Ферменты фенолоксидазного комплекса азоспирилл во взаимодействии с растением-хозяином
Авторы:
Название:
Ферменты фенолоксидазного комплекса азоспирилл во взаимодействии с растением-хозяином
Страницы:
165-168
Для исследования зависимости активности фенолоксидаз от присутствия растения-хозяина, проводили инокуляцию трехсуточных стерильных проростков пшеницы сорта Саратовская 29 бактериями рода Azospirillum, с последующим сокультивированием в течение 4 недель. Обнаружено, что при инокуляции бактериями пшеницы происходит увеличение лакказной и Mn-пероксидазной активности в среде выращивания по сравнению с контрольными образцами. Полученные в ходе исследования данные указывают на то, что Mn-пероксидазы и лакказы аккумулируется в зоне бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, что свидетельствует о возможном участии данных ферментов в адаптации азоспирилл к условиям ризосферы. Вероятно, что продукция внеклеточных фенолоксидаз функционально значима не только для бактерий, но и для растения-хозяина. Лакказы, лигнин- и Mn-пероксидазы за счет окислительных реакций могут опосредовать снижение негативного действия токсических веществ, аккумулирующихся в почве.
Проблема молекулярных механизмов взаимодействия симбиотических микроорганизмов с растениями в зоне ризосферы, по-прежнему, остается особенно дискуссионной [Fibach-Paldi et al., 2011]. Одними из наиболее исследуемых модельных объектов ассоциативного симбиоза являются бактерии рода Azospirillum. Ранее нами была обнаружена способность бактерий рода Azospirillum к синтезу фенолокисляющих ферментов [Nikitina et al., 2010, Купряшина и др., 2012 / Kupryashina et al., 2012]. Мы предположили, что продукция фенолоксидаз, благодаря кинетическим свойствам данных ферментов, может быть связана с механизмами адаптации, позволяющими существовать азоспириллам в условиях ризосферы и преодолевать фенольный барьер, возникающий при становлении взаимодействий с растением-хозяином.
Для исследования зависимости активности Mn-пероксидазы, лигнин-пероксидазы и лакказы от присутствия растения хозяина, проводили инокуляцию трехсуточных стерильных проростков пшеницы сорта Саратовская 29 штаммами A. brasilense Sp245 и Sp7, с последующим сокультивированием в течение 4 недель на среде для выращивания растений [Шелудько и др., 2010 / Shelud'ko et al., 2010]. Активность ферментов определяли спектрофотометрически: Mn-пероксидазы по скорости окисления 2,6-диметоксифенола при λ=468 нм [Paszczynski et al., 1988], лигнин-пероксидазы по скорости окисления вератрилового спирта до вератрового альдегида при λ=310 нм [Orth et al., 1993], лакказы по скорости окисления сирингалдазина при λ=530 нм [Koroleva et al, 2002].
Было обнаружено, что при сокультивировании бактерий и пшеницы происходит увеличение лакказной и Mn-пероксидазной активности в среде выращивания по сравнению с вариантами, содержащими только бактерии, а также с неинокулированными образцами. Интересным представляется тот факт, что при совместном культивировании бактерий с растением-хозяином активность лигнин-пероксидазы детектировалась в следовых количествах, при этом различий между штаммами не отмечалось.
На следующем этапе работы с применением окрашивания специфическими хромогенными субстратами на фенолоксидазную активность (2,6-диметоксифенола и о-дианизидина) и метода световой микроскопии были получены микрофотографии скоплений бактериальных клеток на поверхности корня пшеницы. Из рисунка 1 видно, что зоны бактериальных скоплений окрашивалась 2,6-диметоксифенолом и о-дианизидином, что подтверждает факт накопления фенолокисляющих ферментов. В контрольных образцах, не содержащих бактерий, подобной окраски не наблюдалось. В случае инкубации инокулированных образцов корней с о-дианизидином отмечали появление темно-коричневого окрашивания только после внесения в реакционную среду перекиси, что свидетельствовало о проявлении активности пероксидаз фенолоксидазного комплекса. Аналогичное окрашивание отмечали как для эндофитного штамма A. brasilense Sp245, так и для A. brasilense Sp7, для которого характерна поверхностная колонизация корня.
Рис. 1. Световая микроскопия (a) контроль; (б) образец поверхности корня,
колонизированного штаммом A. brasilense Sp245 (окраска 2,6-диметоксифенол)
Fig. 1. Light microscopy (a) control; (b) sample of root surface colonized by
A. brasilense Sp245 strain (2,6-dimethoxyphenol staining)
Общеизвестно, что одним из основных способов выживания бактерий во внешней окружающей среде является образование скоплений и биопленок, внутри которых накапливаются биологически активные вещества и ферменты [Burdman et al., 2000]. Полученные данные указывают на то, что Mn-пероксидазы и лакказы аккумулируется в зоне бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, что свидетельствует о возможном участии данных ферментов азоспирилл в адаптации бактерии к условиям ризосферы.
Не исключено, что благодаря своей окислительной способности ферменты фенолоксидазного комплекса азоспирилл могут опосредованно влиять и на растение-хозяина, снижая действие токсических веществ, накапливающихся в почве. Относительно недавно, была показана эффективность фенолоксидаз грибов в биодеградации ремазола ярко-голубого [Sumandono et al., 2015]. Ремазол ярко-голубой R (Remasol Reactive Blue R 19, RRBR) – краситель, активно используемый в текстильной и целлюлозно-бумажной промышленности и являющийся распространенным трудно разлагаемым органополлютантом. Попадая с недоочищенными сточными водами в акваторию и в оросительные системы на поля сельскохозяйственного назначения, органополлютанты способны негативно влиять на плодородие почвы и урожай [Bhatt et al., 2000].
При культивировании на жидкой питательной среде в присутствии ремазола ярко-голубого мы обнаружили способность бактерий рода Azospirillum к обесцвечиванию данного красителя. Бактерии выращивали на жидкой малатно-солевой среде (МСС) [Dobereiner et al., 1976]. Далее было проведено исследование фитотоксичности ремазола до и после биодеградации. Исследование токсичности проводились по отношению к пшенице сорта Саратовская 29. Семена раскладывали в стерильные чашки Петри с двойным слоем увлажненной фильтровальной бумаги из расчета 15-20 семян на чашку, вносили жидкую питательную среду, содержащую 0,05 мМ ремазол ярко-голубой до и после биодеградации бактериями A. brasilense и культивировали при температуре 22°С. Для определения степени токсичности внесенного препарата оценивали % прорастания семян, длину корней и побегов через 5 дней инкубации (Таблица 1).
Таблица 1.
Фитотоксичность ремазола ярко-голубого R 19 до и после биодеградации
% прорастания семян Вес корней, мг Длина корней, мм Вес корней на одну зерновку, мг Вес проростков, мг Длина проростков, мм Вес проростков на одну зерновку, мг
МСС 75±4% 252±38 18±0,7 23±3 829±5 90±3 84±0,7
МСС, ремазол 39±2% 25±3 3,6±0,3 2,7±0,5 335±8 37±2 38±1,4
МСС, ремазол, после биодеградации 68±4% 330±28 21±1,2 25±1,7 1050±7 98±4 83±3
Table 1.
Phytotoxicity of remasol reactive blue R 19 before and after biodegradation
Seed germination percentage Root mass, mg Root length, mm Root mass for one caryopsis, mg Seedling mass, mg Seedling length, мм Seedling mass for one caryopsis, mg
malate-salt medium (MSM) 75±4%
252±38 18±0,7 23±3 829±5 90±3 84±0,7
MSM, remasol 39±2% 25±3 3,6±0,3 2,7±0,5 335±8 37±2 38±1,4
MSM, remasol, after biodegradation 68±4% 330±28 21±1,2 25±1,7 1050±7 98±4 83±3
Рис. 2. Токсичность ремазола ярко-голубого по отношению к пшенице до (1) и после
биодеградации азоспириллами (2)
Fig. 2. Toxicity of remasol reactive blue R 19 to wheat before (1) and after biodegradation by Azospirillum (2)
Установлено, что % прорастания семян, а также вес и длина корней и проростков значительно снижались, при культивировании пшеницы в присутствии ремазола ярко-голубого, как по сравнению контролем, так и с вариантами, инкубируемыми с продуктом разложения ремазола под действием азоспирилл (Таблица 1, Рис. 2). Следовательно, биодеградация красителя микробной культурой, привела к его детоксикации.
Полученные в рамках настоящей работы результаты расширяют представления об адаптивных возможностях азоспирилл и вносят дополнительные коррективы в понимание участия фенолоксидаз во взаимодействии микропартнера с растением-хозяином при становлении растительно-бактериальной ассоциации.
Для исследования зависимости активности Mn-пероксидазы, лигнин-пероксидазы и лакказы от присутствия растения хозяина, проводили инокуляцию трехсуточных стерильных проростков пшеницы сорта Саратовская 29 штаммами A. brasilense Sp245 и Sp7, с последующим сокультивированием в течение 4 недель на среде для выращивания растений [Шелудько и др., 2010 / Shelud'ko et al., 2010]. Активность ферментов определяли спектрофотометрически: Mn-пероксидазы по скорости окисления 2,6-диметоксифенола при λ=468 нм [Paszczynski et al., 1988], лигнин-пероксидазы по скорости окисления вератрилового спирта до вератрового альдегида при λ=310 нм [Orth et al., 1993], лакказы по скорости окисления сирингалдазина при λ=530 нм [Koroleva et al, 2002].
Было обнаружено, что при сокультивировании бактерий и пшеницы происходит увеличение лакказной и Mn-пероксидазной активности в среде выращивания по сравнению с вариантами, содержащими только бактерии, а также с неинокулированными образцами. Интересным представляется тот факт, что при совместном культивировании бактерий с растением-хозяином активность лигнин-пероксидазы детектировалась в следовых количествах, при этом различий между штаммами не отмечалось.
На следующем этапе работы с применением окрашивания специфическими хромогенными субстратами на фенолоксидазную активность (2,6-диметоксифенола и о-дианизидина) и метода световой микроскопии были получены микрофотографии скоплений бактериальных клеток на поверхности корня пшеницы. Из рисунка 1 видно, что зоны бактериальных скоплений окрашивалась 2,6-диметоксифенолом и о-дианизидином, что подтверждает факт накопления фенолокисляющих ферментов. В контрольных образцах, не содержащих бактерий, подобной окраски не наблюдалось. В случае инкубации инокулированных образцов корней с о-дианизидином отмечали появление темно-коричневого окрашивания только после внесения в реакционную среду перекиси, что свидетельствовало о проявлении активности пероксидаз фенолоксидазного комплекса. Аналогичное окрашивание отмечали как для эндофитного штамма A. brasilense Sp245, так и для A. brasilense Sp7, для которого характерна поверхностная колонизация корня.
Рис. 1. Световая микроскопия (a) контроль; (б) образец поверхности корня,
колонизированного штаммом A. brasilense Sp245 (окраска 2,6-диметоксифенол)
Fig. 1. Light microscopy (a) control; (b) sample of root surface colonized by
A. brasilense Sp245 strain (2,6-dimethoxyphenol staining)
Общеизвестно, что одним из основных способов выживания бактерий во внешней окружающей среде является образование скоплений и биопленок, внутри которых накапливаются биологически активные вещества и ферменты [Burdman et al., 2000]. Полученные данные указывают на то, что Mn-пероксидазы и лакказы аккумулируется в зоне бактериальных скоплений, на поверхности корня инокулированного растения, что свидетельствует о возможном участии данных ферментов азоспирилл в адаптации бактерии к условиям ризосферы.
Не исключено, что благодаря своей окислительной способности ферменты фенолоксидазного комплекса азоспирилл могут опосредованно влиять и на растение-хозяина, снижая действие токсических веществ, накапливающихся в почве. Относительно недавно, была показана эффективность фенолоксидаз грибов в биодеградации ремазола ярко-голубого [Sumandono et al., 2015]. Ремазол ярко-голубой R (Remasol Reactive Blue R 19, RRBR) – краситель, активно используемый в текстильной и целлюлозно-бумажной промышленности и являющийся распространенным трудно разлагаемым органополлютантом. Попадая с недоочищенными сточными водами в акваторию и в оросительные системы на поля сельскохозяйственного назначения, органополлютанты способны негативно влиять на плодородие почвы и урожай [Bhatt et al., 2000].
При культивировании на жидкой питательной среде в присутствии ремазола ярко-голубого мы обнаружили способность бактерий рода Azospirillum к обесцвечиванию данного красителя. Бактерии выращивали на жидкой малатно-солевой среде (МСС) [Dobereiner et al., 1976]. Далее было проведено исследование фитотоксичности ремазола до и после биодеградации. Исследование токсичности проводились по отношению к пшенице сорта Саратовская 29. Семена раскладывали в стерильные чашки Петри с двойным слоем увлажненной фильтровальной бумаги из расчета 15-20 семян на чашку, вносили жидкую питательную среду, содержащую 0,05 мМ ремазол ярко-голубой до и после биодеградации бактериями A. brasilense и культивировали при температуре 22°С. Для определения степени токсичности внесенного препарата оценивали % прорастания семян, длину корней и побегов через 5 дней инкубации (Таблица 1).
Таблица 1.
Фитотоксичность ремазола ярко-голубого R 19 до и после биодеградации
% прорастания семян Вес корней, мг Длина корней, мм Вес корней на одну зерновку, мг Вес проростков, мг Длина проростков, мм Вес проростков на одну зерновку, мг
МСС 75±4% 252±38 18±0,7 23±3 829±5 90±3 84±0,7
МСС, ремазол 39±2% 25±3 3,6±0,3 2,7±0,5 335±8 37±2 38±1,4
МСС, ремазол, после биодеградации 68±4% 330±28 21±1,2 25±1,7 1050±7 98±4 83±3
Table 1.
Phytotoxicity of remasol reactive blue R 19 before and after biodegradation
Seed germination percentage Root mass, mg Root length, mm Root mass for one caryopsis, mg Seedling mass, mg Seedling length, мм Seedling mass for one caryopsis, mg
malate-salt medium (MSM) 75±4%
252±38 18±0,7 23±3 829±5 90±3 84±0,7
MSM, remasol 39±2% 25±3 3,6±0,3 2,7±0,5 335±8 37±2 38±1,4
MSM, remasol, after biodegradation 68±4% 330±28 21±1,2 25±1,7 1050±7 98±4 83±3
Рис. 2. Токсичность ремазола ярко-голубого по отношению к пшенице до (1) и после
биодеградации азоспириллами (2)
Fig. 2. Toxicity of remasol reactive blue R 19 to wheat before (1) and after biodegradation by Azospirillum (2)
Установлено, что % прорастания семян, а также вес и длина корней и проростков значительно снижались, при культивировании пшеницы в присутствии ремазола ярко-голубого, как по сравнению контролем, так и с вариантами, инкубируемыми с продуктом разложения ремазола под действием азоспирилл (Таблица 1, Рис. 2). Следовательно, биодеградация красителя микробной культурой, привела к его детоксикации.
Полученные в рамках настоящей работы результаты расширяют представления об адаптивных возможностях азоспирилл и вносят дополнительные коррективы в понимание участия фенолоксидаз во взаимодействии микропартнера с растением-хозяином при становлении растительно-бактериальной ассоциации.
- Купряшина М.А., Селиванов Н.Ю., Никитина В.Е. Выделение и очистка Mn-пероксидазы Azospirillum brasilense Sp245. Прикл. биохим. и микробиол. 2012. Т. 48. С.23–26. @@ Kupryashina M.A., Selivanov N.Yu., Nikitina V.E. Isolation and purification of Mn–peroxidase from Azospirillum brasilense Sp245. Appl. Biochem. Microbiol. 2012. V. 48. P. 17-20. (In Russian).
- Никитина В.Е., Ветчинкина Е.П., Пономарева Е.Г., Гоголева Ю.В. Фенолоксидазная активность бактерий рода Azospirillum. Микробиология. 2010. Т. 79. С. 344–351. @@ Nikitina V.E., Vetchinkina E.P., Ponomareva E.G., Gogoleva Yu.V. Phenol oxidase activity in bacteria of the genus Azospirillum. Microbiol. 2010. V. 79. P. 327–333. (In Russian).
- Шелудько А.В., Широков А.А., Соколова М.К., Соколов О.И., Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Колонизация корней пшеницы бактериями Azospirillum brasilense с различной подвижностью. Микробиология. 2010. Т. 79. С. 696–704. @@ Shelud'ko A.V., Shirokov A.A., Sokolova M.K., Sokolov O.I., Petrova L.P., Matora L.Y., Katsy E.I. Wheat root colonization by Azospirillum brasilense strains with different motility. Microbiol.2010. V. 79. P. 688–695. (In Russian).
- Bhatt M., Patel M., Rawal B., Novotny C., Molitoris H., Sasek V. Biological decolorization of the synthetic dye RBBR in contaminated soil. World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 16. P. 195-198.
- Burdman S., Okon Y., Jurkevitch E. Surface haracteristics of Azospirillum brasilense in relation to cell aggregationand attachment to plant roots. Critic. Rev. Microbiol. 2000. V. 26. P. 91-110.
- Fibach-Paldi S., Burdman S., Okon Y. Key physiological properties contributing to rhizosphere adaptation and plant growth promotion abilities of Azospirillum brasilense. FEMS Microbiol. Lett. 2012. V. 326. P. 99-108.
- Koroleva O. V., Stepanova E. V., Gavrilova V. P., Ikovleva N. S., Landesman E. O., Iavmetdinov I. S., Iaropolov A. I. Laccase and Mn-peroxidase production by Coriolus lirgutus strain 075 in a jan fermentor. J. Bioscien. Bioengineer. 2002. V. 93. P. 449–455.
- Orth A.B., Royse D.J., Tien M. Ubiquity of lignin-degrading peroxidases among various wood-degrading fungi. Appl. Envir. Microb. 1993. V. 59. P. 4017–4023.
- Paszczynski A., Crawford R., Huynh V.B. Manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium: purification. Methods Enzymol. 1988. V. 161. P. 264–270.
- Sumandono T., Saragiha H., Watanabeb T., Amirta R. Decolorization of remazol brilliant blue R by new isolated white rot fungus collected from tropical rain forest in East Kalimantan and its ligninolytic enzymes activity. Proced. Environmen. Sci. 2015. V. 28. P. 45-51.