Методология выявления экспансии простых повторов у больных миотонической дистрофией

Авторы:
Чемерис Д.А. , Мурзабаев М.Р.
Название:
Методология выявления экспансии простых повторов у больных миотонической дистрофией
Страницы:
24-32
скачано
37 раз(а)


Миотоническая дистрофия бывает двух типов (МД1 и МД2) и вызывается нарушением двух генов DMPK и ZNF9, в которых наблюдается экспансия GC-богатых простых повторов. В 3'-нетранслируемой области гена протеинкиназы мышечной дистрофии обнаруживаются множественные CTG/CAG-повторы, а в первом интроне гена, кодирующего ДНК-связывающий белок (ZNF9) имеются множественные CCTG/CAGG-повторы. Из-за возникающих в этих местах сложных вторичных структур затруднена диагностика числа данных повторов и необходимо использовать весьма трудоемкую и длительную процедуру блот-гибридизации по Саузерну. Однако для проведения более быстрой и дешевой диагностики с помощью ПЦР предлагаются различные вариации этого метода, способствующие установлению у пациентов заболевания на генетическом уровне или риска его развития с возрастом.
Около 30 наследственных заболеваний человека обусловлены так называемыми динамическими мутациями в виде увеличивающегося числа копий простых повторов в геномной ДНК типа CTG/CAG, CCTG/CAGG, CGG/CCG и др. [Mirkin, 2007]. Среди болезней подобного рода есть такое серьезное нарушение здоровья как миотоническая дистрофия, являющаяся одним из самых распространенных наследственных нервно-мышечных заболеваний человека с частотой встречаемости более чем 1:8000. Это аутосомно-доминатное, мультистемное расстройство, в основном характеризуемое миотонией и прогрессирующей мышечной слабостью [Mankodi, 2008]. Для миотонической дистрофии известно два генетических типа, получивших обозначение МД1 и МД2 и имеющих в целом сходные проявления, но несколько отличающиеся тяжестью заболевания. Предполагается, что патогенные механизмы и для МД1 и МД2 опосредованы ненормальным функционированием мутантных мРНК, содержащих увеличенное число повторов CUG и CCUG соответственно [Ashizawa, Sarkar, 2011]. Первоначально у пациентов страдающих этим заболеванием было обнаружено увеличение количества тринуклеотидных CTG/CAG-повторов около 3' нетранслируемой области гена DMPK (dystrophia myotonica - protein kinase) - протеинкиназа мышечной дистрофии [Brook et al., 1992; Fu et al., 1992; Mahadevan et al., 1992]. Функция этого белка точно не выяснена, считается, что он необходим для нормального функционирования мышечных и нервных клеток. Вероятно он принимает участие в некоторых важных процессах, происходящих внутри клеток [Kaliman, Llagostera, 2008]. Например, показано ингибирование протеинкиназой мышечной дистрофии специфической субъединицы мышечного белка - миозинфосфатазы, участвующей в процессах мышечного сокращения и расслабления. Обнаружена корреляция между тяжестью заболевания и числом тринуклеотидных повторов. Чем больше повторов, тем раньше наступает манифестация и болезнь протекает тяжелее. Пациенты с классическими признаками заболевания, проявляющимися во взрослом состоянии, такими как, например, мышечная слабость, имеют от 100 до 1000 CTG/CAG-повторов. У больных, родившихся с более тяжелой врожденной формой заболевания, отмечается повышенное количество CTG/CAG-повторов, часто более 2000. Люди с количеством повторов от 35 до 49 не проявляют признаков болезни, в то время как их дети находятся в группе риска - в случае увеличения числа повторов до критической отметки у них могут проявиться признаки заболевания [Hunter et al., 1992]. В другой работе отмечается корреляция между количеством повторов и возрастом, при котором проявляются первые симптомы заболевания, показано, что зависимость начинает наблюдаться при наличии как минимум 250 CTG/CAG-повторов [Savic et al., 2002]. Ген DMPK расположен на 19 хромосоме в регионе 19q13.3 и имеет протяженность около 13 т.п.н., в которой содержатся 15 экзонов, кодирующих белок, состоящий из 624 аминокислоты [Shaw et al., 1993]. На рис. 1 приведен фрагмент дистальной части данного гена с областью CTG-повторов. CCCATGCCGGGTGTTGACCTCGCCCTCTCCCCGCAGGTCCCTAGGCCTGGCCTATCGGAG V P R P G L S E GCGCTTTCCCTGCTCCTGTTCGCCGTTGTTCTGTCTCGTGCCGCCGCCCTGGGCTGCATT A L S L L L F A V V L S R A A A L G C I GGGTTGGTGGCCCACGCCGGCCAACTCACCGCAGTCTGGCGCCGCCCAGGAGCCGCCCGC G L V A H A G Q L T A V W R R P G A A R GCTCCCTGAACCCTAGAACTGCTGTCTTCGACTCCGGGGCCCCGTTGGAAGACTGAGTGC A P Ter CCGGGGCACGGCACAGAAGCCGCGCCCACCGCCTGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTG GGTCTCCGCCCAGCTCCAGTCCTGTGATCCGGGCCCGCCCCCTAGCGGCCGGGGAGGGAG GGGCCGGGTCCGCGGCCGGCGAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCCGGGAATGCTGCT GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG… ... …CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGGGATCACA GACCATTTCTTTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCTGACGTGGATGGGCAAACTGCAGGCC Рис. 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена протеинкиназы DMPK, включающая часть 14 интрона (показан курсивом), 15 экзон с выведенной аминокислотной последовательностью для него и часть 3’-нетранслируемой области. Вариабельная по размеру область CTG повторов выделена подчеркиванием. Позднее был обнаружен и другой ген, вызывающий миотоническую дистрофию, получивший сокращенное наименование как МД2 [Ranum et al., 1998]. Этот ген, расположенный на 3 хромосоме в регионе 3q21.3, кодирует ДНК-связывающий белок (ZNF9), характеризующийся наличием в первом интроне множественных CCTG/CAGG-повторов [Liquori et al., 2001]. Особенностью этого повторяющегося участка является присутствие в одном блоке сразу трех типов простых повторов (TG)n(TCTG)n(CCTG)n. Причем экспансия характерна только для третьего типа повторов. На рис. 2 приведена последовательность первого интрона гена ZNF9, где видны разные типы повторов. Признаки заболевания для МД2 проявляются при увеличении количества повторов с 50 до 5000. Установлено, что образующаяся в этом случае измененная версия мРНК, взаимодействует с определенными белками, формируя внутри клетки агрегаты, которые в свою очередь препятствуют производству других белков. Эти нарушения не позволяют клеткам в мышцах и других тканях правильно функционировать, вызывая у пациента симптомы заболевания [Fardaei et al., 2002]. 1 ggccttataaccatgcaaatgtgtccattaagttggacttggaatgagtgaatgagtatt 61 actgccagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtctgtctgtctgtctgtctg 121 tctgtctgtctgtctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 181 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 241 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 301 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 361 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 421 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 481 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctg 541 cctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgcctgtctgtctcactttgtcccctagg Рис. 2. Фрагмент гена ZNF9 с интроном 1 человека и участком простых повторов (GenBank: AF388526.1). В положении 69..100 расположены tg-повторы, от 101 до 136 нуклеотида содержатся tctg-повторы и ответственные за манифестацию МД2 cctg-повторы находятся в участке от 137 до 576 нуклеотида Установлено, что участки ДНК с такими простыми GC-богатыми повторами имеют структурную организацию, препятствующую нормальному протеканию процессов репликации, репарации и рекомбинации. Проведенный анализ методом электронной микроскопии показал наличие изгибов и петель, локализованных в местах, содержащих множественные повторы [Pearson et al., 1997]. В другой работе детально исследовано формирование стабильных петель и шпилек в участках с повторами тринуклеотидов, связанных с различными наследственными заболеваниями, в том числе и с миотонической дистрофией [Mitas, 1997]. Недавно показано, что генетическая нестабильность CCTG-повторов связана с образованием метастабильных шпилек и колокол-подобных структур [Lam et al., 2011]. Причем ранее было показано, что CCTG/CAGG-повторы более склонны к экспансии, чем CTG/CAG-повторы при воспроизводстве таких рекомбинантных молекул в клетках E.coli [Dere, Wells, 2006], что, впрочем, наблюдается и у человека, если сравнить экспансию тех и других повторов в соответствующих генах. Считается, что основным механизмом увеличения числа повторов в ДНК служит так называемое проскальзывание цепей при репликации in vivo [Samadashwilly et al., 1997; Mirkin, 2007]. Пожалуй, стоит упомянуть работу, в которой авторами в модельном эксперименте с синтетическими матрицами с более чем 2000 копий CTG повторов с помощью высоко процессивной ДНК полимеразы фага phi 29 удалось нарабатывать значительные количества амплифицированной ДНК [Osborne, Thornton, 2008]. Здесь видимо главную роль играет то, что данная полимераза обладает сильной цепь-смещающей активностью. При этом в качестве диагностической процедуры данный подход служить не может ввиду огромной гетерогенности получаемых продуктов в такой изотермической реакции амплификации по типу катящегося кольца и невозможности их достоверного анализа. При диагностике других заболеваний, связанных с множественной экспансией простых повторов исследователи не сталкиваются с проблемами, характерными для выявления CTG- или CCTG-повторов при миотонической дистрофии, ввиду того, что длины участков с повторами, например при болезни Хантингтона, не так велики [Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993], и они легко амплифицируются при обычной ПЦР, не требуя введения дополнительных и трудоемких стадий в процесс анализа. Как уже отмечалось выше тяжесть заболевания, вызванная нарушения в обоих генах зависит от числа таких повторов и поэтому для диагностики заболевания и, в особенности, для предсказания времени начала проявления симптомов, а также степени их тяжести необходимо достаточно точно знать количество CTG- или CCTG-повторов, однако это представляет собой серьезную проблему ввиду того, что в участках с такими повторами могут возникать различные вторичные структуры, в том числе изображенные на рис.3, и при обычной ПЦР ДНК-полимераза зачастую оказывается неспособна провести построение новой цепи ДНК большой протяженности. Рис. 3. Образование вторичных структур типа выпетливаний на этапе отжига при проведении ПЦР для амплификации фрагмента гена DMPK, содержащего участок с CTG/CAG-повторами Самым простым вариантом определения числа CTG или CCTG повторов является амплификация с помощью ПЦР данных фрагментов соответствующих генов путем подбора праймеров к фланкирующим эти повторы участкам с последующим разделением ампликонов по размеру гель-электрофорезом. Однако из-за возникающих вторичных структур с помощью ПЦР удается амплифицировать лишь небольшое число повторов, что не всегда достаточно для точной диагностики. Здесь надо заметить, что в литературе встречаются противоречивые сведения, поскольку в большинстве работ подчеркивается, что при проведении обычной ПЦР невозможно амплифицировать участок, содержащий более 100 копий CTG-повторов, тогда как в некоторых работах авторы сообщают, что им удалось с помощью обычной ПЦР амплифицировать куда более протяженные фрагменты с сотнями и даже тысячами CTG-повторов в них, хотя следует признать, что для этого после электрофоретического разделения им пришлось выявлять гибридизационные сигналы, свидетельствующие о наличие в определенных местах геля комплементарных гибридизационным зондам последовательностей с помощью блот-гибридизации по Саузерну. При этом известны способы амплификации GC-богатых протяженных участков [Frey et al., 2008], где в реакционную смесь добавляются ингредиенты, снижающие температуру плавления двуцепочечной ДНК или при построении новых цепей вместо дГТФ используется его аналог 7-деаза-2’-дезоксигуанозин, за счет отсутствия азота в 7-ом положении ослабляющий двойную спираль ДНК. Так, был разработан способ амплификации с помощью ПЦР фрагмента гена DMPK, содержащего около 800 CTG-повторов путем частичного замещения дГТФ на 7-деаза дГТФ [Cheng et al., 1996], однако в этой же работе аллели, содержащие около 2700 таких повторов удалось выявить только с помощью блот-гибридизации по Саузерну. В работе других авторов для выявления экспансии CTG-повторов также использовалось сочетание ПЦР с 7-деаза дГТФ и последующей блот-гибридизацией по Саузерну [Hsiao et al., 1999]. Стоит отметить, что использование в ПЦР 7-деаза дГТФ было успешно применено и для определения количества CGG-повторов, экспансия которых в первом экзоне гена FMR1 приводит к заболеванию, известному как синдром хрупкой хромосомы Х [Houdayer et al., 1999]. Считается, что ввиду некоторой мозаичности клеток и тканей у больных с экспансией простых повторов их количества у одного индивида могут сильно отличаться, что хорошо видно на радиоавтографах гелей после блот-гибридизации по Саузерну, где вместо отдельных полос наблюдается целый шлейф гибридизационных сигналов, которые фактически отличаются друг от друга по размеру на длину самих триплетных или тетраплетных повторов. Желая детектировать варианты анализируемых генов только с мажорными количествами повторов прибегли к ПЦР, где стартовое количество амплифицируемого материала было сильно занижено, вплоть до единичных копий генома [Monckton et al., 1995]. Этим авторам удалось детектировать мажорные варианты размером в несколько сотен повторов путем последующего выявления фрагментов в геле с помощью блот-гибридизации. Еще в целом ряде работ отмечается улучшенная детекция с помощью ПЦР фрагментов ДНК большей длины (с увеличенными количествами повторов) как для МД1 так и для МД2, если стартовые количества ДНК были сильно снижены [Wong et al., 1995; Gennarelli et al., 1998; Bonifazi et al., 2004; Bachinski et al., 2009]. Определенного увеличения чувствительности ДНК-диагностики миотонической дистрофии с помощью ПЦР удалось добиться при использовании флуоресцентно-меченных праймеров [Sermon et al., 1998; Skrzypczak-Zielinska et al., 2009]. Разработан оригинальный метод, в ходе которого количество повторов CTG и CGG при обнаружении миотонической дистрофии первого типа и синдрома ломкой хромосомы соответственно детектируется не с помощью разделения ампликонов гель-электрофорезом, а посредством циклической вольтамперометрии, с использованием эффекта электрохимического окисления входящего в состав данных повторов гуанина Ru(bpy)33+ (bpy = 2,2’-дипиридил), при этом обнаруживается прямая корреляция с их числом, причем продукты ПЦР иммобилизованы на поверхности индий-оловянных электродов [Yang, Throp, 2001]. Не определение точного числа копий повторов, а наличие генетических условий возникновения миотонической дистрофии ставили перед собой авторы, предложившие вариант трехпраймерной ПЦР с праймерами обозначенными как P1, P3[1] и P4, где специфичность амплификации нужного участка генома достигается использованием одного из праймеров (Р1), отжигающемся на фланкирующей повторы последовательности гена DMPK, второй быстро истощающийся праймер (Р3 - берущийся к остальным в соотношении 1:10) основной своей частью комплементарный анализируемым триплетам, а на комплементарной последовательности второй части данного праймера через цикл будет отжигаться праймер P4 [Warner et al., 1996]. Таким образом, в результате такой амплификации, получивший название триплетной ПЦР (т-ПЦР) формируется набор ампликонов разной протяженности, неперекрывающих полностью весь участок повторов, а только позволяющий экспериментатору оценить, что их довольно много и следовательно есть основания для заключения о наличии миотонической дистрофии на генетическом уровне. В дальнейшем рядом авторов произведены некоторые улучшения данного метода как для обнаружения экспансии CTG-повторов [Falk et al., 2006; Kakourou et al., 2010], так и для CCTG-повторов [Catalli et al., 2010; Radvansky et al., 2011] и в последнем случае метод получил название тетраплетной ПЦР. Недавно для обнаружения на генетическом уровне одновременно МД1 или МД2 предложено проводить т-ПЦР (триплетную и тетраплетную) как мультиплексную [Radvansky et al., 2011a]. Помимо экспансии повторов у больных обеими типами миотонической дистрофией подобный подход с т-ПЦР использован и для детекции увеличивающегося числа GAA-повторов у больных атаксией Фридриха [Ciotti et al., 2004]. С учетом невозможности с помощью метода т-ПЦР определить истинное число копий простых повторов у больных миотонической дистрофией стандартной процедурой определения сильно увеличенного числа CTG повторов до сих пор служит очень длительная и весьма трудоемкая блот-гибридизация по Саузерну, не требующая этапа амплификации с помощью ПЦР [Mahadevan et al., 1992; Harley et al., 1993; Gennarelli et al., 1998; Carson, 2009]. Серьезным недостатком метода, помимо длительности и сложности процедуры, является требуемое довольно большое количество анализируемой ДНК, подвергаемой расщеплению подходящими рестрикционными эндонуклеазами - обычно расщепляющими гексануклеотидные участки узнавания. Использование для лучшего разделения фрагментов ДНК, несущих в своем составе CCTG-повторы, при диагностике МД2 пульсирующего гель-электрофореза дало заметный эффект [Jakubiczka et al., 2004]. Определенного улучшения диагностической процедуры в виде уменьшения длины разделяемых фрагментов ДНК удалось достичь благодаря использованию для расщепления ферментов, узнающих встречающиеся гораздо чаще в ДНК тетрануклеотидные участки узнавания, при обнаружении ДМ1 [Erginel-Unaltuna, Akbas, 2004] и ДМ1 и ДМ2 [Nakamori et al., 2009]. В последней работе авторы, в том числе, прибегли к амплификации по типу катящегося кольца участка с CTG-повторами для наработки нужного количества продукта для его расщепления подходящей рестрикционной эндонуклеазой для последующей блот-гибридизации по Саузерну. Заслуживает некоторого внимания и другой метод выявления количества простых повторов, названный Repeat Expansion Detection - RED [Schalling et al., 1993; Jarjanazi, Ozcelik, 2002], заключающийся в многократно повторяющейся (до 400 - 600 циклов) процедуре лигирования термостабильной ДНК лигазой олигонуклеотидов, представляющих собой обычно 24 звена (8 повторов по 3 нуклеотида), даже с учетом предложенных авторами различных его усовершенствований, также имеет следующие недостатки: низкое количество продукта реакции, необходимость использования в реакции большого количества геномной ДНК, при том что зачастую образцы тканей, берущихся для анализа бывают очень малы по объему и содержат крайне мало генетического материала, особенно при пренатальной диагностике. Несмотря на существование разнообразных методов и их модификаций в современных диагностических исследованиях по-прежнему используется трудоемкий и длительный метод блот-гибридизацией по Саузерну [Kim et al., 2008; Carson, 2009; Radvansky et al., 2010], в связи с чем следует признать, что в настоящее время нет хорошего и удобного способа уверенной и быстрой оценки числа копий CTG- и CCTG-повторов, которые крайне необходимы для современной ДНК-диагностики нейрогенеративных заболеваний.
Заказ
Оформите заказ, наш сотрудник свяжется с вами для уточнения деталей.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз

Обратный звонок
Представьтесь, мы вам перезвоним.
Ваша заявка успешно отправлена!
Необходимо принять условия соглашения
Вы заполнили не все обязательные поля
Произошла ошибка, попробуйте ещё раз