, является R-BIP (Retrotransposon-Based Insertional Polymorphism). Этот метод, который позволяет отличить гомозиготы от гетерозигот, основан на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов. Он дает возможность исследовать кодоминантные аллельные варианты [Flavell et al., 1998]. Принцип метода основан на мультилокусной ПЦР, в которой используется пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до сайта ретротранспозиции, и праймер к LTR-ретротранспозону, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амплифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса. Для повышения эффективности этого метода детекция продуктов амплификации в геле была заменена на визуализацию на микрочипе [Flavell et al., 1998; Jing et al., 2007]. Такая технология получила название TAM (Tagged Microarray Marker).
Преимущества R-BIP:
1. Кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для анализа большого количества популяций.
2. Удобен для анализа гетерозиготных популяций, так как будут амплифицироваться оба аллеля данного локуса.
Недостатки R-BIP:
1. Необходимо клонирование и секвенирование последовательностей участка ДНК до и после сайта ретротранспозиции.
2. Дорог и трудоемок [Flavell et al., 1998; Календарь, Глазко (Kalendar, Glazko), 2002].
В методе ISBP (Insertion Site-Based Polymorphism) амплифицируется участок ДНК между ретротранспозоном и фланкирующей его последовательностью, но применяется лишь пара праймеров, а произошедшая амплификация означает наличие ретротранспозона в анализируемом сайте [Paux et al., 2010].
Была разработана более чувствительная молекулярно-маркерная система SSAP для редкого растения Eryngium maritimum. Шесть Ty-транспозонов с длинным терминалом Ty1-copia были выделены из генома E. maritimum (Tem1-Tem6) и оценены на предмет их полезности в качестве молекулярных маркеров у этого вида. Два ретротранспозона - Tem2 и Tem5 - были признаны наиболее информативными в зависимости от уровня полиморфизма и качества проводимого SSAP. Данное исследование показало эффективность SSAP-анализа для оценки генетического разнообразия E. maritimum [Ievina et al., 2010].
Методом ISBP-анализа были продемонстрированы внутривидовые полиморфизмы инсерций Mariner-подобных транспозируемых элементов Vulmar/VulMITE в секции Beta (свекла) подсемейства Betoideae, которые, вероятно, являются следствием их недавней активности. Напротив, никаких уникальных вставок транспозируемых элементов не наблюдалось для видов рода Beta секции Corollinae, тогда как набор специфических вставок наблюдался в роде Patellifolia, однако только два из них были полиморфными между P. procumbens и P. webbiana [Grzebelus et al., 2011]. Авторы предполагают, что транспозируемые элементы Vulmar и VulMITE инактивировались в секции Corollinae, но остались активными в секции Beta и у рода Patellifolia. Таким образом, ISBP-маркеры тоже могут успешно применяться для филогенетических исследований.
SNP-анализ
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм, самая распространенная маркерная система, используемая как при исследовании геномов животных, так и растений. Имея двоичный или кодоминантный статус, они могут помочь эффективно различать гомозиготные и гетерозиготные аллели. Более того, в отличие от микросателлитов их эффективность обуславливается не количеством аллелей, а множеством локусов, которые можно оценить [Foster et al., 2010].
За последние годы большое количество разнообразных SNP технологий были разработаны на основе различных методов распознавания аллелей и платформ обнаружения. Большинство анализов SNP генотипирования, на основе молекулярного механизма, относят к одной из четырех групп: аллель-специфическая гибридизация, удлинение праймера, лигирование олигонуклеотидных зондов и инвазивное расщепление олигонуклеотидного зонда. Есть несколько методов обнаружения для анализа продуктов каждого типа реакция (флуоресценция, люминесценция, измерение массы и т.д.). Существуют два разных подхода, связанные с форматом анализа: однородная реакция, когда они проводятся в растворе, и реакция на твердой подложке, такой как стеклянная плоская поверхность, чип, шарик и т.д. [Sobrino et al., 2005].
Преимущества SNP:
1. Поддаются автоматизации с возможностью масштабирования, что позволяет быстро и эффективно исследовать большое количество образцов [Tsuchihashi, 2002].
2. Маркеры продолжают работать даже с чрезвычайно деградированными молекулами ДНК.
Недостатки SNP:
1. Ограничение возможности мультиплексирования [Beatriz Sobrino et al., 2005].
2. Сложная интерпретация результатов.
3. Технология SNP остается дорогостоящей.
Появление ДНК-секвенирования нового поколения и высоконадежных SNP-генотипирующих платформ позволяет разрабатывать высокоэффективные маркеры для генетического анализа популяций. Например, была создана SNP-платформа высокой плотности для генетического анализа многолетнего райграса (Lolium perenne) и ее эффективность подтверждена в широкой коллекции экотипов из 716 особей, отобранных из 90 местообитаний по всей Европе [Blackmore et al., 2015]. Была разработана SNP-платформа для выявления генотипов с важнейшими количественными признаками у китайского каштана. Данная платформа содержит 2620 SNP-маркеров и была разработана на основе анализа результатов полногеномного секвенирования двух наиболее сильно различающихся генотипов китайского каштана [Ji et al., 2018]. Было проведено фенотипирование 64 линий норвежской ели на предмет восприимчивости их к грибу Heterobasidion parviporum, дальнейшее их генотипирование привело к выявлению 10 SNP, расположенных в 8 генах, ассоциированных с образованием большего некротического пятна при грибной инфекции. Авторы предлагают использовать выявленные ими SNP-маркеры для скрининга восприимчивых и устойчивых деревьев [Mukrimin et al., 2018]. Необходимо отметить, что работ по SNP-генотипированию культивируемых человеком растений проводится гораздо больше, чем для дикорастущих форм, что, видимо, связано с дороговизной данных исследований.
Секвенирование и сравнение вариабельных участков хлоропластногно и ядерного геномов
При генетическом анализе дикорастущих растений на первый план довольно часто выходит видоидентификация, а не определение внутривидового полиморфизма, как в случае с культурными растениями. Точное определение вида растения необходимо как при хозяйственном и медицинском использовании растений, так и при фундаментальных исследованиях. Большинство ДНК-маркеров, рассмотренных выше, применяются в первую очередь для выявления генетического полиморфизма, тогда как для видовой идентификации предпочтительно применять метод секвенирования таксономически значимых участков ДНК. При этом методы выявления генетического полиморфизма также используются для видоидентификации, но чаще в качестве вспомогательного средства. Основным требованием к эталонному участку ДНК для секвенирования является то, что он должен быть одинаковым у особей одного вида и достоверно различаться у особей разных видов. При этом количество полиморфных позиций нуклеотидов у особей одного и того же вида не должно превышать 1% [Матвеева и др. (Matveeva et al.), 2011]. Наиболее широкое распространение получили хлоропластные маркеры, такие как гены rpoB, rpoC1, rbcL, matK и межгенные спейсеры psbK-psbI, trnH-psbA, atpF-atpH. Из ядерных последовательностей наиболее известны внутренние транскрибируемые спейсеры рибосомных генов: ITS1 расположенный между генами 18S и 5,8S РНК, а также ITS2, расположенный между генами 5,8S и 28S РНК (табл. 3).
Пожалуй, наиболее популярным хлоропластным маркером в филогенетических исследованиях растений является ген matK. К примеру, были секвенированы гены matK у 48 изолятов Dasiphora fruticosa (пятилистник кустарниковый) и построено филогенетическое древо растений этого вида из Монголии [Еруулт и др. (Eruult et al.), 2013]. Имеются сведения, что ген matK не может быть использован в филогенетических исследованиях близких видов, так как данный участок в этом случае становится малоинформативным [Dizkirici et al., 2016]. К примеру, последовательности гена matK у всех четырех видов диких диплоидных пшениц оказались идентичны [Golovnina et al., 2007]. Huang с соавт. [2002] изучая пластидные гены Acc-1 и Pgk-1, которые кодируют белки ацетил-CoA карбоксилазу и 3-фосфоглицераткиназу, соответственно, выяснили, что хлоропластные геномы Ae. speltoides и T. aestivum тесно связаны. Также, к T. aestivum оказался близок по этим генам T. urartu.
Таблица 3.
Некоторые хлоропластные и ядерные маркеры, применяемые для секвенирования при филогенетических исследованиях дикорастущих растений [по Taberlet et al., 1991; Olmstead, Sweere, 1994; Матвеевой и др. (Matveeva et al.), 2011; Prince, 2015].
Table 3. Some chloroplast and nuclear markers using for sequencing in phylogenetic studies of wild plants [Taberlet et al., 1991; Olmstead, Sweere, 1994; Matveeva et al., 2011; Prince, 2015].
Маркер
Marker
Описание
Description
matK
Хлоропластный, кодирует матуразу К
Chloroplast, encodes maturase K
rbcL
Хлоропластный, ген большой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы
Chloroplast, gene of large subunit of ribulose bisphosphate carboxylase
rpoB
Хлоропластный, ген --субъединицы РНК-полимеразы
Chloroplast, --subunit gene of RNA polymerase
rpoC1
psbK-psbI
Хлоропластный, спейсер генов кодирующих компоненты фотосистемы II
Chloroplast, spacer of genes encoding components of photosystem II
trnH-psbA
Хлоропластный, спейсер между генами гистидиновой транспортной РНК и геном, контролирующим синтез белка D1 фотосистемы II
Chloroplast, spacer between the genes of histidine transfer RNA and the gene controlling the synthesis of D1 protein of photosystem II
atpF-atpH
Хлоропластный, спейсер между генами, кодирующими субъединицы АТФ-синтазы
Chloroplast, spacer between genes encoding ATP synthase subunits
ndhF
Хлоропластный, ген субъединицы никотинамиддегидрогеназы
Chloroplast, nicotinamide dehydrogenase subunit gene
rpS4-trnT
Хлоропластный, спейсер между геном рибосомального белка 4 малой субъединицы и треониновой транспортной РНК
Chloroplast, spacer between the gene of the ribosomal protein 4 of the small subunit and threonine transfer RNA
trnL-trnF
Хлоропластный, вариабельный участок между генами транспортных РНК лейцина и фенилаланина, включая интрон гена trnL
Chloroplast, variable region between the genes for the transfer RNA of leucine and phenylalanine, including the intron of the trnL gene
ITS
Внутренний транскрибируемый спейсер, локализованный между генами 18S-26S рРНК, включает ITS1, 5,8S, ITS2
Internal transcribed spacer localized between 18S-26S rRNA genes includes ITS1, 5.8S, ITS2
Из ядерных последовательностей весьма популярен ITS1. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 18S рРНК представителей рода Veronica высказано предположение о гибридном происхождении однолетников V. tenuis и V. аnagalloides от многолетников [Пантюхина и др. (Pantyukhina et al.), 2012]. В большинстве исследований дикорастущих растений применялось одновременно несколько ДНК-маркеров, что способствовало увеличению достоверности полученных данных, особенно при использовании как хлоропластного, так и ядерного маркера. К примеру, было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей гена matK и ITS видов рода Sedum (очиток), который показал, что виды этого рода в большинстве относятся к кладам Acre и Leucosedum [Никулин, Гончаров, (Nikulin, Goncharov), 2017]. Было проведено молекулярно-филогенетическое исследование рода Ononis (стальник) путем сравнения нуклеотидных последовательностей ITS, rbcL и matK. Анализ показал, что вид O. pusilla имеет самостоятельный видовой статус и относится к подсекции Bugranoides. Виды O. arvensis, O. spinosa и O. repens относятся к подсекции Acanthononis [Лужанин и др. (Luzhanin et al.), 2013]. Показана эффективность использования маркеров rbcL и trnL-F для филогенетических исследований семейства Лютиковые [Евдокимов (Evdokimov), 2017]. Путем анализа генов rbcL, cpcA, cpcB, psaA, atpB фитопланктонных организмов выявлена их неспецифическая реакция в филогенезе на органическое загрязнение водоема [Фролова и др. (Frolova et al.), 2012]. Примером одновременного использования большого количества ДНК-маркеров является также исследование состояния двух реликтовых видов растений Anemone baicalensis и Eranthis sibirica во флоре Байкальской Сибири, где был проведен анализ нуклеотидных последовательностей ITS1, ITS2, rps12-rpl20, psbA-trnH [Протопопова и др. (Protopopova et al.), 2015]. Для уточнения и подтверждения результатов анализа нуклеотидных последовательностей ITS могут быть использованы описанные выше методы ДНК-фингерпринтинга, к примеру, RAPD-анализ [Андреев и др. (Andreev et al.), 2010].
Таким образом, для молекулярно-филогенетического анализа используется большое количество вариабельных участков генома, и следовательно для специалистов в этой области существует проблема выбора оптимального ДНК-маркера. Целенаправленные поиски таких "счастливых генов" тоже ведутся, и, например, был проведен компьютерный эксперимент по анализу 41 полного хлоропластного генома цветковых растений. Было показано, что филогенетическое древо, построенное на основе объединения транслированных нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих субъединицы пластидной РНК-полимеразы, является наиболее близким к дереву, построенному с использованием всех белок-кодирующих участков хлоропластного генома [Логачева и др. (Logacheva et al.), 2007]. При этом для генетического анализа желательно использовать одновременно несколько генов, кодирующих субъединицы пластидной РНК-полимеразы - rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2. Кроме универсальных для всех цветковых растений ДНК-маркеров, разрабатываются также праймеры для анализа определенных групп растений. Например, для филогенетического анализа пшениц использовали гены Waxy [Li et al., 2012] и гистона H3 [Kanazin et al., 1996; Кулуев и др. (Kuluev et al.), 2018c]. В филогенетических исследованиях пшенициевых также используются промоторные области рДНК. Например, в работе Вахитова с соавт. [2003] исследуются укороченные спейсеры ряда видов пшениц и эгилопсов, а также аналогичные участки межгенных спейсеров рРНК мягкой пшеницы локусов NorB2 и NorD3.
Заключение
Все многообразие технологий генетического анализа дикорастущих растений на сегодняшний день преимущественно основано лишь на трех базовых методах молекулярной биологии: ПЦР, ДНК-чипы и секвенирование. У каждой из этих групп методов есть свои преимущества и недостатки. Методы ПЦР не всегда отвечают сегодняшним требованиям, но продолжают привлекать своей дешевизной и простотой, но при видоидентификации эти методы могут выполнять лишь вспомогательную роль. Довольно полезна эта группа методов для оценки генетического полиморфизма, однако даже по данному критерию ПЦР сильно уступает методам ДНК-чипирования SNP. Связано это с тем, что методом ДНК-чипирования можно выявлять на порядки больше снипов, которых в популяциях великое множество. Еще большее число снипов могло бы быть выявлено при помощи полногеномного секвенирования, однако этот метод пока остается дорогостоящим и трудоемким и потому недоступным для многих лабораторий. Анализ литературы за последние два года показывает, что методы SNP-анализа дикорастущих растений превалируют над методами ПЦР (рис. 7). Вероятнее всего, в ближайшее время доля SNP-анализа для изучения генетического полиморфизма растений будет только расти.
Рис. 7. Число публикаций по использованию ДНК-маркеров основанных на ПЦР и на ДНК-чипах по базе данных PubMed за 2017-2018 гг. (Поиск публикаций велся путем ввода в поисковую строку: REMAP/IRAP/RAPD/AFLP/SSR/SNP AND Plant AND 2017/2018).
Fig. 7. The number of publications on the use of DNA markers based on PCR and DNA microarray in the PubMed database for 2017-2018. (The search of publications was conducted by entering into the search box: REMAP/IRAP/RAPD/AFLP/SSR/SNP AND Plant AND 2017/2018).
Для видоидентификации растений в ближайшем будущем будут продолжать применять методы секвенирования отдельных локусов ДНК. Ранее были проведены многочисленные исследования "счастливых генов" как хлоропластного, так и ядерного геномов, однако таких универсальных для всех групп растений генов пока не обнаружено. Поэтому филогенетические исследования растений обычно ведут сразу по нескольким ДНК-маркерам, что позволяет в сочетании со всеми другими методами биологии растений приблизиться к решению проблемы точной видоидентификации. В обозримом будущем стандартным методом точного определения вида растений также может стать полногеномное секвенирование. Таким образом, новейшие методы секвенирования могут помочь решать одновременно две проблемы генетики растений: видоидентификацию и оценку внутривидового генетического полиморфизма. Однако, несмотря на разработку все новых методов генетического анализа растений при видоидентификации необходимо учитывать и остальные критерии вида: морфологический, экологический, географический и другие.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз