Генетическая регуляция азотфиксации у бактерий

В процессе азотфиксации важнейшую роль играет генетическая регуляция экспрессии nif-генов (от англ. nitrogen fixation)
кодирующих белки-ферменты нитрогеназного комплекса
непосредственно участвующие в процессе фиксации азота. Филогенетическое положение nif-генов
как свободноживущих
так и симбиотических азотфиксаторов
весьма разнообразно и не всегда коррелирует с положением других sym-генов
что может говорить об их различном эволюционном происхождении.
У свободноживущих азотфиксаторов уровень азотфиксации регулируется несколькими путями. Первым из них является количество мочевины или других азотистых соединений в среде. При их повышенном содержании происходит ингибирование процесса азотфиксации
[Krapp
2015].
У протеобактерий главными регуляторами генов белков
участвующих в процессе фиксации азота являются RpoN и NifA. Альтернативный сигма-фактор 54 (RpoN) используется многими бактериями для транскрипции генов
участвующих в широком спектре клеточных функций
таких как использование азота
вирулентность
реакции стресса и биосинтез жгутиков. RpoN связывается с промоторами -24 / -12-типа с консенсусной последовательностью TGGCACGNNNNTTGC
[De Meyer
2016]. Однако для инициирования транскрипции ему требуется наличие энхансер-связывающего белка (EBP)
которым является регулятор транскрипции NifA. Также NifA играет центральную роль в качестве активатора транскрипции для экспрессии гена нитрогеназы (nifHDK)
[Thiel
2017]. Ген nifA широко распространен в аэробах (исключение - Cyanobacteria)
но практически не встречается у анаэробов (основное исключение - Chlorobi). Активность белка NifA контролируется уровнем O2 и NH4+
а также концентрацией 2-оксиглютората
[Lee
2014; De Bruijn
2015]. Однако
у некоторых Gammaproteobacteria существует механизм регуляции активации nifA через NifL
который является регуляторным белком
и ведет себя как репрессор s54-зависимого белка-активатора NifA. Белки NifL и NifA функционируют вместе в ответ на изменение окислительно-восстановительного
азотного и углеродного статуса бактерии и далее контролируются трансдукционным белком GlnK. Ген nifL находится непосредственно перед nifA. Мутации
вызывающие нарушения экспрессии гена nifL в опероне nifLA
приводят к повышенной азотфиксации
[Remigi
2016; Gao
2016].
Существует также два вспомогательных nif-ассоциированных комплекса (Rnf и Fix): комплекс Rnf отвечает за фиксацию азота у Rhodobacter и комплекс FixAB связан с электронтранспортным флавопротеином (Etf)
а FixCX связан с Etf-хинонредуктазой. Кроме того
белок Rnf1 играет важную роль в работе электрон-транспортных систем
[Hui
2014].
Биологическая фиксация азота является энергозатратным процессом и требует большого количества АТФ. Для этого
например
у некоторых бактерий есть специфический кластер гена АТФ-синтазы. Продукт экспрессии данного генного кластера обеспечивает повышенный синтез АТФ
[Terpolilli
2016; Nova-Franco
2015].
Фермент нитрогеназа состоит из гомодимерного белкового компонента NifH (Fe белка)
который передает электроны в гетеротетрамерный белок NifDK (белок MoFe)
который содержит O2-чувствительный железо-молибденовый кофактор (FeMo-кофактор)
сайт восстановления субстрата
[Suganuma
2014]. Mо-содержащий белок нитрогеназы содержит несколько важных металлов-кофакторов
включая FeMo-кофактор
[Udvard
2013]. Повышенное содержание молибдена в среде приводит к повышению уровня азотфиксации. Доступность металлов является важным фактором
ограничивающим уровень транскрипции nif-генов. Гены
кодирующие Fe-содержащий белок (nifH) и MoFe-белок (nifDK)
обладают повышенным уровнем транскрипции
что приводит к повышенной наработке белков NifH и NifDK. Эти металлсодержащие белки относятся к числу самых сложных белковых кластеров
известных в природе
и требуют значительного уровня содержания железа в среде
[Cheng
2016]. В дополнение к этим структурным белкам нитрогеназы
кластеры nif-генов могут кодировать белки
участвующие в регуляции азотфиксации (NifALI1I2)
переносе электронов (NifFJ) и биосинтезе FeMo-кофактора (NifXENBQUVYS)
а также белков с еще неопределенными функциями. В филогении NifHDK кластера четко прослеживается эволюционное разделение между аэробами и анаэробами
которое выражается в образовании двух различных ветвей. Функциональный состав кластеров nif-генов значительно различается среди таксонов
где они варьируют от минимального состава генов
которые кодируют активную нитрогеназу (nifHDKEB)
а также несколько регуляторных белков (Methanocaldococcus sp.)
до бактерий
которые содержат более 20 генов (Azotobacter vinelandii). Показано
что Nif-белки появились у метаногенных бактерий
а в процессе эволюции их число увеличилось
[Nelson
2015].
По всей видимости O2 оказал значительное влияние на эволюцию Nif-белков путем набора конкретных вспомогательных белков
которые участвуют в регуляции ферментов и их созревании. Важные изменения в структуре nif-генов произошли при переходе бактерий-азотфиксаторов из анаэробных условий существования к аэробным
[Mus,2016].
В результате эволюционного отбора образовался улучшенный FeMo-кофактор. Белок NifZ был включен в биосинтетический Р кластер в MoFe-белке и может участвовать в репарации этого кластера у A. vinelandii и Klebsiella pneumoniae. Белок NifW образует комплекс с MoFe-белком при воздействии O2
и может участвовать в защите нитрогеназы от инактивации O2. Гены nifZ и nifW
улучшают созревание нитрогеназы и её ферментативную стабильность
nifQ требуется для активности Mo-нитрогеназы в A. vinelandii  и K. pneumoniae при выращивании в условиях среды
содержащей Mo для биосинтеза FeMo-кофактора
[Walker
2015; Maróti
2014; De Mita
2014].
Ген nifW встречается у всех аэробных диазотрофов
включая Actinobacteria. Белок NifW образует комплекс с MoFe белком при воздействии O2. Ген nifX также присутствует во всех аэробных геномах и в некоторых анаэробных протеобактериальных геномах. Вероятно
ген nifX появился до перехода от анаэробной к аэробной фиксации N2. Белок NifX связывает FeMo-кофактор когда не нужна Mo-зависимая фиксация N2. Гены nifT и nifZ содержатся в настоящее время во всех родах
за исключением Actinobacteria
вероятно эти гены появились после разделения родов. По неизвестным причинам гены nifA и nifQ отсутствуют в актинобактериях и цианобактериях. Переход нитрогеназы от анаэробной к аэробной среде был связан с переходом от пострансляционного регулирования в анаэробах (NifI1I2) к регуляции на уровне транскрипции (NifA) у облигатных аэробов и факультативных анаэробов.
Ризобии представляют из себя группу микроорганизмов
способных к симбиотической фиксации азота в симбиозе с бобовыми растениями. Из-за чувствительности нитрогеназного комплекса к кислороду
для фиксации азота ему требуются условия с низким содержанием кислорода. У азотфиксирующих бактерий требование к низкому содержанию кислорода окружающей среды и потребности в дыхании для производства ATP является парадоксальным
[Barron
2009; Foster
2011]. У большинства ризобий экспрессию fix-генов
регулирует двухкомпонентная система FixL-FixJ (TCS)
[Herridge
2008; González
2014].
Эксперименты показывают
что для индукции экспрессии nifA гена в вегетативном росте у быстрорастущих видов Sinorhizobium sp. достаточно микроаэробных условий (S. meliloti). Когда концентрация кислорода снижается до соответствующих уровней
экспрессия гена nifA индуцируется до уровней
больших
чем те
которые наблюдаются в клубеньках люцерны. Промоторы в S. meliloti (P1 и P2)
активирующие экспрессию гена nifA
могут индуцироваться спонтанно. Экспрессия гена nifA
и функции белка NifA практически не зависят от наличия в среде фиксированного азота. В клубеньках бобовых низкая концентрация свободного О2 достигается действием белка леггемоглобина
который является симбиотическим специфическим растительным белком
сходным с бактериальными цитохромами
[De Meyer
2016]. Это одновременно защищает нитрогеназу от необратимого ингибирования кислородом и обеспечивает достаточное количество кислорода для бактериального дыхания и выработки энергии. Для штаммов медленнорастущих ризобий
которые
способны к несимбиотической фиксации азота
для индукции также необходимы микроаэробные условия. Микроаэробная индукция экспрессии гена nifA может происходить в присутствии фиксированных источников азота. Это происходит потому
что ризобии фиксируют азот в основном для экспорта к их симбиотическому хозяину
а не для поддержания вегетативного роста.
У бактерий
относящихся к роду Sinorhizobium
гены fixL и fixJ закодированы в одном опероне в симбиотической плазмиде pSymA. Ген fixL кодирует каноническую гистидинкиназу
которая прикрепляется к клеточной мембране. Аутофосфорилирующая и фосфатазная активности белка FixL регулируются концентрацией кислорода и активностью антикиназного регулятора FixT
[Diaz
2017; Kneip
2007]. Белок FixL воспринимает кислород через гем-фрагмент
связанный с консервативным доменом PAS
[Lechene
2007]. Когда концентрация кислорода низкая
фосфатная группа в белке FixL может быть передана регулятору реакции ответа FixJ. В этих условиях белок FixJ-P отвечает за активацию генов nifA и fixK
[Rondon
2007]. FixK является индуктором оперона fixNOQP
который кодирует cbb3 цитохромоксидазу.
В других ризобиях
таких как Bradyrhizobium japonicum регулирование nifA и fixK разделяется на два сегмента. Сегмент двухкомпонентной системы RegS-RegR активирует ген nifA
а сегмент FixL-FixJ отвечает за активацию гена fixK
[Scott
2010]. Интересно
что не все ризобии используют белки двухкомпонентной системы FixL-FixJ для активации экспрессии гена fixK и FixK регулона. В Rhizobium etli и Rhizobium leguminosarum bv. viciae белок FixL представляет собой гибридную гистидинкиназу (hFixL) без трансмембранных сегментов. Этот ген расположен на плазмиде pCFN42f в области
которая содержит копии генов fixK
fixNOQP и fixG
[Sohm
2011]. У R. etli белок hFixL инициирует регуляторную цепочку fix генов в координации с белком FxkR
принадлежащим к семейству OmpR / PhoB
без участия белка FixJ
[Stucke
2017]. У R. etli белок FxkR непосредственно активирует экспрессию гена fixKf в ответ на низкую концентрацию кислорода путем связывания с определенной последовательностью
называемой K-box (GTTACANNNNGTTACA)
расположенной в регулоне fixKf. Белок hFixL R. etli содержит
в дополнение к N-терминальному гемсвязывающему PAS домену
второй домен без гемсвязывающего PAS домена и C-концевой домен. Биохимические исследования показывают
что этот белок обладает очень низким сродством к O2. Мутантные штаммы бактерий
не имеющие гемсвязывающего PAS домена или обладающие ошибочно фосфорилированными сайтами (Asp) в С-концевом домене обладают повышенной аффинностью белка к O2
[Larmola
2014]. Подобные hFixL и FxkR-белки
располагающиеся в непосредственной близости от гена fixKf
были обнаружены у нескольких альфапротеобактерий
включая S. meliloti
[Yan
2008]. Гены hfixL
fxkR и fixKf-подобный ген расположены на pSymA
[Zehr
2011]. Однако ген fxkR имеет мутацию
связанную с рамкой считывания
которая приводит к образованию нефункционального регулятора экспрессии. Эта мутация рамки считывания отсутствует в геноме штамма S. meliloti SM11
который относится к доминирующим аборигенным штаммам
выделенным из клубеньков люцерны в Германии
[Franck
2015; Masepohl
2017]. Геном этого штамма состоит из хромосомы
двух мегаплазмид (pSmeSM11c и pSmeSM11d) и двух меньших плазмиды (pSmeSM11a и pSmeSM11b)
[Knoth
2014]. Геном S. meliloti SM11 кодирует как уникальные гены
так и повторяющиеся fix гены. Оперон fixL-fixJ
а также три fix-оперона NOQP
два гена fixT и fixK и один оперон fixGHIS кодируются на мегаплазмиде pSmeSM11c. Этот репликон также содержит усеченную копию fixJ
расположенную перед опероном fixNOQP-2 и генами fixH
fixI и fixS
расположенными ниже по направлению от fixNOQP-3. Отсутствие анаэробокса (TTGNNNNNNNNCAA) в регуляторной области оперона fixNOQP-3 предполагает
что он не находится под контролем Fnr-подобного регулятора. Регулирующий регион fixKa имеет консервативный K-бокс. Установлено
что промотор fixKa объединен с геном uidA
который индуцируется в микроаэробных условиях у R. etli. Экспрессия гена fixKa в этом случае зависит от наличия hFixL и FxkR. Обнаружено
что в S. meliloti SM11 двухкомпонентная система hFixL-FxkR отрицательно регулирует экспрессию генов fixN1
fixK1 по неизвестному механизму.
Еще одной интересной особенностью этого регуляторного каскада является наличие небольшого белка FixT
который действует как ингибитор киназной активности  белка FixL. Белок FixK активирует ген fixT
кодирующий автономный принимающий белковый домен
который ингибирует белок FixL
[DeLuca
2008].
Таким образом
генетическая регуляция азотфиксации осуществляется сложным комплексом генов. Состав и структура данных генов
а также способы их регуляции различаются у свободноживущих и симбиотических азотфиксирующих бактерий. Это связано прежде всего с эволюционным развитием данных бактерий и сменой условий обитания
т.е. переходом от анаэробных к аэробным условиям жизни
что привело к усложнению генетической системы азотфиксации. Поэтому дальнейшее изучение регуляторных механизмов азотфиксации и их понимание имеет важное значение для создания растительно-микробных систем
ценных для человечества.

1. Cheng G. et al. Multiplicity of sulfate and molybdate transporters and their role in nitrogen fixation in Rhizobium leguminosarum bv. viciae Rlv3841 // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2016. V. 29. P. 143-152. doi:10.1094/MPMI-09-15-0215-R
2. De Bruijn F. J. Biological nitrogen fixation // Principles of Plant-Microbe Interactions. – Springer International Publishing. 2015. P. 215-224. doi:10.1007/978-3-319-08575-3_23
3. De Meyer S. E. et al. Symbiotic Burkholderia species show diverse arrangements of nif/fix and nod genes and lack typical high-affinity cytochrome cbb3 oxidase genes // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2016. V. 29. P. 609-619. doi:10.1094/MPMI-05-16-0091-R
4. De Mita S. et al. Evolution of a symbiotic receptor through gene duplications in the legume–rhizobium mutualism // New phytologist. 2014. V. 201. P. 961-972. doi:10.1111/nph.12549
5. Gao J. et al. Quorum sensing in nitrogen fixation // Springer India. 2015. P. 51-60. doi:10.1007/978-81-322-1982-8_5
6. Gao M. et al. Regulation of fixLJ by Hfq Controls Symbiotically Important Genes in Sinorhizobium meliloti // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2016. V. 29. P. 844-853. doi:10.1094/MPMI-09-16-0182-R
7. Geddes B. A.Oresnik I. J. The mechanism of symbiotic nitrogen fixation // The Mechanistic Benefits of Microbial Symbionts. Springer International Publishing. 2016. P. 69-97. doi:10.1007/978-3-319-28068-4_4
8. Hui K. Metabolism and host specificity in the Rhizobium leguminosarum species complex. // University of York. 2014. 228 P.
9. Krapp A. Plant nitrogen assimilation and its regulation: a complex puzzle with missing pieces // Current Opinion in Plant Biology. 2015. V. 25. P. 115-122. doi:10.1016/j.pbi.2015.05.010
10. Lee S. G.Krishnan H. B.Jez J. M. Structural basis for regulation of rhizobial nodulation and symbiosis gene expression by the regulatory protein NolR // Proc. Nat. Acad. Sci. 2014. V. 111. P. 6509-6514. doi:10.1073/pnas.1402243111.
11. Maróti G.Kondorosi É. Nitrogen-fixing Rhizobium-legume symbiosis: are polyploidy and host peptide-governed symbiont differentiation general principles of endosymbiosis? // Frontiers in Microbiology. 2014. V. 5. 326 P. doi:10.3389/fmicb.2014.00326
12. Mus F. et al. Symbiotic nitrogen fixation and the challenges to its extension to nonlegumes // Appl. Environ. microbiol. 2016. V. 82. P. 3698-3710. doi:10.1128/AEM.01055-16
13. Nelson M. S.Sadowsky M. J. Secretion systems and signal exchange between nitrogen-fixing rhizobia and legumes // Frontiers in Plant Science. 2015. V. 6. 491 P. doi:10.3389/fpls.2015.00491
14. Nova-Franco B. et al. The micro-RNA172c-APETALA2-1 node as a key regulator of the common bean-Rhizobium etli nitrogen fixation symbiosis // Plant Physiology. 2015. V. 168. №. 1. P. 273-291. doi:10.1104/pp.114.255547
15. Oldroyd G. E. D.Dixon R. Biotechnological solutions to the nitrogen problem // Current Opinion in Biotechnology. 2014. V. 26. P. 19-24. doi:10.1016/j.copbio.2013.08.006
16. Remigi P. et al. Symbiosis within symbiosis: evolving nitrogen-fixing legume symbionts // Trends in microbiology. 2016. V. 24. P. 63-75. doi:10.1016/j.tim.2015.10.007
17. Suganuma N. Lotus genes involved in nodule function and nitrogen fixation // The Lotus japonicus Genome. Springer BerlinHeidelberg. 2014. P. 79-84. doi:10.1007/978-3-662-44270-8_8
18. Sulieman S.Tran L. S. P. Symbiotic nitrogen fixation in legume nodules: Metabolism and regulatory mechanisms. // Int. J. Mol. Sci. 2014. V.15. № 11. P.19389-19393. doi:10.3390/ijms151119389
19. Terpolilli J. J. et al. Lipogenesis and redox balance in nitrogen-fixing pea bacteroids // Journal of Bacteriology. 2016. V. 198. P. 2864-2875. doi:10.1128/JB.00451-16
20. Thiel T.Pratte B. S. Regulation of three nitrogenase gene clusters in the cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413 / /Life. 2014. V. 4. №. 4. P. 944-967. doi:10.3390/life4040944.
21. Udvardi M.Poole P. S. Transport and metabolism in legume-rhizobia symbioses // Annual Review of Plant Biology. 2013. V. 64. P. 781-805. doi:10.1146/annurev-arplant-050312-120235
22. Walker R. et al. Symbiotic nitrogen fixation in legumes: perspectives on the diversity and evolution of nodulation by Rhizobium and Burkholderia species // Biological Nitrogen Fixation. 2015. P. 913-925.