Рост штамма Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора
Авторы:
Название:
Рост штамма Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора
Страницы:
286-289
Inoculation of A. niger AM1 in medium containing just two sources of phosphorus (phosphate and white phosphorus) demonstrated that P4 in a concentration of 0.2% does not exhibit toxic properties in relation to this microorganism. In the presence of white phosphorus it grows at the same rate as in the absence thereof. Comparison of sequences of ribosomal genes of fungi with those in the GenBank database, allowed us to identify this microorganism as a new strain of Aspergillus niger, which we assigned a designation A. niger АМ1. To compare the conversion of white phosphorus in the presence and absence of microbial culture A. niger AM1 were sown in a medium with white phosphorus, sterilized with acetone. The sowing was performed in a test, the control medium with white phosphorus left sterile. In control media no growth was detected in 117 days. This indicates that the sterilization of P4 weighs with acetone is effective.
Биодеградация - известный метод обезвреживания промышленных стоков, уже широко внедренный в практику. Она имеет глубокую фундаментальную основу, заключающуюся в громадном разнообразии видов и форм микроорганизмов, встречающихся в природе, и скорости их непрерывной эволюции [Миндубаев (Mindubaev), 2018].
Наша предыдущая публикация [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2018] как раз посвящена микробиологическому превращению высоко токсичного элементного (белого) фосфора в биогенный фосфат. Фактически, выполненная нашим коллективом работа является первым задокументированным примером усвоения искусственного ксенобиотика белого фосфора биосферой. До сих пор мы сравнивали рост микроорганизмов в двух вариантах культуральных сред - с белым фосфором в качестве источника биогенного элемента фосфора, или с фосфатом.
Целью данной работы стало исследование роста черного аспергилла в среде, содержащей оба источника фосфора одновременно. Данное исследование проведено для того, чтобы отделить эффект токсичности белого фосфора от эффекта нехватки фосфора. Помимо этого, проведена генетическая идентификация выделенного нами Aspergillus niger и найден способ стерилизации навесок белого фосфора.
Посев был произведен аналогично описанным ранее [Миндубаев и др., 2018 (Mindubaev et al., 2018)]. Однако в этот раз эксперимент был усложнен. Культура A. niger АМ1 выращивалась в чашках Петри с подложкой из фильтровальной бумаги на поверхности агаризованной среды, как описано в работе [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2016]. При этом посев производился не в трех, а в четырех вариантах: модифицированная среда Придхем-Готлиба без источников фосфора; с фосфатом; с 0.2% белого фосфора; с 0.2% Р4; с фосфатом (в тех же концентрациях, что и во втором варианте - 0.0475 М или 0.15% в пересчете на чистый фосфор). Такая схема посева позволяет получить больше информации об экспрессии генов при росте в разных условиях. Все четыре варианта посева произведены в трех повторах.
Генетический анализ проводился следующим образом. Образцы ДНК из культуры гриба A. niger АМ1 выделялись по методике, описанной в [Sambrook, Russell, 2001]. Далее проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР) полученных фрагментов ДНК.
Мы впервые применили стерилизацию белого фосфора ацетоном. В шленк с навеской белого фосфора (0.95 г) влили 20 мл ацетона и выдержали 15 мин при перемешивании (ручное взбалтывание) без нагрева. Слив ацетон и не дожидаясь его испарения, влили в шленк 50 мл дистиллированной воды, стерилизованной автоклавированием. Затем приготовили 2% эмульсию белого фосфора в этой воде (ультразвуковая ванна Сапфир (Россия), 30 мин, 50°С, аргон). Поскольку в низких концентрациях ацетон легко усваивается микроорганизмами в качестве источника углерода [Hausinger, 2007], переходя далее к процедуре эмульгирования белого фосфора ультразвуком, мы не стремились удалять остатки ацетона из шленка с навеской.
Чрезвычайно интересный результат показал посев A. niger АМ1 в среду, содержащую одновременно фосфат и белый фосфор. Ранее нами не проводились подобные эксперименты. Результат этого посева показал, что данный штамм не только устойчив к высоким концентрациям белого фосфора. Белый фосфор, по крайней мере, в концентрации 0.2%, для него вообще нетоксичен! Используя в качестве источника фосфора легкодоступный растворенный фосфат, гриб растет в присутствии белого фосфора с такой же скоростью, как и в его отсутствии. Это не артефакт, не ошибка эксперимента, поскольку рост колоний других видов в тех же условиях белый фосфор подавляет.
Если вспомнить о том, что A. niger АМ1 изначально был выделен из химического реактива белого фосфора, вместе с которым он был случайно внесен в среду, то вполне возможно, что устойчивость у него возникла длительное время назад, еще до начала наших работ. Исследуя рост микроорганизмов в средах, содержащих белый фосфор, но лишенных фосфата, мы непременно сталкивались с вопросом изменения рН данных сред в процессе развития микроорганизмов и детоксикации Р4. Окисление белого фосфора неизбежно приводит к образованию кислот и росту кислотности, особенно заметному в отсутствии фосфатного буфера. Соли фосфорной кислоты в культуральных средах выполняют не только роль источника фосфора, но и роль буфера, гасящего колебания рН. Водные растворы дигидрофосфатов имеют кислую реакцию (pKa1 = 2,1), гидрофосфатов - близкую к нейтральной (pKa2 = 7,2), незамещенных фосфатов - сильнощелочную (pKa3 = 12,7) [Engelking, 2015]. Именно поэтому фосфорная подкормка во все применяемые в настоящее время культуральные среды вносится в виде точно рассчитанного соотношения гидрофосфата и дигидрофосфата. Даже с этой точки зрения посев в среду, содержащую сразу два источника фосфора - классическая смесь гидрофосфата и дигидрофосфата, и белый фосфор, вызывает большой интерес.
На 12 сутки после посева A. niger АМ1 в четырех вариантах среды наблюдалась следующая картина (рис. 1). В средах без источников фосфора рост практически не наблюдается (одна-две крошечные колонии без спороношения на чашку) (рис. 1, ряд крайний справа). В средах с фосфатом аспергилл хорошо растет и спороносит, однако культура не чистая, помимо черных колоний аспергилла присутствуют колонии других микроорганизмов (рис. 1, ряд второй справа). В средах с 0.2% белого фосфора колонии аспергилла имеют бледно-серый цвет (пониженная фертильность) (рис. 1, ряд второй слева). Очень интересный результат показал четвертый вариант посева - с белым фосфором и фосфатом (рис. 1, ряд крайний слева). Колонии растут очень хорошо, даже более развитые, чем в среде с фосфатом, причем в двух случаях из трех выросла чистая культура (в одном появилась колония неизвестного вида). То есть медленный рост аспергилла в среде с белым фосфором объясняется не токсичностью последнего для данного штамма, а исключительно его труднодоступностью как источника фосфора! Возможно, играют роль и упомянутые выше буферные свойства фосфата. Р4, судя по всему, нетоксичен для данного гриба [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2016]. А конкуренция с другими видами сильнее тормозит рост (как видно на рис. 1), чем присутствие белого фосфора.
Рис. 1. Первый пересев устойчивых A. niger АМ1
на четыре варианта среды. Ряд крайний справа - среда без источников фосфора; второй справа -
с фосфатом; второй слева - с белым фосфором (0.2%) и крайний слева - с 0.2% Р4 и фосфатом. Пояснения в тексте. Снимок сделан через 11 суток после посева.
Fig. 1. First reinoculation of resistant A. niger AM1
in four different mediums. The vertical row far right is
a medium without phosphorus sources; second row
from the right - with the phosphate; second from the
left - with white phosphorus (0.2%) and far left -
with 0.2% phosphate and P4. Explanations in the text. The picture was taken 11 days after inoculation
Следует отметить, что на 14 сутки после посева стал наблюдаться рост аспергилла и в среде без источников фосфора, за счет очень незначительного количества фосфата, присутствовавшего в агаре.
В процессе отмывания бумажных фильтров с биомассой аспергиллов в деионизованной воде через 34 суток после посева, стало ясно, что A. niger АМ1 интенсивно разлагает целлюлозу, по всей видимости, являясь продуцентом целлюлаз [Kassim, 1982]. Фильтры легко крошатся (особенно в тех случаях, когда гриб на них интенсивно рос), в некоторых случаях даже наблюдалось частичное растворение в воде с образованием студнеобразной массы, нехарактерное для нативной целлюлозы.
Для генетической идентификации гриба, устойчиво метаболизирующего белый фосфор и по морфологическим признакам отнесенного к виду A. niger, была определена нуклеотидная последовательность регионов ITS1 и ITS2 Сравнение полученной последовательности с последовательностями базы данных GenBank с помощью системы BLAST, выявила 99% гомологию с ITS1 и ITS2 регионами описанных штаммов Aspergillus niger, что позволяет идентифицировать данный микроорганизм, как новый штамм Aspergillus niger. Ему мы присвоили номер A. niger АМ1. Нуклеотидная последовательность штамма зарегистрирована в международной базе данных GenBank, где ей присвоен номер KT805426 [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2015].
Одной из серьезнейших проблем, с которой мы до сих пор сталкивались, производя посевы микроорганизмов на среды с белым фосфором, было отсутствие эффективного метода стерилизации. Стерилизация автоклавированием при 120°С белого фосфора и содержащих его сред слишком опасна по причине агрессивности данного вещества. Стерилизация ультрафиолетом не годится из-за превращения белого фосфора в красный фосфор под действием высокоэнергетических квантов света. В опыте по стерилизации навески белого фосфора ацетоном в контрольных, стерильных средах рост микробиоты отсутствовал даже спустя 117 дней, они остались прозрачными без опалесценции и взвесей. Это указывает на то, что выбранный метод стерилизации эффективен.
Наша предыдущая публикация [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2018] как раз посвящена микробиологическому превращению высоко токсичного элементного (белого) фосфора в биогенный фосфат. Фактически, выполненная нашим коллективом работа является первым задокументированным примером усвоения искусственного ксенобиотика белого фосфора биосферой. До сих пор мы сравнивали рост микроорганизмов в двух вариантах культуральных сред - с белым фосфором в качестве источника биогенного элемента фосфора, или с фосфатом.
Целью данной работы стало исследование роста черного аспергилла в среде, содержащей оба источника фосфора одновременно. Данное исследование проведено для того, чтобы отделить эффект токсичности белого фосфора от эффекта нехватки фосфора. Помимо этого, проведена генетическая идентификация выделенного нами Aspergillus niger и найден способ стерилизации навесок белого фосфора.
Посев был произведен аналогично описанным ранее [Миндубаев и др., 2018 (Mindubaev et al., 2018)]. Однако в этот раз эксперимент был усложнен. Культура A. niger АМ1 выращивалась в чашках Петри с подложкой из фильтровальной бумаги на поверхности агаризованной среды, как описано в работе [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2016]. При этом посев производился не в трех, а в четырех вариантах: модифицированная среда Придхем-Готлиба без источников фосфора; с фосфатом; с 0.2% белого фосфора; с 0.2% Р4; с фосфатом (в тех же концентрациях, что и во втором варианте - 0.0475 М или 0.15% в пересчете на чистый фосфор). Такая схема посева позволяет получить больше информации об экспрессии генов при росте в разных условиях. Все четыре варианта посева произведены в трех повторах.
Генетический анализ проводился следующим образом. Образцы ДНК из культуры гриба A. niger АМ1 выделялись по методике, описанной в [Sambrook, Russell, 2001]. Далее проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР) полученных фрагментов ДНК.
Мы впервые применили стерилизацию белого фосфора ацетоном. В шленк с навеской белого фосфора (0.95 г) влили 20 мл ацетона и выдержали 15 мин при перемешивании (ручное взбалтывание) без нагрева. Слив ацетон и не дожидаясь его испарения, влили в шленк 50 мл дистиллированной воды, стерилизованной автоклавированием. Затем приготовили 2% эмульсию белого фосфора в этой воде (ультразвуковая ванна Сапфир (Россия), 30 мин, 50°С, аргон). Поскольку в низких концентрациях ацетон легко усваивается микроорганизмами в качестве источника углерода [Hausinger, 2007], переходя далее к процедуре эмульгирования белого фосфора ультразвуком, мы не стремились удалять остатки ацетона из шленка с навеской.
Чрезвычайно интересный результат показал посев A. niger АМ1 в среду, содержащую одновременно фосфат и белый фосфор. Ранее нами не проводились подобные эксперименты. Результат этого посева показал, что данный штамм не только устойчив к высоким концентрациям белого фосфора. Белый фосфор, по крайней мере, в концентрации 0.2%, для него вообще нетоксичен! Используя в качестве источника фосфора легкодоступный растворенный фосфат, гриб растет в присутствии белого фосфора с такой же скоростью, как и в его отсутствии. Это не артефакт, не ошибка эксперимента, поскольку рост колоний других видов в тех же условиях белый фосфор подавляет.
Если вспомнить о том, что A. niger АМ1 изначально был выделен из химического реактива белого фосфора, вместе с которым он был случайно внесен в среду, то вполне возможно, что устойчивость у него возникла длительное время назад, еще до начала наших работ. Исследуя рост микроорганизмов в средах, содержащих белый фосфор, но лишенных фосфата, мы непременно сталкивались с вопросом изменения рН данных сред в процессе развития микроорганизмов и детоксикации Р4. Окисление белого фосфора неизбежно приводит к образованию кислот и росту кислотности, особенно заметному в отсутствии фосфатного буфера. Соли фосфорной кислоты в культуральных средах выполняют не только роль источника фосфора, но и роль буфера, гасящего колебания рН. Водные растворы дигидрофосфатов имеют кислую реакцию (pKa1 = 2,1), гидрофосфатов - близкую к нейтральной (pKa2 = 7,2), незамещенных фосфатов - сильнощелочную (pKa3 = 12,7) [Engelking, 2015]. Именно поэтому фосфорная подкормка во все применяемые в настоящее время культуральные среды вносится в виде точно рассчитанного соотношения гидрофосфата и дигидрофосфата. Даже с этой точки зрения посев в среду, содержащую сразу два источника фосфора - классическая смесь гидрофосфата и дигидрофосфата, и белый фосфор, вызывает большой интерес.
На 12 сутки после посева A. niger АМ1 в четырех вариантах среды наблюдалась следующая картина (рис. 1). В средах без источников фосфора рост практически не наблюдается (одна-две крошечные колонии без спороношения на чашку) (рис. 1, ряд крайний справа). В средах с фосфатом аспергилл хорошо растет и спороносит, однако культура не чистая, помимо черных колоний аспергилла присутствуют колонии других микроорганизмов (рис. 1, ряд второй справа). В средах с 0.2% белого фосфора колонии аспергилла имеют бледно-серый цвет (пониженная фертильность) (рис. 1, ряд второй слева). Очень интересный результат показал четвертый вариант посева - с белым фосфором и фосфатом (рис. 1, ряд крайний слева). Колонии растут очень хорошо, даже более развитые, чем в среде с фосфатом, причем в двух случаях из трех выросла чистая культура (в одном появилась колония неизвестного вида). То есть медленный рост аспергилла в среде с белым фосфором объясняется не токсичностью последнего для данного штамма, а исключительно его труднодоступностью как источника фосфора! Возможно, играют роль и упомянутые выше буферные свойства фосфата. Р4, судя по всему, нетоксичен для данного гриба [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2016]. А конкуренция с другими видами сильнее тормозит рост (как видно на рис. 1), чем присутствие белого фосфора.
Рис. 1. Первый пересев устойчивых A. niger АМ1
на четыре варианта среды. Ряд крайний справа - среда без источников фосфора; второй справа -
с фосфатом; второй слева - с белым фосфором (0.2%) и крайний слева - с 0.2% Р4 и фосфатом. Пояснения в тексте. Снимок сделан через 11 суток после посева.
Fig. 1. First reinoculation of resistant A. niger AM1
in four different mediums. The vertical row far right is
a medium without phosphorus sources; second row
from the right - with the phosphate; second from the
left - with white phosphorus (0.2%) and far left -
with 0.2% phosphate and P4. Explanations in the text. The picture was taken 11 days after inoculation
Следует отметить, что на 14 сутки после посева стал наблюдаться рост аспергилла и в среде без источников фосфора, за счет очень незначительного количества фосфата, присутствовавшего в агаре.
В процессе отмывания бумажных фильтров с биомассой аспергиллов в деионизованной воде через 34 суток после посева, стало ясно, что A. niger АМ1 интенсивно разлагает целлюлозу, по всей видимости, являясь продуцентом целлюлаз [Kassim, 1982]. Фильтры легко крошатся (особенно в тех случаях, когда гриб на них интенсивно рос), в некоторых случаях даже наблюдалось частичное растворение в воде с образованием студнеобразной массы, нехарактерное для нативной целлюлозы.
Для генетической идентификации гриба, устойчиво метаболизирующего белый фосфор и по морфологическим признакам отнесенного к виду A. niger, была определена нуклеотидная последовательность регионов ITS1 и ITS2 Сравнение полученной последовательности с последовательностями базы данных GenBank с помощью системы BLAST, выявила 99% гомологию с ITS1 и ITS2 регионами описанных штаммов Aspergillus niger, что позволяет идентифицировать данный микроорганизм, как новый штамм Aspergillus niger. Ему мы присвоили номер A. niger АМ1. Нуклеотидная последовательность штамма зарегистрирована в международной базе данных GenBank, где ей присвоен номер KT805426 [Миндубаев и др. (Mindubaev et al.), 2015].
Одной из серьезнейших проблем, с которой мы до сих пор сталкивались, производя посевы микроорганизмов на среды с белым фосфором, было отсутствие эффективного метода стерилизации. Стерилизация автоклавированием при 120°С белого фосфора и содержащих его сред слишком опасна по причине агрессивности данного вещества. Стерилизация ультрафиолетом не годится из-за превращения белого фосфора в красный фосфор под действием высокоэнергетических квантов света. В опыте по стерилизации навески белого фосфора ацетоном в контрольных, стерильных средах рост микробиоты отсутствовал даже спустя 117 дней, они остались прозрачными без опалесценции и взвесей. Это указывает на то, что выбранный метод стерилизации эффективен.
- Миндубаев А.З. Кто съел полиэтилен- Наука и жизнь. 2018. № 4. С. 32-38. @@ Mindubaev A.Z. Kto s"el polietilen- Nauka i Zhizn. 2018. No. 4. P. 32-38. [Who ate the polyethylene- - In Russian].
- Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Сапармырадов К.А., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Хаяров Х.Р. Резистентность к белому фосфору грибов и стрептомицетов. Биомика. 2018. Т.10. № 2. С. 214-219. @@ Mindubaev A.Z., Voloshina A.D, Kulik N.V., Saparmyradov K.A., Minzanova S.T, Mironova L.G, Khayarov Kh.R. Resistance to white phosphorus of fungi and streptomycetes. Biomics. 2018. V.10(2). P. 214- 219. (In Russian)
- Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Белостоцкий Д.Е., Сапармырадов К.А., Тухбатова Р.И., Яхваров Д.Г. Адаптация микроорганизмов к белому фосфору, как результат направленной селекции. Генетическая идентификация устойчивого аспергилла и метаболическое профилирование стрептомицета А8. Бутлеровские сообщения. 2015. Т. 44. № 12. С.1-28. @@ Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Gorbachuk E.V., Validov S.Z., Kulik N.V., Alimova F.K., Minzanova S.T., Mironova L.G., Belostotskiy D.E., Saparmyradov K.A., Tukhbatova R.I., Yakhvarov D.G. Adaptation of microorganisms to white phosphorus as a result of directed selection. Genetic identification of sustainable Aspergillus and metabolic profiling of Streptomyces A8. Butlerov Communications. 2015. V. 44(12). P. 1-28. (In Russian).
- Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г., Аккизов А.Ю. Рост культуры Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора. Обоснованность определения "биодеградация" в отношении белого фосфора. Бутлеровские сообщения. 2016. Т. 46. № 5. С. 1-20. @@ Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Validov S.Z., Kulik N.V., Minzanova S.T., Mironova L.G., Yakhvarov D.G., Akkizov A.Y.. Aspergillus niger AM1 culture growth in medium with two phosphorus sources. The validity of the definition "biodegradation" with respect to white phosphorus. Butlerov Communications. 2016. V. 46(5). P. 1-20. (In Russian).
- Engelking L.R. Textbook of Veterinary Physiological Chemistry (Third Edition). Academic Press. 2015. 786 p. Chapter 85 - Bicarbonate, Phosphate, and Ammonia Buffer Systems. P.549-554.
- Hausinger R.P. New Insights into Acetone metabolism. J Bacteriol. 2007. Vol.189. No.3. P.671-673.
- Kassim E.-S.A. Cellulase Enzyme from Aspergillus niger. Microbiol. Immunol. 1982. Vol. 26. No.6. 449-454.
- Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1, 2, 3. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York. 2001. 2344 p.