Множественные функциональные формы гемоглобина в организме человека: современный взгляд и практическое использовани

Авторы:
Топунов А.Ф. , Космачевская О.В.
Название:
Множественные функциональные формы гемоглобина в организме человека: современный взгляд и практическое использовани
Страницы:
251-267
скачано
6 раз(а)


Рассматриваются основные функциональные формы эритроцитарного гемоглобина, обнаруживаемые в организме человека, в том числе окисленный гемоглобин и формы, возникающие при действии реакционно активных соединений в условиях окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов. Особое внимание уделено формам гемоглобина, которые до сих пор мало используются в медицинской практике (например, мембраносвязанный гемоглобин). Объясняется необходимость и возможность их практического применения в диагностике, в том числе в компьютерных диагностических системах.
Введение
Для диагностики многих болезней чрезвычайно информативными являются данные о состоянии гемоглобина и содержащих его эритроцитов, поскольку очень многие факторы способны влиять на это состояние, в том числе и вызывать нарушения в области гематологии. Cреди гематологичеcких заболеваний выделяют гемоглобинопатии (гемоглобинозы), к которым относят патологические состояния, обусловленные нарушением нормальной структуры и функционирования гемоглобина (Hb). Для выявления подобных заболеваний необходимо иметь информацию о гемоглобинах, синтезирующихся и функционирующих в организме человека, в том числе их модифицированные формы, возникающие в условиях окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов и при действии ряда токсических соединений.
Гемоглобин - гемопротеид, состоящий из простетической группы гема и белковой части (определенным образом упакованных аминокислотных последовательностей). Нормальный эритроцитарный гемоглобин - тетрамер, состоящий из 4-х субъединиц, двух -- и двух --типа (рис. 1).
Рис. 1. Структура эритроцитарного гемоглобина
и железосодержащего гема
Fig. 1. Structure of erythrocyte hemoglobin
and iron-containing heme
В зависимости от природы факторов, вызывающих нарушение нативной структуры гемоглобина, выделяют наследственные и приобретенные гемоглобинопатии. Наследственные обусловлены мутациями в генах, кодирующих белковые цепи Hb, наиболее известной является серповидно-клеточная анемия [Perutz et al., 1951; Ingram, 1956]. В настоящее время известно несколько сотен аномальных гемоглобинов, однако не все они приводят к клиническим проявлениям [Космачевская, Топунов, 2009]. Приобретенные гемоглобинопатии связаны с действием различных химических агентов (модификаторов) на гемоглобин. Изменения структуры гемоглобина могут приводить к нарушению кислород-переносящей функции и стабильности эритроцитов, а также затрудняют их прохождение по микрососудам. В результате это может привести к гемолитической анемии и местной ишемии тканей.
Патогенез гемоглобинопатий обусловлен существованием множественных связей между структурой Hb и свойствами эритроцита (форма, объем, деформируемость, агрегация), что сказывается на реологических свойствах крови и гемолитической устойчивости эритроцитарных клеток. Диагностика гемоглобинопатий требует использования различных современных микроскопических, биохимических, физико-химических и молекулярно-генетических методов, то есть является результатом комплекса междисциплинарных исследований. В практику клинических лабораторий введены методы анализа различных показателей, отражающих свойства гемоглобина, эритроцитов и крови в целом. Наряду с показателями, включенными в общий анализ крови, имеются дополнительные диагностичеcкие маркеры, позволяющие получить более полную информацию о состоянии пациента. На основе анамнеза и комплексного анализа всех показателей ставится диагноз и производится выбор программы лечения.
Восстановление гемоглобина и метгемоглобинемия
Отметим, что гемоглобины поддерживаются в физиологически активном восстановленном состоянии (с 2-х валентным железом гема) благодаря специфическим NADH- и NADPH-зависимым редуктазам [Топунов, Голубева, 1989; Топунов, Петрова, 2001; Топунов, Космачевская, 2017].
Наличие гемоглобинов и редуктаз как индивидуальных белков позволяет гемоглобинам выполнять две функции - доставку О2 и защиту от NO. В случае недостаточной активности этих ферментов проявляется такое заболевание как метгемоглобинемия, когда заметная доля Hb находится в окисленном состоянии. Это заболевание может быть как наследственным, когда синтез необходимой редуктазы идет недостаточно активно, так и вызываться действием различных химических соединений [Наследственные анемии и гемоглобинопатии, 1983; Топунов, Голубева, 1989; Топунов, Космачевская, 2017]. Интересно, что второй вид заболевания в англоязычной литературе традиционно называется "лекарственной" ("drug") метгемоглобинемией, поскольку к нему может приводить применение многих лекарственных препаратов.
Еще в 1920-е годы было показано, что метгемоглобин (metHb) отличается от нормального гемоглобина валентностью железа гема ((II) у нормального, (III) у MetHb), что явилось очень важным фактом для исследования процесса его восстановления. Была высказана гипотеза, что эритроциты больных метгемоглобинемией недостаточно способны к восстановлению MetHb, который нормально образуется в клетках. В работе Скотта и Гриффита 1959 г. было показано, что в эритроцитах больных наследственной метгемоглобинемией недостаточно активен фермент, восстанавливающий MetHb с NADH в качестве донора электронов, [Scott, Griffith 1959]. Это можно считать началом исследования метгемоглобинредуктазы (мет-Hb-редуктазы), фермента, восстанавливающего окисленный гемоглобин. Важным этапом в изучении процесса ферментативного восстановления Hb явилось установление идентичности мет-Hb-редуктазы и цитохром b5-редуктазы. Было показано, что мет-Hb-редуктаза эритроцитов способна восстанавливать окисленный Hb+ при участии NADH как донора электронов и цитохрома b5 как промежуточного переносчика электронов. Была показана идентичность NADH-мет-Hb-редуктазы эритроцитов и цитохром b5-редуктазы других тканей и органов [Kuma et al., 1976]. Мет-Hb-редуктаза и цитохром b5-редуктаза внесены в номенклатуру ферментов как один и тот же фермент под названием NADH: феррицитохром b5-оксидоредуктаза (К.Ф.1.6.2.2.).
Рис. 2. Места проживания групп населения с повышенным распространением
наследственной метгемоглобинемии. 1 - эскимосы Аляски; 2 - индейцы-атабаски Аляски;
3 - индейцы навахо; 4 - якуты бассейна реки Вилюй.
Fig. 2. Places of residence of population groups with increased prevalence of hereditary methemoglobinemia.
1 - the Eskimos of Alaska; 2 - the Indians-Athabasca of Alaska; 3 - Navajo Indians; 4 - Yakuts of the Viluy river basin
На рис. 2 показана составленная нами карта эндемичных зон распространения наследственной метгемоглобинемии, связанной с недостаточной активностью мет-Hb-редуктазы. Этническими группами, у которых обнаружено высокое распространение этого заболевания, являются эскимосы и индейцы-атабаски Аляски, индейцы навахо и якуты бассейна реки Вилюй. Все они живут в Северном полушарии, причем в районах Крайнего Севера, кроме индейцев навахо, однако и их присутствие в этом списке не случайно. Навахо и атабаски относятся к одной языковой семье (на-дене), и в места сегодняшнего проживания они переселились из Аляски и Северо-Западной Канады в 14-м веке.
В России наследственная метгемоглобинемия отмечена в виде эндемических очагов в Якутии в бассейне реки Вилюй [Наследственные анемии и гемоглобинопатии, 1983]. У коренных жителей республики (якутов-саха) необычайно высокое распространение этого заболевания, её частота составляет 1:5700 человек. Накопление этого заболевания могло произойти благодаря так называемому "эффекту основателя" - популяционно-генетическому явлению, связанному с ограниченной репродуктивной численностью у предковых изолированных популяций.
Интересно, что в 1950-е годы повышенное распространение наследственной метгемоглобинемии было описано лишь у эскимосов Аляски и их соседей атабасков, поэтому не исключено, что в будущем будут описаны и другие группы с повышенным распространения наследственной метгемоглобинемии. Могут быть перспективными исследования других изолированных популяций, у которых может проявляться "эффект основателя".
Так как цитохром b5-редуктаза эритроцитов (мет-Hb-редуктаза) идентична цитохром b5-редуктазе других тканей, существует два типа недостаточности этого фермента: "эритроцитарный", когда недостаточность наблюдается только в эритроцитах, и "основной", когда она наблюдается также и в других тканях; генетические механизмы этих проявлений пока до конца не выяснены. Особо выделяется метгемоглобинемия, связанная с умственной неполноценностью больных [Mansouri, 1985]. Такое нарушение может быть связано с тем, что цитохром b5-редуктаза, как и цитохром b5, участвуют в обмене жирных кислот, и при недостаточной активности фермента происходит нарушение такого обмена, что пагубно сказывается на деятельности нервных клеток. Соответственно, возможна и метгемоглобинемия, связанная с недостатком самого цитохрома b5.
Интересно, что еще одна энзимопатия - дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (фабизм) является фактором риска для приобретенной метгемоглобинемии, поэтому популяции, для которых она характерна (средиземноморского и африканского происхождения), обладают повышенным риском для проявления метгемоглобинемии данного типа.
Взаимодействие гемоглобина
с различным соединениями
Важным фактором, влияющим на состояние гемоглобина в организме, являются посттрансляционные модификации белка, среди которых можно отметить связывание Hb с различными химическими соединениями. Опишем некоторые известные виды таких взаимодействий, влияющих на функционирование гемоглобина и, через него, эритроцитов в организме.
Взаимодействие с оксидом азота и его производными
Гемоглобины способны взаимодействовать с активными формами кислорода и азота, то есть функционировать в условиях окислительного и нитрозативного стрессов, что важно как при патогенезе, так и при действии на организм неблагоприятных факторов. Имеется большое число публикаций, в которых показано, что первичная функция гемоглобинов, вероятно, заключалась в защите клеток от нитрозативного стресса и в модулировании сигнальной функции NO. Например, общей для основных групп известных Hb является реакция превращения NO в NO3.
В организме животных оксид азота образуется в результате NO-синтазной реакции, при окислении L-аргинина в L-цитруллин. Поскольку для ферментативного окисления L-аргинина требуется кислород, NO-синтазный механизм ингибируется при гипоксии. В то же время, дефицит O2 является фактором, обеспечивающим активную работу нитритредуктазных систем, связанных с Hb, Mb и электронтранспортными цепями. При гипоксии восстановление ионов NO2- в NO идет в крови и в клетках тканей с помощью дезоксигенированных гемоглобина (deoxyHb) и миоглобина (deoxyMb) соответственно.
Показано, что Mb (одно-субъединичный мышечный гемоглобин) проявляет NO-диоксигеназную активность и защищает митохондриальную цитохром с-оксидазу от инактивации оксидом азота, причем эту функцию он выполняет не только в скелетных и сердечных мышцах, где Mb много, но и в гладких мышцах, где Mb синтезируется в низких концентрациях [Qiu et al., 1998; Ascenzi, Brunori, 2001; Kreutzer, Jue, 2004; Rassaf et al., 2007]. То есть Mb может не только генерировать NO при гипоксии благодаря нитритредуктазной активности, но и окислять его до NO3- при нормальной концентрации O2. Mb в этом случае выполняет роль сенсора кислорода, изменяя активность терминальных оксидаз, а также энергетический статус клеток сердца в ответ на понижение концентрации О2.
В последнее время активно разрабатывается гипотеза, что эритроцитарный Hb является одним из важнейших элементов системы метаболизма NO и его доноров внутри организма. Согласно так называемой "нитритной гипотезе", NO2- является потенциальным источником NO в эритроцитах, поскольку, как было описано выше, при гипоксии Hb проявляет нитритредуктазную активность, в результате которой образуется NO [Rifkind et al., 2006]. Было показано, что Hb-SNO (гемоглобин, у которого NO присоединен к остатку цистеина) оказывает сосудорасширяющее действие и усиливает кровоток в сосудах [Stamler et al., 1997]. Доля образующихся нитрозогемоглобина (HbNO) и Hb-SNO зависит от насыщения Hb кислородом. Предполагается, что при физиологических условиях deoxyHb может работать как S-нитрозотиол-синтаза, используя в качестве субстрата нитрит [Angelo et al., 2006].
Особый интерес представляют модификации гемоглобина, возникающие при одновременном действии на белок и активных форм азота и активных карбонильных соединений, то есть в условиях карбонильного стресса (см. ниже). Нам удалось показать, что в этом случае возможно образование как нитрозо-, так и нитригемоглобина, причем появление той или иной модификации Hb может зависеть как от соотношения концентраций действующих агентов, так и от условий протекания реакции [Kosmachevskaya et al., 2013, 2014].
Помимо связывания NO гемоглобинами по железу гема и по cys-93, существует еще один путь. С участием тиоловой группы цистеина -93 могут формироваться динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) [Vanin et al., 1998; Gow et al., 1999]. Общая формула тиолсодержащих ДНКЖ - {(RS-)2Fe+(NO+)2}. В нашей совместной работе с Национальным медицинским исследовательским центром кардиологии Минздрава РФ и Институтом химической физики им. Н.Н. Семенова РАН было показано, что низкомолекулярные тиолсодержащие ДНКЖ разрушаются под действием супероксида и других активных окислителей [Шумаев и др., 2006], что может объяснять малое содержание этих комплексов в организме. Также нами было показано, что Hb-ДНКЖ действуют как сайт-специфические антиоксиданты, защищающие участки белка, с которым они связаны, от окислительной модификации [Shumaev et al., 2008a,b]. Было также показано, что ДНКЖ могут образовываться в активной биологической системе - в митохондриях сердца [Шумаев и др., 2010]. Таким образом, можно сделать вывод, что ДНКЖ могут функционировать как физиологические доноры NO, а HbNO, Hb-SNO и ДНКЖ образуют пул депонированного NO в организме.
Обобщая существующие данные о взаимодействии различных гемоглобинов с оксидом азота, можно выделить 3 основные типа реакций. Это нитритредуктазная реакция, диоксигеназная реакция [Gardner et al., 1998], при которой происходит окисление NO оксигенированным Hb с образованием NO3-, и денитрозилазная реакция [Hausladen et al., 2001], т.е. взаимодействие нитрозилированного Hb (включая Hb-SNO) с О2 с образованием NO3-. В условиях гипоксии преимущественное протекание той или иной реакции зависит от концентраций O2 и NO, а также от сродства Hb к этим лигандам. Диоксигеназная реакция может катализироваться как эритроцитарным HbO2 [Gow et al., 1999], так и мышечным MbO2 [Eich et al., 1996].
Взаимодействие с активными формами кислорода
Большое внимание уделяется взаимодействию гемоглобинов с перекисью водорода (H2O2) и другими активными формами кислорода, поскольку эти белки проявляют пероксидазную активность (восстанавливают различные перекиси) и могут инициировать свободнорадикальное окисление биомолекул под действием H2O2 [Reeder, Wilson, 2005]. Так, обнаружено, что в результате реакции оксиHb с избытком Н2О2 происходит быстрое образование окисленного metHb, содержащего трехвалентное железо в геме и неспособного связывать и переносить кислород. MetHb также может образовываться и в результате автоокисления Hb. Деградация metHb в присутствии Н2О2 сопровождается высвобождением железа, взаимодействие которого с Н2О2 приводит к генерации гидроксильного радикала OH•. С другой стороны, взаимодействие оксигенированного гемоглобина (oxyHb) и metHb с Н2О2 при определенных условиях протекает через стадию образования феррил-формы {Гем+• (FeIV)-OH-}со свободным радикалом на порфириновом кольце. Эта форма, в отличие от классических пероксидаз, нестабильна, характеризуется высокой окисляющей активностью и индуцирует реакции свободнорадикального окисления липидов. При окислении липидов образуются алкоксильные (RO*) и алкилпероксильные (ROO*) радикалы и гидроперекиси липидов (ROOH), которые также могут окислять metHb с образованием новых порций феррилгемоглобина. То есть, гемоглобины могут инициировать перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к образованию простагландиноподобных молекул, обладающих потенциальной сосудосокращающей активностью [Reeder, Wilson, 2005]. Отметим, что для определения именно пероксидазной активности Hb нами совместно с сотрудниками Института физико-химической медицины (Москва), Белорусского государственного университета и Научно-практического центра "Кардиология" (Минск) был разработан спектрофотометрический метод с использованием о-дианизидина в качестве субстрата и специфического ингибитора миелопероксидазы - гидразида 4-аминобензойной кислоты [Григорьева и др., 2013].
При автоокислении oxyHb образуется супероксид-анион-радикал О2•-, который при взаимодействии с NO образует пероксинитрит (ONOO-), являющийся намного более сильным окислителем. Правда, считается, что образование ONOO- в эритроцитах не является распространенным явлением.
Известно, что гемопротеиды являются основными мишенями действия пероксинитрита. Его взаимодействие с oxyHb и oxyMb приводит к образованию их мет-форм, повреждению порфиринового кольца (основной структурной части гема) с последующей деградацией гема, включающей окисление железа и нитрирование остатков тирозина. Нитрирование Hb приводит к изменению конформации белка, в результате чего гем выходит из гидрофобного кармана, и повышается вероятность его высвобождения и разрушения [Alayash et al., 1998]. В работе [Li et al., 2004] показано, что взаимодействие ONOO- с гемопротеидами зависит от концентрации СО2, рН и температуры. Наличие СО2, пониженная температура и щелочная среда способствуют распаду ONOO-.
Взаимодействие с сульфидами
Гемоглобины обладают также способностью связывать сульфиды с помощью гемовой группы. В работе [McCutcheon et al., 1960] показано, что при избыточном поступлении H2S в организм человека, он образует комплексы с гемоглобином, что приводит к образованию сульфгемоглобина (sulfHb). Сульфгемоглобинемия может быть следствием приема лекарств (сульфонамидов, фенасетина, ацетанилида) [Park, Nagel, 1984] и в некоторых случаях результатом затрудненной дефекации. В нормальной крови sulfHb отсутствует, при патологиях его концентрация находится в диапазоне 1-10% [Discombe, 1960]. Описано и возникновение сульфгемоглобинемии у новорожденных при действии сульфида серы, выделяемого бактерией Morganella morganii, живущей в кишечнике [Murphy et al., 2015]. Гемоглобин человека может также связывать сульфиды по остатку Цис-93 --цепей.
Гликозилирование гемоглобина
Очень важным видом посттрансляционной модификации гемоглобина является гликозилирование (связывание с активными карбонильными соединениями, в том числе, с сахарами). Неферментативному гликозилированию, как правило, подвергаются долгоживущие белки, такие, как гемоглобины и сывороточный альбумин [Chandalia, Krishnaswamy, 2002]. Hb был первым белком, для которого было описано существование этого процесса [Kunkel, Wallenius, 1955], а в дальнейшем было показана его взаимосвязь с диабетом [Rahbar, 1968]. Гликозилированный гемоглобин человека типа А обозначают как HbA1. Эта фракция гемоглобина не является патологической и у здоровых людей составляет 5-7% [Dolhofer et al., 1981]. В зависимости от природы сахара, связанного с гемоглобином, различают как минимум три субфракции HbA1: А1а, А1b и A1c. Например, HbA1а1 образуется в результате взаимодействия с фруктозо-1,6-дифосфатом, HA1а2 - глюкозо-6-фосфатом, HbA1c - глюкозой [Галенок и др., 1989]. Фосфорилированные сахара, например, глюкозо-6-фосфат, присутствующий в эритроцитах, взаимодействует с гемоглобином в 20 раз быстрее, чем глюкоза [Chandalia, Krishnaswamy, 2002].
Неферментативное гликозилирование представляет собой реакцию химической конденсации белка с моносахаридом и дальнейшее превращение этого соединения. Химическая конденсация является реакцией соединения альдегидной группы глюкозы (а также многих других альдоз и кетоз) с аминогруппой аминокислоты белка, при этом образуется альдимин или Шиффово основание. Данная стадия гликозилирования обратима. В дальнейшем эта промежуточная форма гликозилированного гемоглобина подвергается перегруппировки Амадори с образованием стабильной кетоаминной формы - конечного продукта гликозилирования, который присутствует в эритроцитах до конца их жизни.
Как правило, местом гликозилирования гемоглобина является аминная группа N-концевой аминокислоты (валин) обеих --цепей гемоглобина А (HbA1с). Есть данные, что углеводы способны присоединяться и к --аминогруппе некоторых остатков лизина как --, так и --цепей [Shapiro et al., 1980]. Содержание в крови неферментативно гликозилированных белков повышается при таких заболеваниях, как сахарный диабет, галактоземия, мелитурия (повышенная экскреция углеводов с мочой), атеросклероз и др. [Галенок и др., 1989], при этом содержание HbA1c является маркером нарушений углеводного обмена [Fluckiger et al., 1977]. Могут образовываться и продукты гликозилирования "пост-Амадори" с желтой или коричневой окраской, образующейся при окислении восстанавливающих сахаров пероксидом водорода или пероксинитритом. Это может приводить к конформационным перестройкам и фрагментации белковой молекулы [Yim et al., 1995]. К продуктам "пост-Амадори" также относятся глиоксаль, метилглиоксаль и 3-дезоксиглюкозоны. Их накопление в организме приводит к так называемому "карбонильному стрессу". Отметим, что функционирование одного из самых активных карбонильных соединений - метилглиоксаля в эукариотических клетках подробно описано в обзоре [Космачевская и др., 2017].
Взаимодействие с "необычными" лигандами
Помимо способности взаимодействовать с низкомолекулярными лигандами (О2, CO и NO), гемоглобины могут формировать прочные комплексы и с довольно крупными молекулами, например, с гетероциклическими соединениями с атомом азота в гетероцикле, в частности, с изохинолином и никотиновой кислотой. Гемоглобины также способны образовывать комплексы и с алкилизоцианидами и нитрозоароматическими соединениями. Существуют данные, что комплексы с Hb могут образовывать алкильные радикалы, такие, как метильный, этильный, п-пропильный, трет-бутильный, изобутильный [Talbot et al., 1971]. Также гемоглобины могут взаимодействовать с нитрозоароматическими соединениями, например, с нитрозобензолом [Murayama, 1960] и нитрозотолуолом. Все эти соединения относят к "необычным" лигандам Hb. Взаимодействия гемоглобина с нитрозобензолом является комплексным, так как лиганд связывается не только с железом гема, но и с белком [Scheler, 1960]. Еще одной группой веществ, связывающихся с глобиновой частью Hb, являются некоторые производные пиридоксаля и имидазол [Benesch, Benesch, 1981; Андреюк, Кисель, 1997]. Комплексы гемоглобинов с гетероциклическими соединениями могут образовываться как результат присутствия в окружающей среде токсичных веществ и при связывании некоторых лекарственных препаратов. Например, такие комплексы были обнаружены в крови людей, работающих на химических заводах, как результат их хронического отравления [Scheler, 1960]. Роль таких реакций до конца не выяснена, хотя в определенных условиях может оказаться очень важной.
Мембраносвязанный гемоглобин
Отдельно следует выделить мембраносвязанную форму гемоглобина (MBHb). Мембраносвязанный гемоглобин является тонким индикатором структурно-функционального состояния эритроцитов. Несмотря на важность этой формы Hb, она до сих пор мало используется для диагностических целей. Поэтому расскажем о ней поподробнее.
У ряда организмов мембраносвязанные гемоглобины описаны как основные, постоянно находящиеся в таком состоянии [Космачевская, Топунов, 2009]. Однако еще до их открытия при попытке получить тени эритроцитов гипотоническим лизисом был установлен факт связывания эритроцитарного Hb с мембранами. Первое упоминание о содержании Hb в эритроцитарных мембранах можно найти в работах Андерсона и Тёрнера, которые показали, что отмытые мембраны эритроцитов содержат около 3% Hb [Anderson, Turner, 1960]. Позднее Фунг и Эйзингер в своих исследованиях подтвердили факт взаимодействия Hb с мембранами эритроцитов в физиологических условиях [Fung, 1981; Eisinger et al., 1982]. По данным Токтамысовой и Биржановой, доля ассоциированного с мембранами Hb в нативных эритроцитах в зависимости от ряда факторов может изменяться в диапазоне от 7 до 10% [Токтамысова, Биржанова, 1990], согласно другим данным - от 1,1 до 5,2% [Nash, Meiselman, 1983]. Количественное содержание гемоглобина в мембранах эритроцитов, измеренное с помощью двумерного электрофореза, составляет 17,40±0,74 мкг на 1 мг общего белка мембран и является наименьшим, по сравнению с количественным содержанием других мембранных белков [Громов и др., 1988]. Расчеты доли мембраносвязанного Hb, сделанные разными авторами, давали чаще всего значения от 3 до 5 %, хотя иногда разброс составлял 2-7 %. Различия в данных о содержании MBHb можно объяснить использованием различных методических подходов для определения Hb в мембранах.
Взаимодействовать с мембранами Hb может разными способами. Наиболее важным является электростатическое связывание deoxyHb по цитоплазматическому домену анионтранспортного белка полосы 3 (CDB3 - Cytoplasmic Domain of Band 3 protein) [Shaklai et al., 1977; Fung, 1981; Eisinger et al., 1982; Sega et al., 2012] (рис. 3).
Можно назвать также ковалентную пришивку к мембранным компонентам дисульфидными связями и адсорбцию к мембранным липидам с помощью гидрофобных взаимодействий. Также Hb может связываться с другими белками цитоскелета: спектрином и гликофорином. Связывание Hb с мембраной может быть обратимым и необратимым. С применением флуоресцентных зондов было показано, что Hb за счет электростатических взаимодействий обратимо с высоким сродством связывается с CDB3 [Shaklai et al., 1981; Demehin et al., 2002]. Необратимым является ковалентное связывание Hb с компонентами мембраны вследствие действия различных окислительных агентов, вызывающих образование свободных радикалов и оксоферрильных форм гемоглобина, инициирующих процессы перекисного окисления липидов [Shaklai, Ranney, 1978; Kriebardis et al., 2007]. Доля необратимо связанного Hb возрастает при различных формах гемоглобинопатий, как наследственных (серповидно-клеточная анемия, талассемии), так и индуцированных окислительными агентами.
Рис. 3. Связывание гемоглобина с трансмембранным белком полосы 3 [по Лунева и др., 2015].
Fig. 3. Hemoglobin binding to the transmembrane Band 3 protein [after Luneva et al., 2015].
Обратимый характер связывания Hb с мембранами служит указанием на возможную физиологическую значимость этого процесса. Данные последних лет показывают, что связывание гемоглобина с мембранными компонентами имеет множественное биологическое значение. Это и регуляция метаболизма глюкозы и свойств цитоскелета в зависимости от концентрации кислорода, и формирование сигнала об окислительном повреждении или старении эритроцита, а также участие в сигнальном пути гипоксической вазодилатации. Перечисленные функции гемоглобин реализует при участии CDB3. Обратимое связывание Hb с мембранами может быть адаптивной реакцией, направленной на стабилизацию липидного бислоя мембран и/или регуляцию его упруго-механических свойств. Примембранным белковым слоям в настоящее время приписывают несколько функций: участие в процессах транспорта веществ, в иммунологическом поведении клеток, их адгезивных свойствах, контактном ингибировании и т.д.
Помимо основной функции, связанной с доставкой кислорода к клеткам тканей, эритроциты участвуют в регуляции капиллярного кровотока (локального внутрисосудистого давления). Локальный кровоток является фактором, определяющим регуляцию метаболизма тканей. Описаны три возможных механизма вовлечения эритроцитов в регуляцию тонуса сосудов. Это аллостерически регулируемое высвобождение NO с участием SH-групп --субъединицы Hb (гипотеза SNO-Hb) [Jia et al., 1996; Stamler et al., 2008], восстановление нитрит-ионов deoxyHb (гипотеза нитритной вазодилатации) [Huang et al., 2005; Gladwin et al., 2006; Shiva, 2013] и стимуляция эритроцитарным ATP синтеза NO эндотелиоцитами (гипотеза высвобождения ATP) [Sprague et al., 2001; Ramdani, Langsley, 2014]. Каждый из перечисленных механизмов реализуется в условиях сниженного парциального давления кислорода (рO2). Наряду с гипоксией выброс ATP из эритроцитов может быть вызван их механической деформацией при прохождении через капилляры, закислением среды и избыточным количеством CO2 в крови [Лунева и др., 2015]. Однако механизм высвобождения ATP до сих пор не понятен.
Учитывая способность гемоглобина активно участвовать в элиминации, образовании и транспорте NO и ATP, была сформулирована гипотеза, что эритроцит является не только переносчиком кислорода, но и регулятором его доставки к тканям в условиях гипоксии. В настоящее время в научную практику введен термин "эритрокринная функция", обозначающий роль эритроцитов в метаболизме сигнальных метаболитов.
Поскольку гемоглобин помимо способности к связыванию газов обладает рядом ферментативных активностей (пероксидазная, нитритредуктазная, NO-диоксигеназная и др.), то можно было предположить, что связывание Hb с мембранами переключает его функцию с транспортной на каталитическую. Так, было показано, что deoxyHb, связанный с CDB3, может восстанавливать нитрит-ионы и, таким образом, быть источником NO [Salhany, 2008]. Показано, что MBHb по сравнению с цитозольным гемоглобином имеет более высокое сродство к О2, более низкий коэффициент Хилла и гораздо более высокую пероксидазную активность [Tsuneshige et al., 1987].
Мы полагаем, что использование данных о мембраносвязанном гемоглобине в качестве дополнительного биохимического показателя существенно расширит возможности диагностики заболеваний системы кровообращения. Оценка его уровня может быть полезна для ранней диагностики и лечения многих патологических процессов.
Однако для использования данных о MBHb в диагностике необходимо иметь удобный и точный метод его определения. В настоящее время концентрацию MBHb в эритроцитах определяют следующими методами: спектрофотометрической оценкой гемоглобина, ассоциированного с тенями эритроцитов [Токтамысова, Биржанова, 1990]; SDS-электрофорезом белков теней в ПААГ с последующей денситометрией полосы Hb [Sears, Lewis, 1980], измерением тушения гемоглобином флуоресценции зондов, встроенных в мембрану и специфически взаимодействующих с белком полосы 3 [Eisinger et al., 1982]. Количественная оценка Hb в геле является трудоемким и к тому же не очень точным методом. Измерения флуоресценции чувствительны и обеспечивают возможность детектировать низкие концентрации Hb, но для этой процедуры требуются дорогостоящие реактивы. Наиболее удобным и дешевым является спектрофотометрический способ, однако этот подход не позволяет определять низкие концентрации МBHb. Поэтому перед нами стояла задача разработать простую, чувствительную и недорогую методику спектрофотометрической оценки содержания МBHb в эритроцитах.
Прототипами предложенного нами способа определения МBHb послужили два методических подхода. Первый - спектрофотометрическая оценка МBHb, второй - метод измерения концентрации гемоглобина в щелочном растворе пиридина [Riggs, 1981]. Суть нашей методики заключается в определении связанного с тенями эритроцитов Hb после полного гемолиза клеток. Для перевода гемоглобина в растворимую форму было предложено использовать 30%-ый щелочной раствор пиридина [Космачевская, Топунов, 2007], что позволило одновременно солюбилизировать мембраны и перевести Hb в удобную для спектрофотометрической детекции форму - пиридингемохромоген. Разработанная методика позволяет быстро и надежно определять количество МBHb в пробах крови и имеет высокую точность, позволяя обнаруживать менее 0,1% МBHb в пробе.
Разработанная методика была испытана в модельных экспериментах с суспензией эритроцитов и на цельной крови здоровых доноров и пациентов Национального медицинского исследовательского центра (НМИЦ) онкологии им. Н.Н. Блохина. Был установлен диапазон нормальных значений для МBHb: 3,3%-4,9%, соответствующей высокой гемолитической устойчивости эритроцитов. Были обнаружен сдвиг содержания MBHb у онкобольных, подвергавшихся хемотерапии, в сторону превышения диапазона нормальных значений, который можно объяснить как с позиций развития интоксикации, вызванной приемом противоопухолевых препаратов, так и с позиций развития адаптации к анемии, сопровождающей болезнь.
Интересно, что ферменты, восстанавливающие гемоглобин (мет-Hb-редуктазы), тоже могут быть двух видов, растворимыми и мембраносвязанными [Топунов, Голубева, 1989], причем их соотношение различно в эритроцитах разных животных. Как правило, растворимая редуктаза является NADH-, а мембраносвязанная - NADPH-зависимой.
Заключение
Из всего описанного выше видно, что в организме человека, как и у многих животных, можно обнаружить множественные продукты различных посттрансляционных модификаций гемоглобина (для описания таких белков в последнее время стал употребляться термин "протеоформы" [Lisitsa et al., 2014]). Отметим также, что к настоящему времени известно 12 генов, кодирующих различные гемоглобины в организме человека, часть которых функционируют постоянно, а другие сменяют друг друга в процессе индивидуального развития. В связи с этим нами был предложен термин "ГемоглобинOм", объединяющий все формы гемоглобинов, существующие в организме [Топунов и др., 2013].
Эритроциты несут информацию не только о физико-химических сдвигах в системе крови, но и о функциональном состоянии организма как единого целого и степени его адаптации. Они являются высокочувствительными датчиками метаболического состояния системы крови, способными воспринимать и аккумулировать повреждения, поскольку время их жизни составляет 120±20 дней. Наиболее удобными индикаторами, отражающими функциональное состояние эритроцита, являются показатели, связанные с гемоглобином. Например, стандартный клинический анализ крови включает такие показатели как концентрация Hb, гематокрит, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците. При необходимости проводят измерение окисленного metHb и гликозилированного HbA1c, коррелирующие с уровнем метгемоглобинемии и гликемии.
Данные о различных функциональных и множественных формах гемоглобина могут быть использованы и в компьютерной диагностике. Нами ведется разработка компьютерной экспертной системы диагностики анемий и гемоглобинопатий с использованием различных гематологических показателей. Работа по созданию экспертной системы "BLOOD" проводится совместно с кафедрой компьютерных медицинских систем Национального исследовательского ядерного университета "МИФИ" и клинико-диагностической лабораторией НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина [Насыбуллина и др., 2015]. Предложена пилотная версия системы. По результатам проведенных экспериментов с использованием данных анализов пациентов НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина можно утверждать, что система в полной мере реализует все заявленные функции и верно определяет диагноз.
В усовершенствованной диагностической экспертной системе "BLOOD", работа над которой продолжается в настоящее время, будет использован расширенный перечень показателей, связанных с гемоглобином и характеризующих исследуемую объектную среду. К количественным характеристикам объекта будут относиться значения концентраций билирубина, внеклеточного Hb и др. в плазме крови, количество эритроцитов, ширина эритроцитометрической кривой и др., содержание общего гемоглобина, окисленного гемоглобина, различных модифицированных форм (карбоксиHb, sulfHb, нитриHb, гликированный Hb и др.). Для различения ряда заболеваний будут учитываться концентрации ферритина и железа в сыворотке крови, свободного гемоглобина в плазме крови и число ретикулоцитов. Мы также подчеркиваем важность использования такого показателя, как доля metHb. В дополнение к стандартным количественным характеристикам, мы считаем необходимым ввести в клиническую практику еще одну диагностическую характеристику - количество мембраносвязанного гемоглобина.
Разрабатываемая система выступает в качестве инструмента поддержки принятия решений врачом при диагностике данных заболеваний. Предполагаются реализация и апробация предложенных в работе алгоритмов и методик в виде автоматизированного программно-информационного диагностического комплекса в сфере здравоохранения, а также для обучения и повышения квалификации медицинского персонала.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз