Создание трансгенных растений табака крылатого Nicotiana alata с конститутивной экспрессией гена ARGOS-LIKE и их морфологический анализ

Введение Табак крылатый Nicotiana alata Link and Otto относится к роду табак (Nicotiana) семейству пасленовых (Solanaceae) и культивируется по всему миру как декоративное растение. N. alata по сравнению с Nicotiana tabacum имеет более крупные и красивые цветки (рис. 1), которые полностью раскрываются только вечером, причем растение цветет всю ночь. В природе табак крылатый встречается в Южной и Центральной Америке. Растение многолетнее травянистое, выращиваемое в умеренном климате как однолетнее, так как морозоустойчивость у N. alata очень низкая. Стебли прямостоячие, ветвистые, 60-70 см высотой. Листья небольшие, ланцетовидные или удлиненные. Все растение клейкое, покрыто железистыми волосками. Цветки белые, фиолетовые, пурпурные, трубчатые, около 7,5 см длиной, отгиб до 5 см в диаметре, собраны в крупное, рыхлое, метельчатое соцветие (рис. 1). В культуре с 1867 года [http://flower.onego.ru/annual/nicoti_d.html] Рис. 1. Внешний вид табака крылатого.  Фото с опытного участка Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Так как табак крылатый является декоративным растением, представляет большой интерес модификация размеров цветка этого растения. Одним из способов увеличения размеров цветка является трансформация растений генно-инженерными конструкциями, содержащими гены семейства ARGOS [Кулуев и др., 2011а]. Эта группа генов кодирует белки, являющиеся негативными регуляторами этиленового сигналинга и располагающиеся на эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи [Rai et al., 2015; Shi et al., 2016]. У резуховидки Таля Arabidopsis thaliana обнаружено и изучено четыре гена, кодирующие белки данной группы, а именно ARGOS, ARGOS-LIKE (ARL), OSR1 и OSR2 [Hu et al., 2003; 2006; Feng et al., 2011; Qin et al., 2014]. Первые исследования этой группы генов выявили вовлеченность кодируемых ими белков в регуляцию размеров органов растений. Сверхэкспрессия гомологов гена ARGOS способствовала существенному увеличению размеров органов трансгенных растений, как в гомологичных, так и в гетерологичных условиях [Hu et al., 2003; 2006; Кулуев и др., 2011б; 2013; 2014; 2016; Михайлова, Кулуев, 2015]. По всей видимости, кодируемые этими генами белки вовлечены в регуляцию роста растений как через влияние на клеточное деление, так и на клеточное растяжение. Нами ранее были созданы трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией генов ARGOS и ARL A. thaliana [Кулуев и др., 2011б; 2013]. Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров стебля, листьев и цветков. Исходя из этих данных, можно предполагать, что конститутивная экспрессия генов семейства ARGOS может способствовать увеличению размеров органов и у других видов рода Nicotiana. Целью данной работы было создание трансгенных растений N. alata с конститутивной экспрессией гена ARL и их морфологический анализ.  Материалы и методы Для трансформации N. alata использовали бактерии Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 содержащие генно-инженерную конструкцию гена ARL под контролем промотора вируса мозаики георгина в бинарном векторе pCambia 1301 [Кулуев и др., 2012; Михайлова, Кулуев, 2015]. Трансгенные растения N. alata получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков, высеченных из листьев трехмесячных растений [Horsch et al., 1985]. Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,1 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК)), содержащей 25 мг/л гигромицина. Качественную оценку активности репортерного гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гистохимически, используя субстрат X-Gluc. Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л гигромицина, затем переносили в почвенную смесь, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство). Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии поверхностно стерилизовали последовательным погружением в 70% спирт, 5% раствор гипохлорита натрия, промывали в стерильной дистиллированной воде и проращивали на среде MС с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через три недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев и определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера. Результаты обрабатывали методом χ2 по стандартной методике и выделяли для дальнейшей работы линии с одной интегрированной копией трансгенов. Тотальную ДНК из растений выделяли методом солевой экстракции [Aljanabi, Martinez, 1997]. Интеграцию целевого гена в растительные геномы определяли с помощью ПЦР анализа при использовании праймеров ARLPCRF 5'-TCTACAAAACGACATCATAAACAT-3' и ARLPCRR 5'-ACATAAAAGTGGAAGAAGAAGAAA-3'. Тотальную РНК из листьев выделяли используя тризол, строили кДНК при помощи олиго-dT праймера и MMuLV-обратной транскриптазы. Далее проводили качественную ОТ-ПЦР гена ARL при помощи тех же праймеров, использованных для ПЦР-анализа. Растения трансгенных линий и контрольные растения (дикий тип) культивировали вначале в вегетационных сосудах объемом 450 мл (рис. 3а), заполненных универсальным грунтом (“Terra vita”, Россия) в лабораторных условиях при температуре 28°С с освещенностью около 140 мкмоль на кв. м в сек и фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота). Через полтора месяца молодые растения N. alata переносили из вегетационных сосудов на грунт в теплицу, где выращивали анализируемые растения до стадии плодоношения. В качестве контрольных использовали нетрансгенные растения N. alata, которые обозначали как дикий тип. Морфологический анализ растений проводили в период массового цветения растений который заключался в измерении высоты стебля, длины и ширины листьев, длины и диаметра цветка. По каждой линии трансгенных растений было отобрано по 10 растений (n=10), у которых измеряли по три крупных нижних листа в длину (первый, второй и третий листья, не считая листья розетки), начиная от начала листовой пластины, по центральной жилке до самого кончика. Также определяли ширину этих листьев в самой широкой части. Затем вычисляли средние значения длины и ширины листа для каждой линии. В каждом анализируемом растении определяли длину и диаметр пяти цветков. Длину цветка измеряли начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика (граница между сросшимися лепестками), и вычисляли среднее значение. Диаметр цветка определяли путем измерения расстояния от острого конца одного лепестка до острого конца второго лепестка, расположенного не по соседству, а через один лепесток. Результаты исследований представляли в виде гистограмм со средними значениями выборки. Барами обозначали стандартную ошибку среднего (рис. 2). Достоверность различий во всех экспериментах оценивали при помощи U-критерия Манна-Уитни.  Результаты и их обсуждение В результате агробактериальной трансформации листовых дисков N. alata было получено 14 регенерантов, из которых на селективной среде МС укоренились лишь 8 растений. После гистохимического GUS-анализа и ПЦР-анализа для дальнейшей акклиматизации были отобраны 4 растения. Эти растения были доведены до стадии плодоношения и у них были получены семена. Анализ устойчивости сеянцев к гигромицину показал характерное расщепление 3:1 только у двух линий трансгенных растений N. alata, которые и были отобраны для дальнейшей работы по морфологическому анализу (линии 1 и 6). ОТ-ПЦР-анализ показал, что в обеих линиях содержится мРНК гена ARL, что свидетельствует о наличии экспрессии трансгена. Морфологический анализ проведенный в период цветения показал, что по высоте стебля трансгенные растения N. alata линии 1 были больше растений дикого типа в среднем на 10% (рис. 2а). В то же время по данному параметру роста трансгенные растения линии 6 не отличались от контроля. Длина листьев также была наибольшей у линии 1, причем разница с диким типом составила в среднем 21% (рис. 2б; 3б). По ширине листьев между растениями дикого типа и трансгенными линиями достоверных различий не обнаруживалось. Если по размерам стебля и листьев дикий тип превосходила только линия 1, то по размерам цветка ситуация была обратная. По длине цветка дикий тип и линия 1 не отличались друг от друга, а по диаметру цветка отличия были весьма незначительными (рис. 2в, г). В то же время диаметр цветка у трансгенных растений линии 6 был больше, чем у контроля в среднем на 13%, а длина цветка на 8% (рис. 2в, г; 3в, г). Рис. 2. Результаты морфометрического анализа трансгенных растений N. alata: а - высота стебля, см;  Рис. 3. Особенности фенотипа трансгенных растений N. alata, сверхэкспрессирующих ген ARL:  а - сравнение трансгенных и нетрансгенных растений в период предварительного проращивания в вегетационных сосудах до высадки на грунт;  б - сравнение листьев трансгенных и нетрансгенных растений в период цветения;  в - цветки анализируемых растений сбоку;  г - цветки анализируемых растений сверху. Итак, нами были созданы две линии трансгенных растений N. alata экспрессирующие ген ARL A. thaliana. Трансгенные растения линии 1 отличались от контрольных растений увеличением размеров вегетативных органов, а именно листьев и стебля. В то же время линия 6 характеризовалась увеличением размеров цветков. Ранее нами были созданы и проанализированы трансгенные растения N. tabacum с конститутивной экспрессией гена ARL A. thaliana [Кулуев и др., 2013]. Некоторые линии трансгенных растений N. tabacum характеризовались увеличением высоты стебля до 10-25% (в зависимости от линии), по сравнению с контролем. На трансгенных растениях N. alata были получены сходные данные, и одна из линий показала увеличение высоты стебля на 10%. Часть линий трансгенных растений N. tabacum с конститутивной экспрессией гена ARL характеризовалась также увеличением длины листьев, причем в некоторых случаях разница достигала 23%. На примере N. alata нам также удалось продемонстрировать схожий эффект, так у линии 1 длина листьев в среднем была больше на 21% по сравнению с диким типом. Интересно отметить, что цветки у трансгенных растений N. tabacum не отличались по размеру от растений табака дикого типа [Кулуев и др., 2013]. В то же время у трансгенных растений N. alata линии 6 размеры цветков были достоверно больше, чем у дикого типа. На примере N. tabacum мы ранее также демонстрировали возможность увеличения размеров цветков, однако для этих целей тогда был использован другой ген семейства ARGOS [Кулуев и др., 2011б]. Таким образом, в ходе проведенного исследования нами было показано, что для агробактериальной трансформации N. alata может быть применен стандартный метод, который используется при работе с N. tabacum. Ранее уже проводились работы по агробактериальной трансформации листовых дисков табака крылатого [Schroeder et al., 2001], однако авторы данной работы для регенерации растений в питательную среду добавляли только 6-БАП. Мы же для трансформации N. alata использовали среду МС с добавлением как 6-БАП, так и НУК, как и при трансформации N. tabacum [Кулуев и др., 2011б]. При этом частота трансформации и эффективность регенерации у N. alata были гораздо ниже, чем у N. tabacum. Именно поэтому нам удалось получить только две линии трансгенных растений табака крылатого. Schroeder et al. [2001] в ходе своей работы также получили всего лишь 5 линий трансгенных растений. Поэтому при работе с N. alata целесообразно увеличивать количество листовых эксплантов с целью увеличения числа генерируемых линий трансгенных растений. В результате проведенной нами работы было показано, что генно-инженерная конструкция гена ARL с промотором вируса мозаики георгина может быть использована для модификации размеров органов у N. alata. Трансгенные растения табака крылатого линии 6 могут быть рекомендованы как исходный материал при создании новых ГМ-сортов этого растения с крупными размерами цветков.

1. Кулуев Б.Р. Генетическая регуляция величины органов у растений // Биомика. 2011а. Т. 2. №1. С. 33-46.
2. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Ильясова А.А., Чемерис А.В. Конститутивная экспрессия гена ARGOS в растениях табака под контролем промотора вируса мозаики георгина // Физиология растений. 2011б. Т. 58. №3. С. 443-452.
3. Кулуев Б.Р. Каулимовирусы и их полногеномные промоторы // Биомика. 2012. Т. 4. №1. С. 1-19.
4. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Сафиуллина М.Г., Чемерис А.В. Влияние конститутивной экспрессии гена ARGOS-LIKE на размеры клеток и органов трансгенных растений табака // Генетика. 2013. Т.49. №5. С. 587-594.
5. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В. Эстрадиол-индуцибельная и цветокспецифичная экспрессия генов ARGOS и ARGOS-LIKE в трансгенных растениях табака // Генетика. 2014. Т. 50. №8. С. 918-929.
6. Кулуев Б.Р., Михайлова Е.В., Таипова Р.М., Чемерис А.В. Изменение фенотипа трансгенных растений амаранта Amaranthus retroflexus L. с конститутивной экспрессией гена ARGOS-LIKE // Генетика. 2016. Т. 52. №12. С. 1388-1397.
7. Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Создание трансгенного рапса (Brassica napus L) с конститутивной экспрессией гена ARGOS-LIKE Arabidopsis thaliana методом погружения цветков // Биотехнология. 2015. №5. С. 49-58.
8. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4692-4693.
9. Feng G., Qin Z., Yan J., Zhang X., Hu Y.: Arabidopsis ORGAN SIZE RELATED1 regulates organ growth and final organ size in orchestration with ARGOS and ARL // New Phytologist. 2011. V. 191. P. 635-646.
10. Horsch R., Fry J., Hoffmann N., Eichholtz D., Rogers S., Fraley R. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. V. 227. P. 1229-1231.
11. Hu Y., Xie Q., Chua N. The Arabidopsis auxin-inducible gene ARGOS controls lateral organ size // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1951-1961.
12. Hu Y., Poh H., Chua N. The Arabidopsis ARGOS-LIKE gene regulates cell expansion during organ growth // The Plant Journal. 2006. V. 47. P. 1-9.
13. Qin, Z., Zhang, X., Zhang, X., Feng, G., Hu, Y. The Arabidopsis ORGAN SIZE RELATED 2 is involved in regulation of cell expansion during organ growth // BMC Plant Biol. 2014. V. 14. 349.
14. Rai M.I., Wang X., Thibault D.M., Kim H.J., Bombyk M.M., Binder B.M., Shakeel S.N., Schaller G.E.. The ARGOS gene family functions in a negative feedback loop to desensitize plants to ethylene // BMC Plant Biol. 2015. V. 15. 157.
15. Schroeder K.R., Stimart, D.P., Nordheim, E.V. Response of Nicotiana alata to insertion of an autoregulated senescence-inhibition gene // J Amer Hort Sci. 2001. V. 125. P. 523-530.
16. Shi J., Drummond B.J., Wang H., Archibald R.L., Habben J.E. Maize and Arabidopsis ARGOS proteins interact with ethylene receptor signaling complex, supporting a regulatory role for ARGOS in ethylene signal transduction // Plant Physiol. 2016. V. 171. P. 2783-2797.