Биобаллистическая трансформация Triticum aestivum rol-генами Agrobacterium rhizogenes

Авторы:
Гумерова Г.Р. , Кулуев Б.Р. , Кагирова А.С. , Вершинина З.Р. , Чемерис А.В.
Название:
Биобаллистическая трансформация Triticum aestivum rol-генами Agrobacterium rhizogenes
Страницы:
317-324
скачано
28 раз(а)


Культура hairy roots или косматых корней является одним из наиболее востребованных биотехнологических объектов для получения ценных вторичных метаболитов растений. Главными недостатками существующих методик получения hairy roots является достаточно трудоемкий и долгий процесс избавления от агробактерий и большая зависимость эффективности трансформации от штамма Agrobacterium rhizogenes и вида инфицируемого растения. Еще одним значительным недостатком этих методов является то что они в основном подходят для трансформации двудольных растений тогда как у однодольных и голосеменных растений такими способами получить косматые корни весьма затруднительно. Для преодоления существующих трудностей нами был предложен прямой метод биобаллистической трансформации каллусов растений rol-генами. В представленной работе для генетической трансформации были использованы каллусы мягкой пшеницы Triticum aestivum. В результате бомбардировки было получено 3 различных морфотипа адвентивных корней пшеницы: морфотип 1 - короткие неветвящиеся корни морфотип 2 - длинные ветвящиеся корни; морфотип 3 - корни с многочисленными очагами каллусообразования. ПЦР-анализ адвентивных корней морфотипа 2 которые по фенотипическим признакам напоминали истинные косматые корни на присутствие rol-генов оказался отрицательным. Несмотря на отсутствие в их геномах rol-генов адвентивные корни пшеницы характеризовались способностью к длительному росту в изолированных культурах. При дальнейшем культивировании у некоторых линий адвентивных корней пшеницы характеризующихся неограниченным ростом наблюдали спонтанное позеленение что возможно способствовало долгому росту этих корней на безгормональной среде. Изолированно растущие культуры зеленых адвентивных корней однодольных могут стать альтернативой истинным hairy roots которые довольно трудно получить у представителей этого класса растений.
Введение Культура hairy roots или косматых корней является одним из наиболее востребованных альтернативных источников ценных вторичных метаболитов растений [Кулуев и др. 2015а]. Поиски новых биотехнологических подходов в продукции полезных соединений во многом обусловлены ограниченностью запасов лекарственного сырья невозможностью выращивания многих видов растений с помощью плантационного метода а также трудностями разработки путей химического синтеза многих природных соединений [Михайлова и др. 2017]. Существует большое количество исследований в которых показано что содержание вторичных метаболитов в культуре косматых корней может значительно превышать их концентрацию в интактных растениях [Murthy 2008; Esam 2011; Jeeshna Paulsamy 2011]. Полученные культуры корней могут использоваться для наработки различных вторичных метаболитов - алкалоидов терпеноидов фенолов гликозидов и др. [Sharifi et al. 2013] часть из которых служит сырьем для получения лекарственных препаратов или относится к другим хозяйственно-ценным соединениям например инулин полиизопрен [Кулуев и др. 2015б] и др. Культуру hairy roots получают в результате инфицирования растительной ткани почвенной фитопатогенной бактерией Agrobacterium rhizogenes которая переносит в геном растений особые онкогены называемые rol-генами (A B C и D) что в свою очередь вызывает образование генетически трансформированных косматых корней преимущественно у двудольных растений. Главными недостатками существующих методик получения hairy roots является довольно трудоемкий и долгий процесс избавления от агробактерий и большая зависимость эффективности трансформации от штамма A. rhizogenes вида и даже сорта (разновидности подвида) инфицируемого растения. Более того эти методы в основном подходят только для трансформации двудольных растений тогда как у однодольных и голосеменных растений такими способами получить косматые корни весьма затруднительно. Однако известны единичные работы по успешной трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens несущей конструкции с rol-генами некоторых представителей голосеменных [McAfee et al. 1993; Magnussen et al. 1994; Mihaljevic et al. 1996; Yibrah et al. 1995; Xu et al. 2006] и злаковых таких как рис [Lee et al. 2001] и бизонья трава [Aguado-Santacruz et al. 2009]. Это говорит о принципиальной возможности получения косматых корней у однодольных однако проблема заключается в отсутствии эффективных методов доставки и встройки rol-генов в геномы этой группы растений. В настоящее время в биотехнологии растений довольно часто появляются задачи по получению косматых корней однодольных растений например для получения важных фармакологических стероидов из Dioscorea deltoidea [Avula et al. 2014]. Более того и при работе со многими двудольными растениями также возникают проблемы и их довольно часто не удается трансформировать при помощи агробактерий. Например у такого лекарственного растения как Tribulus terrestris L. до сих пор не удается индуцировать косматые корни для получения ß-карболиновых алкалоидов [Sharifi et al. 2014]. В связи с существующими ограничениями агробактериальной трансформации однодольных и некоторых двудольных растений возникает необходимость использования других более универсальных подходов подразумевающих прямой перенос агробактериальных онкогенов без участия A. tumefaciens и A. rhizogenes. Одним из таких перспективных методов генетической модификации без участия агробактерий может стать биобаллистическая трансформация rol-генами которая позволяет обходить зависимость эффективности трансформации от штамма A. rhizogenes и вида инфицируемого растения [Ясыбаева и др. 2016]. Для преодоления этих трудностей нами ранее был предложен метод безбактериального получения косматых корней. Сущность данного подхода заключается в биобаллистической трансформации стерильных растительных эксплантов микрочастицами золота покрытых ампликоном содержащим все четыре rol-гена и ограниченного с двух сторон Т-границами Т-ДНК A. rhizogenes. Ранее данная технология нами была испытана на модельном объекте табаке и была показана принципиальная возможность переноса rol-генов в геном растений при использовании данного подхода [Yasybaeva et al. 2017]. Можно предположить что разработанный нами безбактериальный метод создания косматых корней может оказаться эффективным и при трансформации клеток однодольных. Для проверки этой гипотезы в представленной работе нами в качестве объекта трансформации была выбрана мягкая пшеница T. aestivum как представитель класса однодольных. Основной целью работы было испытание разработанного нами безбактериального и безплазмидного метода трансформации rol-генами на одном из представителей класса однодольных - мягкой пшенице. Материалы и методы В качестве объекта трансформации был использован семенной материал мягкой пшеницы T. aestivum сорта «Радуга». Для выделения зародышей незрелые семена пшеницы (на 14-е сутки после опыления) стерилизовали 70% этиловым спиртом в течение 2 минут затем 15 мин раствором 15%-ной белизны с добавлением 1 мкл 100% Tween 20 отмывали 5 раз стерильной дистиллированной водой. Для индукции каллусов изолированные из семян незрелые зародыши высаживали щитком вниз в чашки с агаризованной питательной средой МС с добавлением 375 мг/л L-глутамина 75 мг/л L-пролина и 5 мг/л L-аспарагина и 0,5 мг/л 2,4-Д [Sparks Jones 2009]. Экпланты незрелых зародышей пшеницы культивировали при 25ºС и фотопериоде 16/8 часов. Пассирование культур осуществляли каждые 2 недели. Проростки на каллусах удаляли по мере их возникновения. После месяца культивирования каллусы переносились на среду с высоким осмотическим давлением (концентрация сахарозы 90 г/л) на 2 дня для повышения выживаемости трансформируемой ткани. После чего была проведена биобаллистическая трансформация каллусов пшеницы с использованием генетического материала бактерии A. rhizogenes штамма A4 (ампликон с четырьмя rol-генами или вектор pAL-TA с клонированным в нем четырьмя rol-генами). Тотальную ДНК бактерий выделяли с помощью набора ДНК-Сорб (ИнтерЛабСервис Россия). Фрагмент ДНК агробактерии размером 5401 п.н. содержащий гены rolA rolB rolC и rolD (со всеми необходимыми регуляторными участками) был амплифицирован из тотальной ДНК A. rhizogenes при помощи LR Plus полимеразы (Силекс Россия). Для добавления в ампликон последовательностей правой и левой границ Т-ДНК A. rhizogenes участвующих в интеграции в растительный геном проводили реамплификацию при помощи модифицированных прямого и обратного праймеров [Yasybaeva et al. 2017]. Полученный ампликон использовали для биобаллистической трансформации или клонировали в векторе pAL-TA для возможности наработки (клонирования) целевого участка Т-ДНК в необходимом количестве. Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием “генной пушки” Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad США) где в качестве микроносителя были использованы микрочастицы золота Bio-Rad средний размер которых составлял 1 мкм. Преципитацию ДНК на микроносители проводили кальций-спермидиновым способом [Finer et al. 1992]. Для повышения выживаемости трансформируемой ткани каллусы культивировали на среде МС с повышенным осмотическим давлением (с содержанием сахарозы 90 г/л в течение 48 часов до трансформации). Параметры биобаллистической трансформации: дистанция до мишени - 6 см давление гелия - 900 PSI давление вакуума - 0,9 bar количество ДНК- пробы на выстрел - 10 мкл (1 мкг/мкл) количество выстрелов на чашку - 1. После выстрела каллусы помещали на агаризованную безгормональную среду МС pH 5,7-5,8. Чашки выдерживались при 25оС и 16-часовом фотопериоде. Отбор предполагаемых косматых корней пшеницы образующихся на каллусной ткани осуществляли визуально по характерным фенотипическим особенностям (разветвленность опушенность способность к росту на безгормональной среде после отделения от каллуса). Тотальную ДНК из предполагаемых косматых корней выделяли с помощью СТАВ-метода. Для идентификации присутствия rol-генов проводили ПЦР-анализ на наличие фрагмента гена rolB с использованием прямого 5'-CGAGAGCCGCAGGGTGAG-3' и обратного 5'-AGGCGTGCTTGATTTGGAGG-3' праймеров. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением этидиум бромида. Размеры амплифицированных фрагментов определяли используя в качестве маркера GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder (Fermentas). Результаты исследования и их обсуждение Семенной материал мягкой пшеницы (рис. 1а) был собран из средней части колосков и простерилизован согласно стандартной методике. Незрелые зародыши (рис. 1б) изолировали из семян на 14-й день после опыления. Подходящие по размеру (2-3 мм) и стадии развития зародыши отбирали визуально и выкладывали на среду МС с добавлением 375 мг/л L-глутамина 75 мг/л L-пролина и 5 мг/л L-аспарагина и 0,5 мг/л 2,4-Д для индукции каллуса. Всего было выделено около 500 незрелых зародышей.    Рис. 1. Cеменной материал мягкой пшеницы (a); незрелые зародыши на 14 день после опыления (б); недельные каллусы пшеницы (в); побегообразование на каллусах (г); предполагаемые косматые корни пшеницы на безгормональной среде после биобаллистической трансформации (д-ж). Fig. 1. Wheat seed material (a); immature embryos on 14 day after pollination (b); weekly wheat calli (c); shooting on calli (d); putative wheat hairy roots on hormone-free medium after biolistic transformation (e-g). Спустя неделю культивирования наблюдали активное каллусообразование (рис. 1в) и начальные стадии прямого органогенеза практически на всех образцах. Каллусная ткань имела светло-зеленый цвет и структуру средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами. Проростки достигшие 1 см в длину удалялись в стерильных условиях по мере их возникновения (рис. 1г). После месяца культивирования каллусы с наиболее хорошими показателями роста переносились на среду с высоким осмотическим давлением (концентрация сахарозы 90 г/л) на 2 дня. В каждую чашку помещали по 30 каллусов. После чего была проведена биобаллистическая трансформация каллусов пшеницы векторной конструкцией pAL-TA/rolA,B,C,D схема создания которой представлена на рис. 2 и рис. 4. Из тотальной ДНК A. rhizogenes был амплифицирован участок ДНК размером 5401 пн который был обозначен как ампликон А (рис. 2).   Рис. 2. Схема создания целевого ампликона содержащего все четыре rol-гена с Т-бордерами. Fig. 2. Scheme create target amplicon containing all four rol-genes with T-broders. Электрофоретический анализ показал что размер ампликона А совпадает с теоретически ожидаемым. Секвенирование фланкирующих участков ампликона А показало что этот участок действительно соответствует Т-ДНК A. rhizogenes. Затем при помощи специальных праймеров была проведена реамплификация и таким образом получен ампликон Б содержащий все 4 rol-гена и фланкированный с двух сторон Т-границами (рис. 2). Размер ампликона Б также совпал с теоретически ожидаемым и действительно оказался немного больше ампликона А (рис. 3).   Рис. 3. Электрофоретический анализ целевых ПЦР-продуктов: 1- ампликон А размером 5401 п.н.; 2- маркер молекулярной длины; 3- ампликон Б размером 5461 п.н. Fig. 3. Electrophoretic analysis of generated PCR products: 1- amplicon A (5401 bp); 3 - amplicon B (5461 bp). Далее было проведено секвенирование ампликона Б и было показано что его фланкирующие участки размером по 500 пн с каждой стороны не содержат нуклеотидных замен. Полученный ампликон клонировали в векторе pAL-TA согласно схеме приведенной на рисунке 4 для возможности наработки целевого участка Т-ДНК в необходимом количестве.   Рис. 4. Схема клонирования ампликона Б содержащего все четыре rol-гена в векторе pAL-TA. Fig. 4. Scheme of cloning of the amplicon B containing all four rol-genes in the pAL-TA vector.   Биобаллистическая трансформация каллусов мягкой пшеницы проводилась с использованием “генной пушки” Biolistic PDS-1000/He. Параметры эксперимента были описаны в разделе «Материалы и методы». Перед каждым выстрелом каллусы плотно размещали на центральной части чашки Петри с целью увеличения вероятности попадания золотых частиц с ДНК. Всего для трансформации было отобрано около 300 каллусов 60 (2 чашки) из которых являлись контрольными образцами. Эти образцы подвергались такой же бомбардировке но без добавления ДНК. После проведения всех процедур биобаллистической трансформации каллусы оставляли на той же среде МС с высоким осмотическим давлением (трехкратное содержание сахарозы) для обеспечения выживаемости трансформируемой ткани. Через 2 дня после бомбардировки каллусы перенесли на безгормональную среду МС и культивировали при 25°С и 16-часовом фотопериоде. После 10-15 дней культивирования на бомбардированных каллусах пшеницы наблюдали начало ризогенеза. Полученные корни можно было разделить на три морфотипа: морфотип 1 - короткие неветвящиеся адвентивные корни на каллусах которые появились на наибольшем количестве образцов в том числе и на контрольных чашках Петри без добавления ДНК (рис. 5а б); морфотип 2 - длинные ветвящиеся адвентивные корни которые отсутствовали на контрольных образцах (рис. 5в); морфотип 3 - корни с многочисленными очагами каллусообразования (рис. 5г).   Рис. 5. Корни морфотипа 1 на контрольных каллусах после биобаллистической трансформации без добавления ДНК (а); корни морфотипа 1 образованные после бомбардировки с добавлением ДНК (б); корни морфотипа 2 (в); корни морфотипа 3 (г). Fig. 5. Morphotype 1 roots on control wheat calli after biolistic transformation without addition of DNA (a); morphotype 1 roots obtained after biolistics with DNA (b); morphotype 2 roots (c); morphotype 3 roots (d). Количество корней морфотипа 1 значительно превышало количество корней других морфотипов. Наибольший интерес вызывали корни морфотипа 2 так как по внешним признакам они напоминали истинные косматые корни. С целью проверить данное предположение мы отделили адвентивные корни морфотипа 1 из контрольного и опытного образцов а также корни морфотипа 2 из каллусной ткани и перенесли на безгормональную среду МС для оценки их способности к росту в изолированных культурах. Уже спустя одну неделю культивирования наблюдали умеренный рост корней морфотипа 2 а корни первого морфотипа признаков роста не проявляли. В течение месяца культивирования корни морфотипа 2 продолжали расти а корни первого морфотипа (как из контрольного так и из опытного образцов) погибали в результате развития некротических процессов. Интересно отметить что при длительном культивировании на некоторых линиях корней морфотипа 2 наблюдали позеленение (рис. 6) что может быть связано с накоплением фотосинтезирующих хлоропластов в корневых клетках.   Рис. 6. Зеленые адвентивные корни пшеницы полученные в результате опытов по биобаллистической трансформации.  Fig. 6. Wheat green adventitious roots obtained after biolistic transformation. Среди корней морфотипа 2 были отобраны 10 наиболее активно растущих предполагаемых косматых корней и перенесены в жидкую безгормональную среду. Корневые инокуляты (около 50 мг) культивировали на орбитальном шейкере при 80 об/мин в колбах емкостью 100 мл с 2 мл жидкой среды МС на свету в течение месяца. Подсушенные на фильтровальной бумаге корневые культуры взвешивали перед началом эксперимента и в конце. В качестве отрицательного контроля послужили корни морфотипа 1 а в качестве положительного - истинные косматые корни табака. Сырая масса корней морфотипа 1 в течение месяца не изменилась даже в некоторых случаях уменьшилась а корней морфотипа 2 увеличилась незначительно на 44,46%. В случае с зелеными адвентивными корнями пшеницы морфотипа 2 наблюдали активное наращивание сырой массы - на 485,64% значение которой даже превышало скорость роста истинных hairy roots табака (360,49%). Таким образом спонтанно позеленевшие корни мягкой пшеницы были способны к активному росту на безгормональной среде МС что возможно связано с активацией фотосинтетической системы. Существует несколько исследований в которых ранее были получены зеленые культуры hairy roots например у Ipomoea aquaticа [Taya et al 1994] Solanum khasianum Clarke [Jacob and Malpathak 2004] Daucus carota [Mukherjee et al 2014] и др. В основном эти зеленые косматые корни были получены за счет длительного культивирования на свету и воздействия цитокининами. В нашем же случае адвентивные корни пшеницы зеленели без дополнительной стимуляции светом или фитогормонами. В этих же условиях косматые корни табака никогда не приобретали зеленую окраску. Следует отметить что эти культуры адвентивных корней пшеницы продолжали свой рост и не имели склонности к коричневению в течение длительного культивирования (2 года). Однако ПЦР-анализ со специфическими праймерами к гену rolB показал отсутствие последнего в тотальной ДНК адвентивных корней пшеницы всех трех морфотипов в том числе и у зеленых корней. В то же время ген rolB нами всегда обнаруживался в истинных hairy roots табака. Это означает что при биобаллистической трансформации каллусов пшеницы rol-генами они не встраивались в геном. Появление адвентивных корней пшеницы морфотипа 2 может быть связано как с транзиентной экспрессией агробактериальных онкогенов так и опосредованным влиянием механического стресса вызванного бомбардировкой золотыми частицами. Существует несколько гипотез по поводу спонтанного позеленения культур корней так например на экспериментах на арабидопсисе показано что корни способны развивать хлоропласты при отделении их от побега за счет превращения зародышевых пропластид в хлоропласты [Kobayashi et al. 2017]. Этими же авторами установлено что развитие хлоропластов подавляется ауксином а цитокинины наоборот способствуют развитию фотосинтезирующего аппарата в корнях. Спонтанное позеленение некоторых линий изолированно растущих адвентивных корней пшеницы видимо является особенностью этого вида растения (возможно и всего семейства злаков) так как на hairy roots табака нам не удалось индуцировать такое позеленение даже при использовании интенсивного света (до 7 клк) цитокининов и введения в состав среды дополнительного магния. Таким образом нами показано что на каллусах пшеницы путем механического воздействия при бомбардировке золотыми частицами с добавлением rol-генов могут быть индуцированы адвентивные корни способные к длительному росту на безгормональных питательных средах. При этом может спонтанно происходить позеленение этих адвентивных корней. Мы предполагаем что изолированно растущие культуры зеленых адвентивных корней однодольных могут стать альтернативой истинным hairy roots которые довольно трудно получить у представителей этого класса растений.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз