Создание трансгенных растений табака крылатого Nicotiana alata с конститутивной экспрессией гена ARGOS-LIKE и их морфологический анализ

Авторы:
Кулуев Б.Р. , Князев А.В. , Бережнева З.А. , Чемерис А.В.
Название:
Создание трансгенных растений табака крылатого Nicotiana alata с конститутивной экспрессией гена ARGOS-LIKE и их морфологический анализ
Страницы:
91-95
скачано
15 раз(а)


Табак крылатый Nicotiana alata является декоративным растением c красивыми, но не крупными цветками. Поэтому для увеличения декоративной привлекательности этого вида растения актуально увеличение размеров его цветков. С этой целью нами были проведены работы по агробактериальной трансформации листовых дисков N. alata генно-инженерной конструкцией, содержащей ген ARGOS-LIKE Arabidopsis thaliana и промотор вируса мозаики георгина. Нами были созданы две линии трансгенных растений табака крылатого. Одна из линий трансгенных растений отличалась увеличением длины листьев на 21% и высоты стебля на 10% по сравнению с диким типом. Другая линия трансгенных растений характеризовалась увеличением размеров цветков: диаметра цветка на 13% и длины цветка на 8%, по сравнению с диким типом. Таким образом, в ходе проведенной работы нами показана возможность создания трансгенных растений N. alata путем агробактериальной трансформации листовых дисков. Конструкция гена ARGOS-LIKE с промотором вируса мозаики георгина может быть рекомендована для модификации размеров цветка у табака крылатого.
Введение Табак крылатый Nicotiana alata Link and Otto относится к роду табак (Nicotiana) семейству пасленовых (Solanaceae) и культивируется по всему миру как декоративное растение. N. alata по сравнению с Nicotiana tabacum имеет более крупные и красивые цветки (рис. 1), которые полностью раскрываются только вечером, причем растение цветет всю ночь. В природе табак крылатый встречается в Южной и Центральной Америке. Растение многолетнее травянистое, выращиваемое в умеренном климате как однолетнее, так как морозоустойчивость у N. alata очень низкая. Стебли прямостоячие, ветвистые, 60-70 см высотой. Листья небольшие, ланцетовидные или удлиненные. Все растение клейкое, покрыто железистыми волосками. Цветки белые, фиолетовые, пурпурные, трубчатые, около 7,5 см длиной, отгиб до 5 см в диаметре, собраны в крупное, рыхлое, метельчатое соцветие (рис. 1). В культуре с 1867 года [http://flower.onego.ru/annual/nicoti_d.html] Рис. 1. Внешний вид табака крылатого.  Фото с опытного участка Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Так как табак крылатый является декоративным растением, представляет большой интерес модификация размеров цветка этого растения. Одним из способов увеличения размеров цветка является трансформация растений генно-инженерными конструкциями, содержащими гены семейства ARGOS [Кулуев и др., 2011а]. Эта группа генов кодирует белки, являющиеся негативными регуляторами этиленового сигналинга и располагающиеся на эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи [Rai et al., 2015; Shi et al., 2016]. У резуховидки Таля Arabidopsis thaliana обнаружено и изучено четыре гена, кодирующие белки данной группы, а именно ARGOS, ARGOS-LIKE (ARL), OSR1 и OSR2 [Hu et al., 2003; 2006; Feng et al., 2011; Qin et al., 2014]. Первые исследования этой группы генов выявили вовлеченность кодируемых ими белков в регуляцию размеров органов растений. Сверхэкспрессия гомологов гена ARGOS способствовала существенному увеличению размеров органов трансгенных растений, как в гомологичных, так и в гетерологичных условиях [Hu et al., 2003; 2006; Кулуев и др., 2011б; 2013; 2014; 2016; Михайлова, Кулуев, 2015]. По всей видимости, кодируемые этими генами белки вовлечены в регуляцию роста растений как через влияние на клеточное деление, так и на клеточное растяжение. Нами ранее были созданы трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией генов ARGOS и ARL A. thaliana [Кулуев и др., 2011б; 2013]. Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров стебля, листьев и цветков. Исходя из этих данных, можно предполагать, что конститутивная экспрессия генов семейства ARGOS может способствовать увеличению размеров органов и у других видов рода Nicotiana. Целью данной работы было создание трансгенных растений N. alata с конститутивной экспрессией гена ARL и их морфологический анализ.  Материалы и методы Для трансформации N. alata использовали бактерии Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 содержащие генно-инженерную конструкцию гена ARL под контролем промотора вируса мозаики георгина в бинарном векторе pCambia 1301 [Кулуев и др., 2012; Михайлова, Кулуев, 2015]. Трансгенные растения N. alata получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков, высеченных из листьев трехмесячных растений [Horsch et al., 1985]. Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,1 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК)), содержащей 25 мг/л гигромицина. Качественную оценку активности репортерного гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гистохимически, используя субстрат X-Gluc. Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л гигромицина, затем переносили в почвенную смесь, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство). Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии поверхностно стерилизовали последовательным погружением в 70% спирт, 5% раствор гипохлорита натрия, промывали в стерильной дистиллированной воде и проращивали на среде MС с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через три недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев и определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера. Результаты обрабатывали методом χ2 по стандартной методике и выделяли для дальнейшей работы линии с одной интегрированной копией трансгенов. Тотальную ДНК из растений выделяли методом солевой экстракции [Aljanabi, Martinez, 1997]. Интеграцию целевого гена в растительные геномы определяли с помощью ПЦР анализа при использовании праймеров ARLPCRF 5'-TCTACAAAACGACATCATAAACAT-3' и ARLPCRR 5'-ACATAAAAGTGGAAGAAGAAGAAA-3'. Тотальную РНК из листьев выделяли используя тризол, строили кДНК при помощи олиго-dT праймера и MMuLV-обратной транскриптазы. Далее проводили качественную ОТ-ПЦР гена ARL при помощи тех же праймеров, использованных для ПЦР-анализа. Растения трансгенных линий и контрольные растения (дикий тип) культивировали вначале в вегетационных сосудах объемом 450 мл (рис. 3а), заполненных универсальным грунтом (“Terra vita”, Россия) в лабораторных условиях при температуре 28°С с освещенностью около 140 мкмоль на кв. м в сек и фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота). Через полтора месяца молодые растения N. alata переносили из вегетационных сосудов на грунт в теплицу, где выращивали анализируемые растения до стадии плодоношения. В качестве контрольных использовали нетрансгенные растения N. alata, которые обозначали как дикий тип. Морфологический анализ растений проводили в период массового цветения растений который заключался в измерении высоты стебля, длины и ширины листьев, длины и диаметра цветка. По каждой линии трансгенных растений было отобрано по 10 растений (n=10), у которых измеряли по три крупных нижних листа в длину (первый, второй и третий листья, не считая листья розетки), начиная от начала листовой пластины, по центральной жилке до самого кончика. Также определяли ширину этих листьев в самой широкой части. Затем вычисляли средние значения длины и ширины листа для каждой линии. В каждом анализируемом растении определяли длину и диаметр пяти цветков. Длину цветка измеряли начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика (граница между сросшимися лепестками), и вычисляли среднее значение. Диаметр цветка определяли путем измерения расстояния от острого конца одного лепестка до острого конца второго лепестка, расположенного не по соседству, а через один лепесток. Результаты исследований представляли в виде гистограмм со средними значениями выборки. Барами обозначали стандартную ошибку среднего (рис. 2). Достоверность различий во всех экспериментах оценивали при помощи U-критерия Манна-Уитни.  Результаты и их обсуждение В результате агробактериальной трансформации листовых дисков N. alata было получено 14 регенерантов, из которых на селективной среде МС укоренились лишь 8 растений. После гистохимического GUS-анализа и ПЦР-анализа для дальнейшей акклиматизации были отобраны 4 растения. Эти растения были доведены до стадии плодоношения и у них были получены семена. Анализ устойчивости сеянцев к гигромицину показал характерное расщепление 3:1 только у двух линий трансгенных растений N. alata, которые и были отобраны для дальнейшей работы по морфологическому анализу (линии 1 и 6). ОТ-ПЦР-анализ показал, что в обеих линиях содержится мРНК гена ARL, что свидетельствует о наличии экспрессии трансгена. Морфологический анализ проведенный в период цветения показал, что по высоте стебля трансгенные растения N. alata линии 1 были больше растений дикого типа в среднем на 10% (рис. 2а). В то же время по данному параметру роста трансгенные растения линии 6 не отличались от контроля. Длина листьев также была наибольшей у линии 1, причем разница с диким типом составила в среднем 21% (рис. 2б; 3б). По ширине листьев между растениями дикого типа и трансгенными линиями достоверных различий не обнаруживалось. Если по размерам стебля и листьев дикий тип превосходила только линия 1, то по размерам цветка ситуация была обратная. По длине цветка дикий тип и линия 1 не отличались друг от друга, а по диаметру цветка отличия были весьма незначительными (рис. 2в, г). В то же время диаметр цветка у трансгенных растений линии 6 был больше, чем у контроля в среднем на 13%, а длина цветка на 8% (рис. 2в, г; 3в, г). Рис. 2. Результаты морфометрического анализа трансгенных растений N. alata: а - высота стебля, см;  Рис. 3. Особенности фенотипа трансгенных растений N. alata, сверхэкспрессирующих ген ARL:  а - сравнение трансгенных и нетрансгенных растений в период предварительного проращивания в вегетационных сосудах до высадки на грунт;  б - сравнение листьев трансгенных и нетрансгенных растений в период цветения;  в - цветки анализируемых растений сбоку;  г - цветки анализируемых растений сверху. Итак, нами были созданы две линии трансгенных растений N. alata экспрессирующие ген ARL A. thaliana. Трансгенные растения линии 1 отличались от контрольных растений увеличением размеров вегетативных органов, а именно листьев и стебля. В то же время линия 6 характеризовалась увеличением размеров цветков. Ранее нами были созданы и проанализированы трансгенные растения N. tabacum с конститутивной экспрессией гена ARL A. thaliana [Кулуев и др., 2013]. Некоторые линии трансгенных растений N. tabacum характеризовались увеличением высоты стебля до 10-25% (в зависимости от линии), по сравнению с контролем. На трансгенных растениях N. alata были получены сходные данные, и одна из линий показала увеличение высоты стебля на 10%. Часть линий трансгенных растений N. tabacum с конститутивной экспрессией гена ARL характеризовалась также увеличением длины листьев, причем в некоторых случаях разница достигала 23%. На примере N. alata нам также удалось продемонстрировать схожий эффект, так у линии 1 длина листьев в среднем была больше на 21% по сравнению с диким типом. Интересно отметить, что цветки у трансгенных растений N. tabacum не отличались по размеру от растений табака дикого типа [Кулуев и др., 2013]. В то же время у трансгенных растений N. alata линии 6 размеры цветков были достоверно больше, чем у дикого типа. На примере N. tabacum мы ранее также демонстрировали возможность увеличения размеров цветков, однако для этих целей тогда был использован другой ген семейства ARGOS [Кулуев и др., 2011б]. Таким образом, в ходе проведенного исследования нами было показано, что для агробактериальной трансформации N. alata может быть применен стандартный метод, который используется при работе с N. tabacum. Ранее уже проводились работы по агробактериальной трансформации листовых дисков табака крылатого [Schroeder et al., 2001], однако авторы данной работы для регенерации растений в питательную среду добавляли только 6-БАП. Мы же для трансформации N. alata использовали среду МС с добавлением как 6-БАП, так и НУК, как и при трансформации N. tabacum [Кулуев и др., 2011б]. При этом частота трансформации и эффективность регенерации у N. alata были гораздо ниже, чем у N. tabacum. Именно поэтому нам удалось получить только две линии трансгенных растений табака крылатого. Schroeder et al. [2001] в ходе своей работы также получили всего лишь 5 линий трансгенных растений. Поэтому при работе с N. alata целесообразно увеличивать количество листовых эксплантов с целью увеличения числа генерируемых линий трансгенных растений. В результате проведенной нами работы было показано, что генно-инженерная конструкция гена ARL с промотором вируса мозаики георгина может быть использована для модификации размеров органов у N. alata. Трансгенные растения табака крылатого линии 6 могут быть рекомендованы как исходный материал при создании новых ГМ-сортов этого растения с крупными размерами цветков.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз