Том 12, № 4

Представлены основные проблемы, возникающие в процессе диагностики новой коронавирусной инфекции при использовании ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ‑ПЦР). Основной акцент сделан на анализе причин как истинных ложноотрицательных результатов диагностики, так и «ложноотрицательных» результатов, обусловленных издержками преаналитической стадии и/или неверной интерпретацией получаемых данных. Приведены оценки вирусной нагрузки у человека и высказаны предположения относительно ожидаемого количества вирусных частиц в исследуемых рото- и носоглоточных образцах. Дана сравнительная характеристика и оценка аналитической чувствительности разрешенных к применению в Российской Федерации диагностических тест-систем для выявления SARS-CoV-2, основанных на ОТ-ПЦР. Обсуждаются различные технологические подходы к конструированию тест-систем для снижения вероятности ложноотрицательных реакций, в частности, основывающиеся на одновременной детекции нескольких геномных мишеней коронавируса, применении зондов с одинаковыми флуорохромами для усиления сигнала и исключении ложноотрицательных результатов, связанных с мутациями в сайтах отжига праймеров и гибридизационных зондов.

Самым простым и наиболее распространенным способом длительного хранения образцов ДНК в настоящее время является хранение их замороженных растворов, имеющий, однако, ряд недостатков, среди которых разрушение молекул ДНК при их замораживании и оттаивании, а также расход электроэнергии и вероятность потери ценных образцов в случае возможных аварий. В этой связи предпочтительным является долговременное хранения образцов ДНК при комнатной температуре в высушенном состоянии, тем более, что намечается еще больший рост числа хранимых образцов ДНК в связи с планируемым сохранением в этой молекуле небиологических данных, о чем на Международном экономическом форуме 2019 г. заявлено в числе 10 важнейших инновационных технологий человечества в ближайшем будущем. При этом требуется исключение гидролиза и окисления молекул ДНК под действием воды и активных форм кислорода, что возможно достичь, помещая ДНК в инертную безводную атмосферу, в том числе в присутствии дополнительных ингредиентов в виде, например трегалозы, имитируя живую Природу, поскольку известно, что этот простой дисахарид, способный к стеклованию, защищает от неблагоприятных условий окружающей среды широкий круг организмов – ангидробионтов. В настоящее время существует ряд технологий, обеспечивающих долговременное хранение ДНК при комнатной температуре, в том числе доступных из коммерческих источников, но не все проблемы еще решены, что нашло свое отражение в данной обзорной статье.

Гены экспансинов растений представляют большой интерес для генной инженерии, так как могут быть использованы для улучшения ростовых параметров корней сельскохозяйственных растений. Ранее нами были получены трансгенные растения табака Nicotiana tabacum, экспрессирующие ген экспансина PnEXPA3 из тополя черного Populus nigra. В данной работе был изучен прирост корней трансгенных растений в нормальных условиях и при действии стрессовых факторов, таких как гипотермия, засоление и тяжелые металлы. Конститутивная экспрессия гена PnEXPA3 способствовала улучшению роста корней трансгенных растений табака по сравнению с диким типом при нормальных условиях и при действии гипотермии (+10°С), при засолении (50 и 100 мМ NaCl) и при действии тяжелых металлов (200 и 400 мкМ ацетата кадмия). Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что конститутивная экспрессия гена PnEXPA3 может быть использована для улучшения роста корней культурных растений, как при нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов.

Определена нуклеотидная последовательность хлоропластного генома диплоидной пшеницы Triticum sinskajae A.Filat. et Kurk. размером 136885 п.н. Проведенное сравнение собранного генома пшеницы Синской с хлоропластными геномами некоторых ди- и полиплоидных видов пшенично-эгилопсного альянса выявило высокую эволюционную консервативность и близость к пластидному геному T.monococcum, тогда как другая диплоидная пшеница T.urartu несколько удалена от них. Выравнивание нуклеотидных последовательностей полных хлоропластных геномов диплоидных пшениц с таковыми диплоидных эгилопсов из секций Sitopsis и Vertebrata, а также с тетра- и гексаплоидными пшеницами из рядов turgidum-aestivum и timopheevii позволило установить, что материнскими формами при их образовании послужили разные эгилопсы из подсекции Truncata, близкие к нынешнему Aegilops speltoides, но не он сам.

Одним из эффективных подходов для улучшения питательной ценности зерна сорго является получение мутантов с частично или полностью блокированным синтезом или измененным аминокислотным составом запасных белков – кафиринов. Использование метода геномного редактирования позволяет решить эту проблему путем внесения мутаций в нуклеотидные последовательности генов α- и γ-кафиринов (k1C5 и gKAF1). Другим важным направлением в генетике и селекции сельскохозяйственных растений является разработка и использование технологий апомиксиса для фиксации гетерозиса у гибридов F1. Ген DYAD арабидопсиса и его гомолог ameiotic 1 - это потенциальные гены-кандидаты апомиксиса, вовлеченные в нормальное протекание мейоза, индукция мутаций в которых является одним из путей для решения данной проблемы. В ходе исследований осуществлен подбор геномных мишеней (последовательности 20 п.н.) для введения мутаций в гены α- и γ-кафиринов сорго и гена ameiotic 1 посредством технологии геномного редактирования CRISPR/Cas. Дизайн гидовых РНК выполнен с использованием биоинформатических программ CRISPROR и CHOPCHOP. Клонирование мишеней α- и γ-кафиринов сорго и ameiotic 1 в вектор pBAtC осуществляли по сайтам AarI. Валидацию успешности клонирования мишеней выполняли секвенированием ДНК. Генно-инженерные конструкции были перенесены посредством электропорации в агробактериальный штамм AGL0. В настоящее время созданные вектора используются для агробактериальной трансформации растений сорго.

Геном-редактирующие стратегии появились недавно как многообещающие инструменты для придания желаемых свойств многим эукариотическим видам, включая растения. Эта технология CRISPR/Cas9 может быть использована для инжиниринга устойчивости растений к узкому или широкому кругу патогенов, репродуктивных особенностей развития и других свойств растений. Известно, что EDS1 белок арабидопсиса контролирует активацию защиты и программируемую клеточную смерть, обусловленную межклеточными Toll-подобными иммунными рецепторами, которые узнают специфические эффекторы патогена. К сожалению, вовлеченность EDS1 белка в антифитовирусный иммунитет растений картофеля не изучена. Особое место в системе полового и бесполосеменного размножения принадлежит мейозу. Ключевые гены мейоза, и прежде всего ген DYAD / SWI1 является потенциальным кандидатом в поиске генов апомиксиса. На основе плазмиды pBAtC рестриктазно-лигазным методом были получены бинарные вектора. Так, созданы три экспрессионных вектора (p01, p03 и p04) для редактирования локуса EDS1. Два экспрессионных вектора (рII-25 и рVIII-29) были созданы для введения мутаций во втором и восьмом экзонах гена DYAD/ SWI1 арабидопсиса. Во всех случаях наличие клонированных вставок подтверждено секвенированием ДНК. Созданные вектора p01, p03, p04 под промотором pAtU6-6 арабидопсиса и полученный прежде вектор p13 под промотором pStU6 картофеля уже используются в работе по биобаллистической трансформации растений картофеля in vitro.

Арил-гидрокарбоновый рецептор (Aryl hydrocarbon receptor, AHR), является важным лиганд-зависимым транскрипционным фактором, сохранившим в процессе эволюции свои структурные и функциональные особенности. Гены-мишени AHR играют ключевую роль в детоксикации, в регуляции процессов развития и поддержания гомеостаза эукариот. Высокий консерватизм AHR человека позволил нам исследовать его функции in vivo, используя особей Drosophila melanogaster, трансформированных человеческим геном AHR. В отличие от гомолога AHR дрозофилы, не способного активироваться под влиянием экзогенных лигандов, AHR человека можно тканеспецифически активировать в организме трансгенной мухи. Это позволяет анализировать уровень транскрипции генов-мишеней AHR в различных органах и тканях. Результаты наших экспериментов неожиданно показали способность экзогенных лигандов-агонистов не только повышать, но и понижать уровень транскрипции целевых генов AHR. Мы предположили, что отсутствие ожидаемого увеличения транскрипции некоторых генов-мишеней AHR вызвано эпигенетическим сайленсингом. Данная гипотеза была подтверждена в экспериментах с использованием ингибиторов гистоновой лизин-N-метилтрасферазы и на дрозофилах с нулевой мутацией гена Polycomb. В результате был открыт новый механизм эпигенетического контроля экспрессии генов-мишеней AHR. Это открытие служит основанием для коррекции существующих концепций о механизме активации целевых генов AHR, большинство из которых является онкогенами.

Биохимические механизмы инсектицидной резистентности у насекомых заключаются в активации основных ферментов детоксикации - монооксигеназ, неспецифических эстераз и глутатион-S-трансфераз. К настоящему времени в отношении отдельных инсектицидов изучена динамика развития резистентности и степень вовлечения детоксицирующих ферментов в ее формирование у насекомых. В данной работе была определена активность монооксигеназ, неспецифической эстеразы, глутатион-S-трансферазы и щелочной фосфатазы у самок и самцов комнатной мухи Musca domestica во втором, четвертом, шестом, восьмом и десятом поколениях в ходе селекции хлорфенапиром. Контроль чувствительности имаго M. domestica к инсектициду-селектанту показал, что к десятому поколению у опытной линии сформировалась толерантность к хлорфенапиру (показатель резистентности составил 3,6). В ходе исследования в отдельных поколениях хлорфенапир-селектированной линии M. domestica было выявлено статистически значимое повышение удельной активности монооксигеназ у самок и самцов в 1,4 - 2,1 раза и повышение удельной активности щелочной фосфатазы у самок в 2,3 - 2,7 раза в сравнении с особями контрольной линии. Статистически значимых различий в активности глутатион-S-трансферазы между контрольной и опытной линией выявлено не было. У имаго M. domestica хлорфенапир-селектированной линии были обнаружены статистически значимые отличия по полу в активности монооксигеназ, неспецифических эстераз и щелочной фосфатазы, позволившие предположить, что механизмы и скорость формирования резистентности у самок и самцов к хлорфенапиру могут отличаться.

Стероидный гормон 20-гидроксиэкдизон (20E) инициирует у насекомых запуск личиночных линек, процессы метаморфоза, регулирует репродукцию. Основным рецептором 20Е служит гетеродимер, состоящий из белков EcR и USP. Кодирующий экдизоновый рецептор ген EcR является ключевым элементом регуляции генных сетей, включающих в себя значительную часть генов, отвечающих за рост и развитие, а также воспроизводство потомства и реакцию организма на неблагоприятные факторы окружающей среды. Источник метильных групп S-аденозилметионин (SAM) используется в процессе синтеза ювенильного гормона (JH), метилировании гистоновых белков и ДНК. Основной целью исследования было определение транскрипционной активности гена рецептора экдизона EcR комнатной мухи Musca domestica L. при включении в пищевой рацион нелетальных доз 20E и SAM. Эксперименты проводились на личинках и имаго лабораторных линий комнатной мухи Shgen и Lgen с различной продолжительностью жизни имаго. Изменения в содержании транскриптов гена EcR в общем пуле мРНК клеток мышечной ткани и гонад, а также уровень метилирования ДНК в его 5’-концевом участке регистрировались с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Проведенные нами исследования позволяют предположить наличие механизма регуляции экспрессии гена EcR у M. domestica, чувствительного к воздействию экзогенного 20E и теплового стресса (ТС), а также к присутствию в пище SAM. Вариации в количественных соотношениях 5’-и 3’-концевых областей мРНК гена EcR M. domestica в зависимости от типа тканей, пола и возраста свидетельствуют в пользу гипотезы о возможности кодирования этим геном нескольких изоформ белка EcR. Обнаруженные изменения в статусе метилирования ДНК в 5'-концевой области гена и колебания в представленности различных участков мРНК после обработки SAM позволяют предполагать вовлеченность процессов метилирования/деметилирования ДНК в регуляцию экспрессии гена EcR M. domestica.

Целью нашего исследования было выявление зависимости накопления фенольных соединений (растворимые фенольные соединения и дубильные вещества) и аскорбиновой кислоты в разных части трех лекарственных растений: Bidens tripartita, Urtica dioica и Chenopodium album с учетом места произрастания. Растения были собраны в трех районах Татарстана (Высокогорский, Лаишевский и Спасский район). Результаты показали, что накопление данных веществ в исследуемых растениях различается в разных частях растений в зависимости от места произрастания. Вид B. tripartita наиболее богат изучаемыми веществами. Высокогорский район и Спасский район оказались районами с наилучшим растительным сырьем.

Амплификация нуклеиновых кислот является одним из ключевых методов в молекулярно-биологических исследованиях и клинической диагностике. Отличная альтернатива широко распространенной полимеразой цепной реакции - изотермические методы, например, амплификация «катящимся кольцом». Для выполнения амплификации в изотермических условиях применяют ДНК полимеразы с цепь-вытесняющей активностью. В данной работе изучено влияние температуры на образование специфических и неспецифических продуктов в амплификации «катящимся кольцом» ДНК полимеразами 9°Nm, Vent exo-, Hemo KlenTaq. Определены значения температуры, при которых наиболее эффективно происходит образование неспецифических мультимерных продуктов на линейной матрице и целевых конкатемерных продуктов на кольцевой матрице. Полученные результаты позволят разработать более специфичные методы изотермической амплификации с указанными ДНК полимеразами.

Статины – это группа гиполипидемических препаратов, используемых для лечения гиперхолестеринемии. Однако, при применении статинов возможно развитие нежелательных лекарственных реакций, таких как бессимптомное повышение трансаминазной активности; боли в животе; запоры; миалгии и миопатии, вплоть до самого тяжелого проявление – рабдомиолиза. Частота встречаемости развития миалгий и миопатий при применении статинов составляет от 2–3 % до 10–25 %. Вариабельность фармакологического ответа зависит от полиморфных вариантов генов, продукты которых ответственны за фармакокинетические и фармакодинамические процессы. В Республиканском медико-генетическом центре было проведено ДНК-тестирование пациентов, использующих статины или планирующих их прием на определение полиморфного варианта SLCO1B1*5 (c.521T>C, rs4149056) гена SLCO1B1. Были исследованы образцы ДНК 42 пациентов, в возрасте 6-73 лет, использующих статины или планирующих их прием. В результате ДНК-тестирования гомозиготный по «дикому» аллелю T вариант гена SLCO1B1 выявлен у 28 (66,66%) обратившихся лиц. При генотипе ТТ у пациента низкий риск развития поражения печени и поперечно-полосатой мускулатуры, при этом следует не превышать предельно допустимую дозировку препаратов. Гетерозиготный генотип ТС гена SLCO1B1, способствующий выработке белка со сниженной активностью и повышению содержания статинов в крови, обнаружен у 9 (21,43%) пациентов. При гетерозиготном носительстве (ТС) можно сделать заключение о наличии высокого риска развития поражения печени и поперечно-полосатой мускулатуры при стандартном дозировании статинов. Предельно допустимую дозу препаратов снижают. Гомозиготный вариант гена SLCO1B1 (генотип СС), приводящий к значительному повышению уровня статинов в крови, отмечался у 4 (9,52%) человек. У носителей генотипа СС риск развития миопатий достигает 60%, поэтому и доза статинов, должна быть минимальной. Результаты исследования говорят о необходимости использования фармакологического ДНК тестирования в клинической практике.

Проведено молекулярно-генетическое исследование незавершенного остеогенеза в 103 отягощенных семьях. Идентифицированы 9 типов патогененных мутаций у 12 пациентов в генах COL1A1, COL1A2 и IFITM5: 2 дупликации, 1 делеция, 2 нонсенс, 3 миссенс, 1 – сдвиг рамки считывания.

Инфаркт миокарда (ИМ) – многофакторное полигенное заболевание, развитие которого обусловлено сложным взаимодействием множества средовых и генетических факторов. В настоящем исследовании в этнически однородной группе проведён анализ ассоциаций с ИМ полиморфных маркеров rs1042034 (ген APOB), rs4420638 (ген APOC1) rs2070424 (ген SOD1) и rs662 (ген PON1). Материалом для анализа послужили 365 образцов ДНК больных мужчин, перенёсших ИМ в возрасте от 30 до 60 лет, и 292 практически здоровых мужчин соответствующей контрольной группы. В результате исследования выявлены маркеры повышенного риска ИМ: SOD1*A/A, для мужчин до 46 лет (P=0.029, OR=1.96), APOC1*A/G (P=0.03, OR=2.01), для мужчин старше 48 лет, и APOB*C/C (P=0.031OR=1.8).

Кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin) является альтернативным гевее бразильской источником высококачественного натурального каучука, который способен произрастать в условиях умеренного климата. Однако полевое выращивание кок-сагыза сопряжено с рядом проблем, таких как необходимость в стратификации семян, очень чувствительные к внешнему воздействию проростки, трудоемкость в борьбе с сорняками и вредителями, неравномерность созревания семян, отсутствие специальной техники для посева, сбора корней и семян. В связи с этим, перспективным представляется использование волосовидных (бородатых) корней кок-сагыза в качестве сырья для получения натурального каучука. Целью нашей работы было получение культур волосовидных корней кок-сагыза и определение в них содержания натурального каучука гексановым методом. В ходе работы было получено 10 линий волосовидных корней кок-сагыза, способных к росту в изолированных культурах. Было показано, что эти волосовидные корни накапливают в среднем 7,5% гексанового экстракта (каучукоподобных веществ) на сухую массу, что примерно в 1,5 раза больше, чем корни кок-сагыза, выращенные в полевых условиях. Полученные нами данные говорят о перспективности использования волосовидных корней кок-сагыза для промышленного получения натурального каучука.

Для разработки эффективных и экологически-безопасных методов защиты культурных растений от насекомых-вредителей необходимо знание структуры гидролаз фитофагов и механизмов их взаимодействия с ингибиторами растений. Целью данной работы являлось компьютерное моделирование пространственной структуры альфа-амилазы колорадского жука, анализ влияния выявленных особенностей структуры на взаимодействие с белковыми ингибиторами, а также моделирование взаимодействия с ингибиторами амилаз из различных организмов. Методом компьютерного моделирования с использованием сервисов IntFOLD и NOMAD-Ref построена пространственная структура альфа-амилазы колорадского жука. Выявлено, что амилаза колорадского жука имеет отличия в структуре и физико-химических свойствах активного центра по сравнению с амилазой мучного хрущака, но не отличается в ходе главной цепи. Показано возможное влияние данных отличий на взаимодействие фермента с растительными ингибиторами – лектиноподобным ингибитором фасоли и ингибитором семейства RATI. С использованием сервиса CABS-dock проведено моделирование взаимодействия амилазы колорадского жука с полипептидными ингибиторами амилаз из различных видов растений, бактерий и актиномицет. Среди полученных структур наилучшими значениями свободной энергии комплекса обладали ноттиноподобный ингибитор амаранта и пуротиониноподобный ингибитор овса, наименее благоприятным является связывание амилазы колорадского жука с ингибиторами актинобактерии Thermopolyspora flexuosa и водного растения Alternanthera sessilis. Модельная структура ноттиноподобного ингибитора в комплексе с амилазой колорадского жука, в сравнении с известной структурой комплекса с амилазой мучного хрущака, имеет сходную укладку цепи, но значительно отличающуюся конформацию. Полученные в ходе исследования данные могут быть использованы для поиска новых эффективных ингибиторов амилаз колорадского жука и разработки экологически-безопасных способов защиты картофеля от насекомых-вредителей, в том числе с использованием генетической трансформации растений.

Долголетие – сложный социально-биологический феномен, при котором человек достигает возраста, значительно превышающего средний популяционный показатель. Вероятность достижения долголетия зависит от совокупности экзогенных и эндогенных факторов. На молекулярно-генетическом уровне характер их взаимодействия определяют гены ферментов метаболизма кислорода и ксенобиотиков, выполняющих функцию защиты организма от токсичных действий внешних агентов. Одним из таких генов является ген параоксоназы 1. Аллели полиморфного маркера rs662 (192Q>R) гена PON1 ассоциированы с активностью фермента и развитием сложно-наследуемых заболеваний, ограничивающих продолжительность жизни. С целью поиска ассоциаций полиморфного маркера rs662 гена PON1 с долголетием в этнической группе башкир проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов в разных возрастных группах; в общей группе выполнен поиск возрастной динамики частот генотипов с помощью регрессионного анализа. В этнической группе башкир аллели PON1*Q, PON1*R и генотипы PON1*Q/Q, PON1*Q/R, PON1*R/R обнаружены с частотами 69.96, 30.04, 48.7, 42.51, 5.76% соответственно. Полиморфный маркер rs662 гена PON1 оказался ассоциирован с возрастом: шанс достичь долголетия выше у носителей гетерозиготного генотипа PON1*Q/R (55-100 лет, OR=1.022, P=0.043).

В 2020 году исполнилось 100 лет термину «геном», предложенному немецким ботаником Г.Винклером при описании партеногенеза в растительном и животном царствах. Этимология данного слова неясна, но нам представляется, что Винклер использовал игру слов, соединив морфемы «ген», «сома» и получив “genosom” (нем.), после чего решил удалить один слог, что и привело к краткому и емкому слову «геном», объединяющему гены и составляющем для них нечто целое, что также совпало с окончаниями «–ом» отдельных биологических терминов, обозначающих некое множество (в данном случае для генома – генов). Первоначально под геномом подразумевался гаплоидный набор хромосом, и таким образом хромосомы служили элементарной единицей генома. Сейчас же с появлением возможности секвенировать полный геном его элементарной единицей стала пара нуклеотидов, но и хромосомы оказались задействованными, поскольку нуклеотидные последовательности распределяются в базах данных по хромосомам, когда такое по результатам полногеномного секвенирования становится возможным. На протяжении столетия менялись взгляды ученых, что считать геномом, подразумевая под этим его гаплоидную или диплоидную природу. Сейчас принято считать, что геном - это нуклеотидные последовательности всей совокупности генов и прочих участков ДНК гаплоидного набора хромосом конкретного вида организмов, однако и габитус и функциональное состояние каждого организма определяется его полным диплоидным геномом, тогда как при сборке гаплоидного генома a priori происходит игнорирование тех или иных азотистых оснований в отличающихся аллелях, поскольку выбирается лишь один какой-то нуклеотид, что сразу снижает ценность такого генома, которая все равно очень высока, поскольку секвенирование полных гаплоидных геномов уже очень большого числа видов организмов различного уровня генетической сложности дало весьма важную информацию о Живом. Тем не менее, для персонифицированной медицины будущего нужны знания об исключительно диплоидных геномах людей, получение которых пока представляет серьезную проблему, в отличие от нынешних квази-гаплоидных геномов, которые секвенируются почти массово. Диплоидные геномы растений также представляют интерес, в том числе для CRISPR/Cas геномного редактирования, когда необходимо произвести изменения в обоих аллелях парных хромосом, и для этого знать их возможно отличающиеся нуклеотидные последовательности крайне необходимо. Равно как и по завершении такого редактирования следует с помощью полногеномного диплоидного секвенирования выявить произведенные целевые и нецелевые мутации. Разрабатываемые подходы полногеномного секвенирования, в том числе протяженных участков ДНК вкупе с компьютерными программами, рассчитанными на фазировку данных, недавно вызвали к жизни новый термин «гаплотиг», представляющий собой гаплотип-специфичный контиг. Вне всякого сомнения, все это позволит со временем перейти к уверенному установлению полных диплоидных геномов, что придаст термину «геном» новый смысл, считая его для эукариотических организмов диплоидным, что будет к тому же отражать и саму сущность организации генома, имеющего в норме двуродительскую природу.