Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК у партеногенетической кукурузы
Авторы:
Название:
Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК у партеногенетической кукурузы
Страницы:
187-192
Приведены экспериментальные данные об экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК (dmt102, dmt103, dmt105, hdt104, hon101, chr106), в завязях, зародышевых мешках при экспериментальной задержке опыления на 3, 7 дней и в проэмбрио, зародышах и эндосперме партеногенетической (АТ-3) и контрольной (ГПЛ-1) линий кукурузы через 3, 7 дней после опыления. У кукурузы линий АТ-3 и ГПЛ-1 обнаружено отличие в экспрессии гена dmt102 в завязях и зародышевых мешках при искусственной задержке опыления и гена hdt104 в зародышевых мешках и эндосперме после опыления. Через семь дней после опыления в зародышах обеих линий экспрессия всех исследованных (кроме chr106) генов была подавлена. А в эндосперме партеногенетической линии АТ-3 спустя семь дней после опыления зарегистрирована экспрессия четырех (dmt103, hdt104, hon101, chr106) из шести исследованных генов.
Введение
Покрытосеменные растения размножаются половым и бесполым (апомиктичным) путями. Хотя половое размножение является доминирующим у покрытосеменных, оно не является единственным способом размножения, и бесполое существует у многих видов растений. Апомиктичные растения «обходят» мейоз и оплодотворение яйцеклетки, развивая партеногенетические зародыши, являющиеся генетическими клонами материнского растения [Grimanelli, 2012]. Хотя апомиксис контролируется генетически, многие локусы, способствующие его проявлению, до сих пор не определены. Считается, что у современных сортов и линий кукурузы апомиксис отсутствует, однако саратовскими селекционерами была получена линия кукурузы АТ-1 и ее производные (линии АТ-3, АТТМ), у которых автономный (без опыления) эмбрио- и эндоспермогенез (матроклинный партеногенез или гиногенез) наблюдались с повышенной (6-50% и более) частотой [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983; Enaleeva, Tyrnov, 1997; Гуторова и др. (Gutorova et al.), 2016]. Линия AТ-1 выделена в самоопыленном потомстве гибрида, полученного после скрещивания линии Stock 6 [Сое, 1959] и линии Коричневый маркер (КМ), имеет антоциановую окраску [Тырнов, Еналиева (Tyrnov, Enaleeva), 2003]. Для линии АТ-1 характерен наследуемый тип партеногенеза, этот признак является ядерным и передается через пыльцу и яйцеклетку из поколения в поколение. Линия АТ-3 была получена скрещиванием линии АТ-1 и линии ГПЛ, имеет зеленую окраску [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983; Enaleeva, Tyrnov, 1997]. В потомстве линии АТ-3 были отобраны растения, склонные к наследуемому партеногенезу, однако природа этого явления и генетический контроль не ясны до настоящего времени.
Ряд авторов считает, что апомиксис может возникнуть в результате изменения регуляции транскрипционных программ, которые контролируют половое размножение у растений и осуществляются с использованием эпигенетической регуляции [Grimanelli et al., 2003; Koltunow, Grossniklaus, 2003; Bicknell, Koltunow, 2004; Bradley et al., 2007; Grimanelli, 2012; García-Aguilar, Gillmor, 2015]. Так, при сравнении экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК (dmt102, dmt103, dmt105, hdt104, chr106, hon101) у кукурузы и апомиктичного гибрида кукурузы и трипсакума (С38) было выявлено, что у гибрида экспрессия четырех (dmt102, dmt103, dmt105, chr106) из шести выше указанных генов была подавлена на трех стадиях развития (спорогенез, зрелый зародышевый мешок до оплодотворения, ранний эмбриогенез (три дня после оплодотворения)), а еще два гена (hon101, hdt104) имели гетерохронную экспрессию [Garcia-Aguilar et al., 2010].
В связи с вышеописанным, целью данной работы был анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК в завязях, зародышевых мешках, эндосперме, проэмбрио и зародыше партеногенетической кукурузы линии АТ-3 при экспериментальной задержке опыления и после оплодотворения.
Материалы и методы
Выделение РНК из растительных образцов.
Опытные растения кукурузы партеногенетической линии АТ-3 (производная от линии АТ-1 [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983] выращивали на полях ФГБНУ РосНИИСК «Россорго» (Саратов). В качестве контроля для линии АТ-3 использовали линию ГПЛ-1 (дигаплоидизированный гаплоид), не обладающую способностью к матроклинному партеногенезу (гиногенезу). В период цветения (конец июля - начало августа) початки до появления рылец помещали под пергаментные изоляторы для предотвращения опыления. Выделение мРНК проводили из завязей, зародышевых мешков, зародышей и эндосперма, извлеченных из предварительно замороженных при – 20ºС початков партеногенетической (АТ-3) и контрольной линий кукурузы, как было ранее описано [Волохина и др. (Volokhina et al.), 2017; Moiseeva et al., 2017]. Образцы препаратов извлекали препаровальными иглами под стереоскопическим микроскопом МБС-9 (Россия) в капле охлажденного глицерина на охлажденном предметном стекле и сразу помещали в пробирку эппендорф (на льду) c экстракционным буферным раствором (50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 2% SDS, 10 мМ ß-меркаптоэтанол).
Анализ экспрессии генов метилирования ДНК у кукурузы.
С мРНК получали кДНК с олиго-Т праймерами (Синтол, Россия) согласно инструкции производителя ревертазы (Fermentas, Литва) и проводили ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов с использованием специфических праймеров на приборе Mastercycler personal (Еppendorf, Германия).
Таблица
Амплифицируемые с помощью ПЦР фрагменты ряда генов
Table. Fragments of several genes amplified by PCR
Гены
Genes Праймеры / Primers (5’→3’) ПЦР-продукт (п.н.)
PCR-product (bp)
Прямой / Forward Обратный / Reverse
dmt102 CCGTTGGTTCTTCCGAGCAG GGTATCACTGTCTGACTGCC 292
dmt103 TGAAGACGAGGCTGCACTGGC ACTTCCCTGTGCTTGGCCTCCA 202
dmt105 TACTTGCCGTTGGTTTTTCC GCTTTCTCATTTCGCACCTC 535
chr106 GAGCGGATCATCAAGAAAGC TGGATCATCCGATCTTCCTC 161
hdt104 GTAGTTGGCAAGAAGAGGGC ACTGCCGAAAGATTTGCTGC 225
hon101 CTTCGAGATGATCAAGGAGG CGAAGCCTTGACCTTCACGA 184
Праймеры (табл.) подбирали с помощью ресурса Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/ primer3plus.cgi). Условия проведения ПЦР для генов dmt102, dmt103, dmt105: денатурация 95 °С – 3 мин; затем 35 циклов по 95 °С – 30 сек, 60 °С – 30 сек, 72 °С–1 мин. Для генов chr106, hdt104, hon101: денатурация 95 °С – 3 мин; а затем 35 циклов по 95 °С – 30 сек, 58 °С –30 сек, 72 °С – 30 сек. В качестве внутреннего контроля использовали мРНК гена актина (act1) (прямой 5’-CCTGAAGATCACCCTGTGCT-3’, обратный 5’- GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC-3’) 95 °С – 30 сек, 63 °С – 1 мин, 72 °С–1 мин. ПЦР-продукт с кДНК фрагмента гена act1– 398 п.н. Результаты ПЦР визуализировали с помощью гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле. Экспрессией гена считали варианты, где наблюдали полосу с ПЦР-продуктом, с соответствующей молекулярной массой; подавлением экспрессии гена считали варианты, где полосу с ПЦР-продуктом, с соответствующей молекулярной массой не наблюдали (рис. 1, 2).
Результаты и обсуждение
Установлено, что при экспериментальной задержке опыления на 3 дня (3 дня после появления пестичных рылец, 3ДППР) в тканях завязей кукурузы экспрессируются все исследованные гены, за исключением гена, кодирующего хромметилтрансферазу (dmt102) у линии АТ-3 (рис. 1).
Рис. 1. Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК кукурузы, в тканях
женского гаметофита при искусственной задержке опыления на 3, 7 ДППР.
Примечание: Первые сутки задержки опыления определяли со дня появления пестичных рылец (ДППР)
на початках. Данные получены по 3-7 независимым экспериментам. В каждом эксперименте
для анализа использовали 5 завязей и зародышевых мешков (ЗМ).
Fig. 1. Maize DNA methylation genes expression in female gametophite tissues during 3 and 7 days
of the appearance of the pestle stigmas (DAPS).
Note: * - the first day of the delay of pollination was determined from the day of the appearance of the
pestle stigmas (DAPS) on the cob. The data were obtained for 3-7 independent experiments.
In each experiment were used for the analysis 5 pieces of ovaries and embryo sacs.
Через 7ДППР в тканях завязей контрольной линии кукурузы наблюдалась экспрессия всех генов, за исключением гена dmt102 (рис. 1). В те же сроки искусственной задержки опыления (3,7 ДППР) в зародышевом мешке (ЗМ) экспрессия генов dmt102, dmt105, hdt104 у АТ-3 и контрольной линий подавлена, поскольку мы не наблюдали соответствующих ПРЦ-продуктов с кДНК (рис. 1). Т.е., картина экспрессии генов, кодирующих хромметилтрансферазы (dmt102, dmt105) и гистоновую деацетилазу (hdt104), в завязях и в зародышевых мешках может отличаться. В связи с этим, проведение анализа экспрессии этих генов только в завязях или семяпочках, как в работе [Garcia-Agular et al., 2010], недостаточно, необходим анализ экспрессии генов в ЗМ, хотя операция по извлечению ЗМ очень трудоемка. Различия в экспрессии исследованных нами генов, связанных с метилированием ДНК, в ЗМ партеногенетической (АТ-3) и контрольной линиях к 7ДППР проявляются только по гену hdt104, экспрессия которого у АТ-3 подавлена, поскольку мы не наблюдали соответствующего ПРЦ-продукта (рис. 1). Интересно отметить, что у трех (dmt103 (метилтрансфераза), chr106 (хроматин-модулирующий фактор), hon101 (гистоновый линкер)) из шести исследованных генов наблюдается экспрессия и в завязях, и в ЗМ как через 3ДППР, так и через 7ДППР (рис. 1).
Рис. 2. Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК кукурузы в тканях
женского гаметофита через 3 и 7 дней
после опыления (3,7 ДПО).
Примечание: данные получены по 3-7 независимым экспериментам. В каждом эксперименте для
анализа использовали по 5 образцов
зародышей и 7 шт. эндосперма.
Fig. 2. Maize DNA methylation genes expression
in female gametophite tissues during 3 and 7 days
after pollination (DAP).
Note: The data were obtained for 3 and 7 independent experiments. In each experiment, 5, 7 samples were
used for the embryos and endosperm analysis.
В ЗМ спустя три дня после опыления (3ДПО) у партеногенетической линии AT-3 синтез метилтрансфераз, кодируемых генами dmt102, dmt103, dmt105, подавлен, а у контрольной линии в дополнение к указанным трем генам не обнаружена экспрессия гистоновой диацетилазы, кодируемой геном hdt104. Через 7ДПО в зародышах обоих линий экспрессия всех генов, связанных с метилированием ДНК (кроме chr106) подавлена (рис. 2).
В это же время в эндосперме партеногенетической (АТ-3) линии через 7ДПО зарегистрирована экспрессия всех исследованных генов (кроме dmt102, dmt105, рис. 2). В эндосперме контрольной линии через 7ДПО наблюдается экспрессия генов dmt103, chr106, hon101, поскольку были обнаружены соответствующие ПЦР-продукты с кДНК (рис. 2). Различие между исследованными линиями зарегистрировано в завязях: у контрольной линии через 3ДППР наблюдается экспрессия гена dmt102, в то время как у линии АТ-3 его экспрессия подавлена (рис. 2). Обусловлено ли это различие партеногенетически развивающимся проэмбрио предстоит выяснить. Во всех исследованных ЗМ картина экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК, у исследованных линий при задержке опыления на 3 и 7 дней выглядит одинаково (рис. 2). После опыления (7ДПО) наблюдается различие в экспрессии гена hdt104, кодирующего гистоновую деацетилазу: в эндосперме линии АТ-3 наблюдается экспрессия hdt104, в то время как у контрольной линии этот ген репрессирован (рис. 2).
Заключение
Таким образом, установлено, что в экспрессии исследованных генов, связанных с метилированием ДНК (dmt102, dmt103, dmt105, hdt104, chr106, hon101), наблюдаются отличия у партеногенетической линии АТ-3 и контрольной линий в зародышевых мешках до опыления (ген dmt102), и в зародышах через 7 дней после опыления (ген hdt104). Спустя 3 и 7 дней после опыления в зародышах у исследованных партеногенетической (АТ-3) и контрольных линий кукурузы экспрессия всех генов, связанных с метилированием ДНК (кроме chr106), подавляется. Спустя семь дней после опыления разница между партеногенетической (АТ-3) и контрольной линиями наблюдается в экспрессии гена hdt104 в эндосперме – у линии АТ-3 наблюдается экспрессия гена hdt104, в то время как в эндосперме контрольной линии ген hdt104 репрессирован.
Благодарности
Статья посвящена памяти В.С. Тырнова, начавшего работы по апомиксису кукурузы более 40 лет назад и стимулировавшему наш интерес к данной тематике и к линии кукурузы АТ-3, полученной в его лаборатории. Авторы признательны Ю.В. Смолькиной за предоставленную возможность работать с линиями АТ-3 и ГПЛ-1. И.Б. Иванову мы благодарим за помощь в получении образцов завязей кукурузы.
Покрытосеменные растения размножаются половым и бесполым (апомиктичным) путями. Хотя половое размножение является доминирующим у покрытосеменных, оно не является единственным способом размножения, и бесполое существует у многих видов растений. Апомиктичные растения «обходят» мейоз и оплодотворение яйцеклетки, развивая партеногенетические зародыши, являющиеся генетическими клонами материнского растения [Grimanelli, 2012]. Хотя апомиксис контролируется генетически, многие локусы, способствующие его проявлению, до сих пор не определены. Считается, что у современных сортов и линий кукурузы апомиксис отсутствует, однако саратовскими селекционерами была получена линия кукурузы АТ-1 и ее производные (линии АТ-3, АТТМ), у которых автономный (без опыления) эмбрио- и эндоспермогенез (матроклинный партеногенез или гиногенез) наблюдались с повышенной (6-50% и более) частотой [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983; Enaleeva, Tyrnov, 1997; Гуторова и др. (Gutorova et al.), 2016]. Линия AТ-1 выделена в самоопыленном потомстве гибрида, полученного после скрещивания линии Stock 6 [Сое, 1959] и линии Коричневый маркер (КМ), имеет антоциановую окраску [Тырнов, Еналиева (Tyrnov, Enaleeva), 2003]. Для линии АТ-1 характерен наследуемый тип партеногенеза, этот признак является ядерным и передается через пыльцу и яйцеклетку из поколения в поколение. Линия АТ-3 была получена скрещиванием линии АТ-1 и линии ГПЛ, имеет зеленую окраску [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983; Enaleeva, Tyrnov, 1997]. В потомстве линии АТ-3 были отобраны растения, склонные к наследуемому партеногенезу, однако природа этого явления и генетический контроль не ясны до настоящего времени.
Ряд авторов считает, что апомиксис может возникнуть в результате изменения регуляции транскрипционных программ, которые контролируют половое размножение у растений и осуществляются с использованием эпигенетической регуляции [Grimanelli et al., 2003; Koltunow, Grossniklaus, 2003; Bicknell, Koltunow, 2004; Bradley et al., 2007; Grimanelli, 2012; García-Aguilar, Gillmor, 2015]. Так, при сравнении экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК (dmt102, dmt103, dmt105, hdt104, chr106, hon101) у кукурузы и апомиктичного гибрида кукурузы и трипсакума (С38) было выявлено, что у гибрида экспрессия четырех (dmt102, dmt103, dmt105, chr106) из шести выше указанных генов была подавлена на трех стадиях развития (спорогенез, зрелый зародышевый мешок до оплодотворения, ранний эмбриогенез (три дня после оплодотворения)), а еще два гена (hon101, hdt104) имели гетерохронную экспрессию [Garcia-Aguilar et al., 2010].
В связи с вышеописанным, целью данной работы был анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК в завязях, зародышевых мешках, эндосперме, проэмбрио и зародыше партеногенетической кукурузы линии АТ-3 при экспериментальной задержке опыления и после оплодотворения.
Материалы и методы
Выделение РНК из растительных образцов.
Опытные растения кукурузы партеногенетической линии АТ-3 (производная от линии АТ-1 [Тырнов, Еналеева (Tyrnov, Enaleeva), 1983] выращивали на полях ФГБНУ РосНИИСК «Россорго» (Саратов). В качестве контроля для линии АТ-3 использовали линию ГПЛ-1 (дигаплоидизированный гаплоид), не обладающую способностью к матроклинному партеногенезу (гиногенезу). В период цветения (конец июля - начало августа) початки до появления рылец помещали под пергаментные изоляторы для предотвращения опыления. Выделение мРНК проводили из завязей, зародышевых мешков, зародышей и эндосперма, извлеченных из предварительно замороженных при – 20ºС початков партеногенетической (АТ-3) и контрольной линий кукурузы, как было ранее описано [Волохина и др. (Volokhina et al.), 2017; Moiseeva et al., 2017]. Образцы препаратов извлекали препаровальными иглами под стереоскопическим микроскопом МБС-9 (Россия) в капле охлажденного глицерина на охлажденном предметном стекле и сразу помещали в пробирку эппендорф (на льду) c экстракционным буферным раствором (50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 2% SDS, 10 мМ ß-меркаптоэтанол).
Анализ экспрессии генов метилирования ДНК у кукурузы.
С мРНК получали кДНК с олиго-Т праймерами (Синтол, Россия) согласно инструкции производителя ревертазы (Fermentas, Литва) и проводили ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов с использованием специфических праймеров на приборе Mastercycler personal (Еppendorf, Германия).
Таблица
Амплифицируемые с помощью ПЦР фрагменты ряда генов
Table. Fragments of several genes amplified by PCR
Гены
Genes Праймеры / Primers (5’→3’) ПЦР-продукт (п.н.)
PCR-product (bp)
Прямой / Forward Обратный / Reverse
dmt102 CCGTTGGTTCTTCCGAGCAG GGTATCACTGTCTGACTGCC 292
dmt103 TGAAGACGAGGCTGCACTGGC ACTTCCCTGTGCTTGGCCTCCA 202
dmt105 TACTTGCCGTTGGTTTTTCC GCTTTCTCATTTCGCACCTC 535
chr106 GAGCGGATCATCAAGAAAGC TGGATCATCCGATCTTCCTC 161
hdt104 GTAGTTGGCAAGAAGAGGGC ACTGCCGAAAGATTTGCTGC 225
hon101 CTTCGAGATGATCAAGGAGG CGAAGCCTTGACCTTCACGA 184
Праймеры (табл.) подбирали с помощью ресурса Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/ primer3plus.cgi). Условия проведения ПЦР для генов dmt102, dmt103, dmt105: денатурация 95 °С – 3 мин; затем 35 циклов по 95 °С – 30 сек, 60 °С – 30 сек, 72 °С–1 мин. Для генов chr106, hdt104, hon101: денатурация 95 °С – 3 мин; а затем 35 циклов по 95 °С – 30 сек, 58 °С –30 сек, 72 °С – 30 сек. В качестве внутреннего контроля использовали мРНК гена актина (act1) (прямой 5’-CCTGAAGATCACCCTGTGCT-3’, обратный 5’- GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC-3’) 95 °С – 30 сек, 63 °С – 1 мин, 72 °С–1 мин. ПЦР-продукт с кДНК фрагмента гена act1– 398 п.н. Результаты ПЦР визуализировали с помощью гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле. Экспрессией гена считали варианты, где наблюдали полосу с ПЦР-продуктом, с соответствующей молекулярной массой; подавлением экспрессии гена считали варианты, где полосу с ПЦР-продуктом, с соответствующей молекулярной массой не наблюдали (рис. 1, 2).
Результаты и обсуждение
Установлено, что при экспериментальной задержке опыления на 3 дня (3 дня после появления пестичных рылец, 3ДППР) в тканях завязей кукурузы экспрессируются все исследованные гены, за исключением гена, кодирующего хромметилтрансферазу (dmt102) у линии АТ-3 (рис. 1).
Рис. 1. Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК кукурузы, в тканях
женского гаметофита при искусственной задержке опыления на 3, 7 ДППР.
Примечание: Первые сутки задержки опыления определяли со дня появления пестичных рылец (ДППР)
на початках. Данные получены по 3-7 независимым экспериментам. В каждом эксперименте
для анализа использовали 5 завязей и зародышевых мешков (ЗМ).
Fig. 1. Maize DNA methylation genes expression in female gametophite tissues during 3 and 7 days
of the appearance of the pestle stigmas (DAPS).
Note: * - the first day of the delay of pollination was determined from the day of the appearance of the
pestle stigmas (DAPS) on the cob. The data were obtained for 3-7 independent experiments.
In each experiment were used for the analysis 5 pieces of ovaries and embryo sacs.
Через 7ДППР в тканях завязей контрольной линии кукурузы наблюдалась экспрессия всех генов, за исключением гена dmt102 (рис. 1). В те же сроки искусственной задержки опыления (3,7 ДППР) в зародышевом мешке (ЗМ) экспрессия генов dmt102, dmt105, hdt104 у АТ-3 и контрольной линий подавлена, поскольку мы не наблюдали соответствующих ПРЦ-продуктов с кДНК (рис. 1). Т.е., картина экспрессии генов, кодирующих хромметилтрансферазы (dmt102, dmt105) и гистоновую деацетилазу (hdt104), в завязях и в зародышевых мешках может отличаться. В связи с этим, проведение анализа экспрессии этих генов только в завязях или семяпочках, как в работе [Garcia-Agular et al., 2010], недостаточно, необходим анализ экспрессии генов в ЗМ, хотя операция по извлечению ЗМ очень трудоемка. Различия в экспрессии исследованных нами генов, связанных с метилированием ДНК, в ЗМ партеногенетической (АТ-3) и контрольной линиях к 7ДППР проявляются только по гену hdt104, экспрессия которого у АТ-3 подавлена, поскольку мы не наблюдали соответствующего ПРЦ-продукта (рис. 1). Интересно отметить, что у трех (dmt103 (метилтрансфераза), chr106 (хроматин-модулирующий фактор), hon101 (гистоновый линкер)) из шести исследованных генов наблюдается экспрессия и в завязях, и в ЗМ как через 3ДППР, так и через 7ДППР (рис. 1).
Рис. 2. Анализ экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК кукурузы в тканях
женского гаметофита через 3 и 7 дней
после опыления (3,7 ДПО).
Примечание: данные получены по 3-7 независимым экспериментам. В каждом эксперименте для
анализа использовали по 5 образцов
зародышей и 7 шт. эндосперма.
Fig. 2. Maize DNA methylation genes expression
in female gametophite tissues during 3 and 7 days
after pollination (DAP).
Note: The data were obtained for 3 and 7 independent experiments. In each experiment, 5, 7 samples were
used for the embryos and endosperm analysis.
В ЗМ спустя три дня после опыления (3ДПО) у партеногенетической линии AT-3 синтез метилтрансфераз, кодируемых генами dmt102, dmt103, dmt105, подавлен, а у контрольной линии в дополнение к указанным трем генам не обнаружена экспрессия гистоновой диацетилазы, кодируемой геном hdt104. Через 7ДПО в зародышах обоих линий экспрессия всех генов, связанных с метилированием ДНК (кроме chr106) подавлена (рис. 2).
В это же время в эндосперме партеногенетической (АТ-3) линии через 7ДПО зарегистрирована экспрессия всех исследованных генов (кроме dmt102, dmt105, рис. 2). В эндосперме контрольной линии через 7ДПО наблюдается экспрессия генов dmt103, chr106, hon101, поскольку были обнаружены соответствующие ПЦР-продукты с кДНК (рис. 2). Различие между исследованными линиями зарегистрировано в завязях: у контрольной линии через 3ДППР наблюдается экспрессия гена dmt102, в то время как у линии АТ-3 его экспрессия подавлена (рис. 2). Обусловлено ли это различие партеногенетически развивающимся проэмбрио предстоит выяснить. Во всех исследованных ЗМ картина экспрессии генов, связанных с метилированием ДНК, у исследованных линий при задержке опыления на 3 и 7 дней выглядит одинаково (рис. 2). После опыления (7ДПО) наблюдается различие в экспрессии гена hdt104, кодирующего гистоновую деацетилазу: в эндосперме линии АТ-3 наблюдается экспрессия hdt104, в то время как у контрольной линии этот ген репрессирован (рис. 2).
Заключение
Таким образом, установлено, что в экспрессии исследованных генов, связанных с метилированием ДНК (dmt102, dmt103, dmt105, hdt104, chr106, hon101), наблюдаются отличия у партеногенетической линии АТ-3 и контрольной линий в зародышевых мешках до опыления (ген dmt102), и в зародышах через 7 дней после опыления (ген hdt104). Спустя 3 и 7 дней после опыления в зародышах у исследованных партеногенетической (АТ-3) и контрольных линий кукурузы экспрессия всех генов, связанных с метилированием ДНК (кроме chr106), подавляется. Спустя семь дней после опыления разница между партеногенетической (АТ-3) и контрольной линиями наблюдается в экспрессии гена hdt104 в эндосперме – у линии АТ-3 наблюдается экспрессия гена hdt104, в то время как в эндосперме контрольной линии ген hdt104 репрессирован.
Благодарности
Статья посвящена памяти В.С. Тырнова, начавшего работы по апомиксису кукурузы более 40 лет назад и стимулировавшему наш интерес к данной тематике и к линии кукурузы АТ-3, полученной в его лаборатории. Авторы признательны Ю.В. Смолькиной за предоставленную возможность работать с линиями АТ-3 и ГПЛ-1. И.Б. Иванову мы благодарим за помощь в получении образцов завязей кукурузы.
- Волохина И.В., Моисеева Е.М., Гусев Ю.С., Гуторова О.В., Чумаков М.И. Анализ генов, контролирующих процесс слияния гамет, у гаплоиндуцирующей линии кукурузы ЗМС-П. Онтогенез. 2017. Т. 48(2). С. 134-139. doi:10.7868/S0475145017020094 @@ Volokhina I.V., Moiseeva E.M., Gusev Yu.S., Gutorova O.V., Chumakov M.I. Analiz genov, kontroliruyushchikh protsess sliyaniya gamet, u gaploindutsiruyushchey linii kukuruzy ZMS-P. Ontogenez. 2017. T. 48(2). S. 134-139. [Analysis of the gamete-fusion genes in the haploid-inducing ZMS-P maize line] (In Russian).
- Гуторова О.В., Апанасова Н.В., Юдакова О.И. Создание генетически маркированных линий кукурузы с наследуемым и индуцированным типами партеногенеза. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2016. T. 18(2). C. 341-344. @@ Gutorova O.V., Apanasova N.V., Yudakova O.I. Sozdanie geneticheski markirovannyh linij kukuruzy s nasleduemym i inducirovannym tipami partenogeneza. Izvestija Samarskogo nauchnogo centra Rossijskoj akademii nauk. 2016. V. 18(2). S. 341-344. [Creation the genetic marked corn lines with heritable and nonheritable types of haploid parthenogenesis] (In Russian).
- Тырнов В.С., Еналеева Н.Х. Автономное развитие зародыша и эндосперма у кукурузы. Доклады Академии Наук. 1983. Т. 272. С. 722-725. @@ Tyrnov V.S., Enaleeva N.Kh. Avtonomnoe razvitie zarodysha i endosperma u kukuruzy. Doklady Akademii Nauk. 1983. V. 272. S. 722-725. [Autonomous development of embryo and endosperm in corn] (In Russian).
- Хохлов С.С., Малышева Н.А. Распространение и формы апомиксиса у злаков. Апомиксис и селекция. М.: Наука. 1970. С. 21-55. @@ Khokhlov S.S., Malysheva N.A. Rasprostranenie i formy apomiksisa u zlakov. Apomiksis i selekcija. M .: Nauka. 1970. S. 21-55. [Distribution and forms of apomixis in cereals] (In Russian).
- Koltunow A.M., Grossniklaus U. Apomixis: a developmental perspective. Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V. 54. P. 547–574. doi:10.1146/annurev.arplant.54.110901.160842
- Bicknell R., Koltunow A. Understanding apomixis: recent advances and remaining conundrums. The Plant Cell. 2004. V. 16. P. 228-245. doi:10.1105/tpc.017921
- Bradley J., Carman J., Jamison M., Naumova T. Heterochonic feactures of the female germline among several sexual diploid Tripsacum L. (Andropogoneae, Poaceae). Sexual Plant Reproduction. 2007. V. 20. P. 9-17. doi:10.1007/s00497-006-0038-0
- Сое E.H. A line of maize high haploid frequency. American Naturalist. 1959. V.93. P.381–382.
- Enaleeva N.Kh., Tyrnov V.S. Cytological investigation of apomixis in AT-1 plants of corn. Maize Genetics Cooperation Newsletter. 1997. V. 71. P. 74-75.
- Garcia-Aguilar M., Michaud C., Leblanc O., Grimanelli D. Inactivation of a DNA methylation pathway in maize reproductive organs results in apomixis-like phenotypes. The Plant Cell. 2010. V. 22(10). P. 3249-3267. doi:10.1105/tpc.109.072181
- García-Aguilar M., Gillmor C.S. Zygotic genome activation and imprinting: parent-of-origin gene regulation in plant embryogenesis. Curr. Opin. Plant. Biol. 2015. V. 27. P. 29-35. doi:10.1016/j.pbi.2015.05.020
- Grimanelli D., García M., Kaszas E., Perotti E., Leblanc O. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 2003. V. 165(3). P. 1521-1531.
- Grimanelli D. Epigenetic regulation of reproductive development and the emergence of apomixis in angiosperms. Curr. Opin. Plant. Biol. 2012. V. 15(1). P. 57–62. doi:10.1016/j.pbi.2011.10.002
- Moiseeva Ye.M., Volokhina I.V., Gusev Yu.S., Gutorova O.V., Chumakov M.I. Analysis of the gamete-fusion genes in the haploid-inducing ZMS-P maize line. Rus. J. Dev. Biol. 2017. V. 48(2). P. 117–121. doi:10.1134/S1062360417020096
- Perotti E. Seed development and inheritance studies in apomictic maize-Tripsacum hybrids reveal barriers for the transfer of apomixis into sexual crops. Int. J. Dev. Biol. 2009. V. 53(4). P. 585-596. doi:10.1387/ijdb.082813ol