Том 12, № 2

Микрогаплотипы, несущие некоторое количество однонуклеотидных замен, являются новым типом маркеров в криминалистических исследованиях для ДНК-идентификации личности, требующие при этом сопоставления данных по обеим парным хромосомам, что правильнее считать микродиплотипным анализом. При этом однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) наиболее часто встречается в геномах людей. Основным методом выявления ОНП в микрогаплотипах (микродиплотипах) является массовое параллельное секвенирование. По сравнению с отдельными ОНП продемонстрирована их более высокая дискриминирующая способность внутри микрогаплотипов с учетом их цис/транс положений для семейного и предкового анализов, а также при анализе смешанных биологических образцов, что крайне востребовано в ДНК-идентификации личности. Показана эволюция используемых в ДНК- идентификации личности микрогаплотипов в виде уменьшения их размеров с одновременным увеличением количества ОНП в них. Приведен ряд подобранных микрогаплотипов, включающих как би-, так и три- и тетрааллельные ОНП, фланкированные участками генома, в которых пока не выявлены полиморфные нуклеотиды и которые могут служить местами отжига праймеров.

Дана краткая информация о численности лошадей в мире, в том числе в России, а также в Республике Башкортостан, при этом определенный акцент сделан на башкирской породе лошадей, создававшейся методом народной селекции на протяжении нескольких столетий. Показано эволюционное развитие методов детекции полиморфизма ДНК лошадей и проведены параллели с подобными подходами, используемыми в криминалистических исследованиях при ДНК-идентификации личности. Значительное внимание уделено микросателлитным повторам, служащим на протяжении уже почти трех десятилетий маркерными признаками при анализе пород, популяций и отдельных особей лошадей, для чего созданы специальные тест-системы на основе 17 динуклеотидных микросателлитных локусов. Приведены сведения о референсном ядерном геноме лошади EquCab3.0, включая позже секвенированную Y-хромосому, а также о митохондриальном геноме. Созданы специальные высокопроизводительные ДНК-чипы, позволяющие вести одновременный анализ до двух миллионов снипов, которых для лошадей выявлено уже более 20 миллионов. Отмечено, что методы, ранее разработанные для исследования полиморфизма ДНК человека, через некоторое время обязательно начинают применяться для других объектов, включая сельскохозяйственных животных. Так, заслуживает внимания ДНК-паспортизация отдельных племенных лошадей, которая может проводиться разными способами, обеспечивая, в том числе, возможность генетического штрих-кодирования и высокий уровень ДНК-цифровизации. Высказана мысль о применимости к лошадям ряда подходов, предложенных для ДНК-регистрации людей. Отмечено, что крайне важно для сохранения уникальной местной породы лошадей, являющейся брендом Республики Башкортостан, определение полного генома башкирской лошади, и представитель породы должен для этого быть отобран после тщательного высокопроизводительного анализа многих снипов башкирской лошади, а также якутской и казахской лошадей, с помощью которых велось восстановление башкирской породы. Помимо ядерного генома, необходимо секвенирование нескольких митохондриальных геномов внутрипородных типов башкирской лошади.

Данный обзор посвящен бетакоронавирусу SARS-CoV-2, вызвавшему весной 2020 г. пандемию в виде опасной высококонтагиозной коронавирусной инфекции COVID-19. Отмечен взрывной рост в 2020 г. по всему миру числа публикаций, связанных с коронавирусом, включая вопросы молекулярно-биологической детекции вирусной ДНК и создания вакцин. Кратко приведена таксономия бетакоронавирусов и организация их генома, представленного (+)‑цепью РНК, включая более подробную информацию о поверхностном гликопротеине в виде S (Spike) белка. Описан гипотетический жизненный цикл бетакоронавируса. Показано, что наряду с высокой консервативностью геномных последовательностей различных штаммов и изолятов SARS-CoV-2, имеются мутации отдельных нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот в белковой последовательности, среди которых миссенс-мутация D614G предположительно оказывает заметное влияние на контагиозность вируса и тяжесть течения вызываемого им заболевания. Высказана мысль о необходимости детекции D/G614 изолятов, в том числе с использованием аллель-специфичной обратно-транскрипционной ПЦР, поскольку это может оказаться клинически значимой информацией. Рассмотрены способы выявления вирусного материала с помощью обратно-транскрипционной ПЦР и прочих методов амплификации нуклеиновых кислот, а также указаны разрешенные к применению в Российской Федерации диагностические тест-системы на SARS-CoV-2. Приведена краткая информация по типам вакцин, разрабатываемых для борьбы с COVID-19 по всему миру, включая Российскую Федерацию. По состоянию на конец мая 2020 г. Всемирной организацией здравоохранения зарегистрирована 131 кандидатная вакцина, из которых с 10 проводятся клинические испытания. Определенный акцент при описании создания вакцин сделан на использовании растительных технологий.

Исследования экологически чистых биологических способов стимуляции роста мицелия лекарственных и съедобных грибов способствуют развитию научных основ и улучшению технологии выращивания. В данной работе поставлена цель охарактеризовать эффект бактерий рода Azospirillum, известных своими фитостимулирующими свойствами, в отношении ростовых показателей ксилотрофного базидиомицета Flammulina velutipes в условиях двойных бактериально-грибных культур. Выявлена возможность и подобраны условия совместного погруженного культивирования зимнего гриба F. velutipes с эндофитным и эпифитным штаммами Azospirillum brasilense. Изучали ростовые показатели ко-культур в зависимости от состава среды; характеристик инокулюма, штамма бактерий. В оптимизированных условиях жидких ко-культур азоспириллы изученных штаммов проявляли активную подвижность и находились в плотном контакте с гифами грибов. Концентрация клеток бактериальных штаммов при прочих равных условиях эксперимента оказывала существенное влияние на рост бинарных культур. Выращивание F. velutipes совместно с А. brasilense Sp245 при оптимальной концентрации бактериальных клеток в инокулюме позволило получить величину сухой биомассы 235% относительно контроля. Активному росту смешанной культуры грибов с изучаемыми штаммами азоспирилл благоприятствовала среда на основе Glc и Fru в массовом соотношении 1 : 1 и Asn. Полученные данные позволяют судить о высоком потенциале применения бинарных бактериально-грибных культур для эффективного получения мицелиальной биомассы базидиомицета.

В работе исследованы пять штаммов R. leguminosarum, выделенных из клубеньков растений гороха. Оценкой кинематической вязкости бесклеточных культуральных жидкостей был установлен штамм бактерий (V30), у которого данный показатель превосходил в несколько раз показатели вязкости среды роста бактерий остальных штаммов и соответствовал значению 30 мм2/с. При экстракции этанолом из культуральной жидкости бактерий R. leguminosarum V30 был получен студенистый, прозрачный осадок полисахаридов, который после высушивания формировал светлый порошок, растворимый в воде. Проведённые исследования позволили выделить новый штамм бактерий R. leguminosarum с высоким биотехнологическим потенциалом, рост которых на дешевом субстрате позволяет за 5-6 суток получить большой объем культуральной жидкости с высокой кинематической вязкостью. Экстракция ценного метаболита R. leguminosarum осуществляется простым способом и позволяет выделить до 5 г полисахаридного препарата из 1 л культуральной жидкости.

Изучено влияние состава питательной среды на продукцию фитогормона индолил-3-уксусной кислоты и каротина при культивировании эпифитного штамма Pantoea sp. IB-BF. Уровень ауксина и каротина в культуральной жидкости предложенных вариантов питательных сред варьировал от 2 до 21 мкг/мл и от 0,06 до 0,172 ОП461/мг сух. биомассы соответственно. Отмечен значительный эффект от присутствия белкового компонента (триптон, пептон или дрожжевой экстракт) на биосинтез ауксина. Секреция каротина существенно возрастала в условиях пониженного содержания азота и повышенного отношения C:N (картофельно-глюкозная среда). В присутствии 100 мкг/мл триптофана зафиксировано достоверное увеличение выхода ИУК на 18% по сравнению с уровнем ауксина на среде без триптофана. Синтез индолил-3-уксусной кислоты и каротина, успешная колонизация корней пшеницы штаммом Pantoea sp. IB-BF с увеличением численности более чем на 104, осуществлялись в условиях абиотической нагрузки, аналогичной присутствию хлорида натрия не менее 100 мкМ в среде.

Одуванчик короткорожковый Taraxacum brevicorniculatum, как и кок-сагыз Taraxacum kok-saghyz относится к перспективным каучуконосным видам одуванчиков. T. brevicorniculatum в отличие от кок-сагыза характеризуется более высокими темпами вегетативного роста, большей семенной продуктивностью, однако накапливает гораздо меньше натурального каучука в корнях. Целью нашей работы был химически индуцированный мутагенез T. brevicorniculatum при помощи азида натрия и определение содержания каучука в корнях полученных мутантных растений. Использование 1 мМ раствора азида натрия для обработки семян не оказало существенного эффекта на каучуконакопление в корнях и на рост листьев. Наиболее высокие параметры роста листьев были характерны для растений, полученных после обработки семян 10 мМ азида натрия, при этом были получены два растения с более высоким содержанием каучука в корнях, чем в контроле. При использовании 20 мМ азида натрия была достигнута полулетальная доза мутагена и получены наиболее высокие результаты по каучуконакоплению – более 5% на сухую массу корня, что более чем в два раза больше, чем у контрольных растений и близко к показателям кок-сагыза. Полученные в ходе работы мутантные формы одуванчика короткорожкового планируется использовать в дальнейшей селекции с целью выведения быстрорастущих и высокопродуктивных каучуконосных сортов этого вида.

Для нескольких видов растений проведен мультиплексный in silico RAPD-анализ их полных геномов, заметно различающихся своими размерами. Из семейства Крестоцветных исследованы три разновидности резуховидки Таля Arabidopsis thaliana, имеющие геном размером около 135 млн. пар нуклеотидов (п.н.). Из семейства Пасленовых проанализированы картофель Solanum tuberosum и томат S.lycopersicum с геномами 840 и 828 млн.п.н. соответственно. Из семейства Злаковых в анализ взяты два подвида риса Oryza sativa indica и O.sativa japonica (по 500 млн.п.н.), диплоидные пшеница Triticum urartu (5 млрд.п.н.) и эгилопс Aegilops tauschii (4,3 млрд.п.н.), а также тетраплоидные пшеницы T.turgidum и T.dicoccoides (оба вида имеют геномы около 12 млрд.п.н.) и гексаплоидная мягкая пшеница T.aestivum, имеющая геном размером около 17 млрд.п.н. Биоинформатический in silico анализ на наличие мест отжига в этих геномах комплекта декамерных праймеров проводился с помощью созданной нами ранее программы ABCDNA_GS. Особенностью праймеров, содержащих 40% G и C оснований, является их тринуклеотидный состав с полным отсутствием тиминов, способствующий исключению образования гомо- и гетеродимеров таких праймеров. Показано, что для растений с малыми размерами геномов (на примере семейства Крестоцветных) удовлетворительный уровень полиморфизма ДНК достигается при использовании в мультиплексном анализе комплекта из 12 праймеров, тогда как для крупных геномов вполне достаточно 6 таких праймеров. Предлагается модифицировать метод RAPD-анализа таким образом, что будут учитываться только короткие ампликоны, которые можно разделять капиллярным гель-электрофорезом и измерять их длины с точностью до нуклеотида. Выбранный диапазон разделения ампликонов от 51 до 500 нуклеотидов вмещает 450 воображаемых ДНК‑ячеек, которые обозначаются как ДНК[+]‑ячейка при наличии в ней фрагмента(ов) ДНК и ДНК[‑]‑ячейка при их отсутствии, что в двоичном счислении отображается как «1» и «0» соответственно. Приведены подсчеты количества возможных комбинаций при разной заполненности таких воображаемых ДНК‑ячеек, превышающих в ряде случаев гугол (10100). На основе полученных in silico результатов построены генетические штрих-коды, дающие возможность визуального наблюдения отличий проанализированных видов растений. Выявленные у разновидностей резуховидок и подвидов риса минорные различия позволяют прогнозировать применимость такого подхода к однозначной ДНК-паспортизации сортов растений. Причем данный подход может быть вполне применим и к породам животных, расам грибов и даже штаммам микроорганизмов, требуя лишь корректировки числа мультиплексных праймеров в зависимости от размеров геномов исследуемых видов. Помимо RAPD-анализа, для целей ДНК-паспортизации могут применяться и иные методы детекции полиморфизма ДНК, обеспечивающие точное установление размеров образующихся ампликонов. Биоинформатический анализ полных геномов исследуемых видов с помощью программы ABCDNA_GS может также служить в этих случаях для прогнозирования результатов и предварительного выбора комплектов мультиплексных праймеров. Отмечается, что подобная ДНК-паспортизация крайне важна для селекционных работ и аграрного производства.

Проблема биологизации земледелия и разработки биологических препаратов, на основе микроорганизмов, имеет важное значение в сельском хозяйстве. Биологические препараты рассматриваются как альтернатива химическим. Помимо непосредственной защиты растений от фитопатогенов биопрепараты повышают урожайность сельскохозяйственных культур и приводят к получению экологически чистой продукции. В данной работе изучено влияние лабораторного образца биопрепарата на основе Bacillus atrophaeus на агрономические характеристики картофеля в Астраханской области. В лабораторных исследованиях доказано наличие ростостимулирующей активности лабораторного образца по отношению к тест-растениям (стимуляция проростков кресс–салата в 1,5 раза, горчицы белой в 2 раза, редиса в 2,5 раза). В ходе полевых испытаний биопрепарата на картофеле сорта «Ильинский» установлено влияние лабораторного образца на всхожесть всходов (повышение на 20,0%), биометрические показатели культуры (увеличение высоты растений на 5,5%, количества листьев на 17,5%, побегов на 12,0%, клубней на 7,0%), а также повысилась урожайность (на 38,9%). Произошло изменение качественных и количественных показателей картофеля (увеличение массы клубней на 27,5%, снижение количества больных клубней на 100,0%). В целом использование биопрепарата на полях Астраханской области способствует получению экологически чистой и безопасной продукции.

Регенерация полноценных растений из морфогенных каллусов in vitro – неотъемлемая часть ряда биотехнологий. В качестве эксплантов для получения морфогенных каллусов у злаков особенно перспективны незрелые зародыши. Исследование посвящено выявлению цитофизиологических особенностей системы «незрелый зародыш in planta–морфогенный каллус in vitro» у яровой мягкой пшеницы. Результаты культивирования in vitro разновозрастных зародышей показали, что оптимальными для получения морфогенного каллуса являются незрелые зародыши в стадии начала органогенеза. В таких зародышах заложены примордии щитка и побега, представленные меристематическими клетками. Поступлению индуктора каллусообразования (ауксин 2,4-Д в оптимальной концентрации) благоприятствует отсутствие плотной стенки у этих клеток. Сформировавшиеся на индукционной среде in vitro морфогенные каллусы представлены преимущественно меристематическими клетками, объединенными в группы (меристематические очаги). Тем самым в каллусах создаются цитологические предпосылки для будущей реализации различных путей морфогенеза in vitro. Обсуждается вопрос о морфогенетической компетентности незрелых зародышей как эксплантов для получения морфогенных каллусов. Предложено незрелый зародыш in planta на стадии начала органогенеза и индуцированный in vitro морфогенный каллус рассматривать как единую систему для биотехнологических исследований хлебных злаков.